AMACR siRNA表达载体对前列腺癌PC 3细胞生物学特性的影响

目的 观察转染α-甲酰辅酶A消旋酶(AMACR)干涉载体后对前列腺癌PC-3细胞系生长状态的影响.方法 用脂质体将pSilencer/AMACR1转染前列腺癌PC-3细胞,通过细胞计数、MTT、软琼脂克隆形成实验检测细胞的增殖能力,流式细胞仪分析细胞周期,Annexin V-FITC检测细胞凋亡.结果 siRNA干涉载体瞬时转染PC-3前列腺癌细胞系后,36 h细胞增殖率开始明显下降,软琼脂集落形成减少,流式细胞分析示细胞周期阻滞在G0/G1期(88.6%),Annexin V-FITC法示早期凋亡细胞率68.3%.结论 利用RNA干涉技术抑制了前列腺癌PC-3细胞系的增生,可能会成为一种有效的前列腺癌基因治疗手段.     

短发卡状PTI-1(PC-3)基因特异性RNA干扰表达载体对PC-3细胞的体外效应

目的:通过基因克隆技术构建人前列腺癌PC-3细胞系PTI-1(PC-3)基因[prostate carcinoma tumor-inducing gene 1(PC-3)]的特异性短发卡shRNA(short-hairpin RNA)真核表达载体,采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,体外观察对PC-3细胞系PTI-1(PC-3)基因的沉默作用以及干扰后对PC-3细胞的体外效应. 方法:采用基因克隆技术,将合成的短发卡样特异性PTI-1(PC-3) RNA干扰寡核苷酸序列插入真核表达载体pEGFP/U6,构建PTI-1(PC-3)shRNA的真核表达载体,体外转染人前列腺癌PC-3细胞,48 h后观察细胞生物学变化;提取转染细胞总RNA及总蛋白,行RT-PCR以及Western blot观测胞内PTI-1(PC-3)mRNA及蛋白水平. 结果:①成功构建短发卡样PTI-1(PC-3) shRNA真核表达载体pEGFP/U6-mPs;②转染(脂质体法)PC-3细胞,48 h后细胞大部分死亡;③转染48 h后细胞内PTI-1(PC-3)mRNA水平下降;④转染48 h后下调胞内PTI-1(PC-3)蛋白水平. 结论:本实验成功构建的shRNA真核表达载体通过RNA干扰,能够干扰人前列腺癌PC-3细胞内PTI-1(PC-3)基因的表达,抑制PTI-1(PC-3)蛋白的表达,降低了由PTI-1蛋白可能发挥的"翻译失真性"作用,促进癌细胞的死亡,进一步揭示了PTI-1在前列腺癌发生、发展过程中的显性癌基因作用. 由于RNA干扰的特异性从而为临床上前列腺癌的基因治疗提供了新的可能的方法.     

NF-κB基因RNA干扰质粒的构建与鉴定

目的构建转录因子NF-κB的RNA干扰(RNAi)质粒,为研究NF-κB参与的细胞信号通路及以其为靶点的基因治疗提供稳定转染的RNAi质粒。方法设计针对NF-κB的shRNA特异性序列,应用基因重组技术克隆到pSilencer 1.0-U6表达载体,EcoRⅠ和ApaⅠ双酶切及DNA测序鉴定重组克隆;脂质体转染RNAi重组载体至前列腺癌细胞PC-3后,Western blot分析各组NF-κB蛋白表达水平。结果双酶切和DNA测序证实shRNA正确插入pSilencer 1.0-U6质粒;Western blot结果显示与空质粒对照组比较NF-κB转染组细胞NF-κB表达明显下调。结论成功构建人NF-κB基因RNAi质粒,为研究NF-κB参与的细胞信号通路提供了稳定转染细胞的干扰质粒,为靶向NF-κB的基因治疗提供了有力工具。     

共表达野生型p53及siRNA-mdm2质粒的构建及其在PC-3细胞中的表达

目的：构建可同时表达野生型p53 (wt-p53)及siRNA-mdm2的重组真核表达载体用于激素非依赖性前列腺癌的联合基因治疗。方法：利用亚克隆、T-A克隆和PCR技术合成并构建pcDNA3.1-p53、siRNA-mdm2、p53/siRNA-mdm2和siRNA-scramble重组质粒。脂质体法将上述重组质粒转染至PC-3细胞,半定量RT-PCR和Western blotting检测共表达质粒对mdm2和p53表达的影响,MTT法检测共表达质粒转染后PC-3细胞增殖活性。结果：克隆出wt-p53全长及带有U6启动子的siRNA-mdm2序列,经DNA测序证实序列正确,通过连接成功构建上述真核重组表达载体;转染细胞48 h后可见siRNA-mdm2组GFP明显表达; RT-PCR和Western blotting检测显示转染共表达质粒后PC-3细胞中 wt-p53表达增强,mdm2表达下调;MTT检测显示共表达质粒转染后PC-3细胞生长抑制率为40.4%。结论：成功构建p53与siRNA-mdm2共表达质粒,共表达质粒可抑制前列腺癌细胞PC-3的增殖。     

pSilencer4.1-cmv-TrkC质粒对前列腺癌细胞株PC3增殖的影响

[目的]通过pSilencer4.1-cmv-TrkC siRNA干涉质粒转染下调人前列腺癌细胞系PC3中酪氨酸激酶受体C(tyrosine lcinase C,TrkC)的表达,观察TrkC在前列腺癌细胞中的作用.[方法]根据TrkC基因序列设计并合成siRNA,构建质粒.用脂质体将pSilencer/TrkC和对照空载体pSilencer转染人前列腺癌细胞系PC3,通过Western blotting检测转染细胞的TrkC表达情况,绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测TrkC对细胞周期及凋亡的影响.[结果]成功利用脂质体转染PC3细胞后,Western blotting 鉴定结果显示:TrkC的表达水平显著降低,细胞生长曲线及流式细胞仪检测结果显示pSilencer4.1-cmv-TrkC脂质体转染的PC3细胞出现生长抑制及凋亡增加.[结论]下调TrkC表达可以抑制前列腺癌细胞PC3增殖,TrkC可能参与了前列腺癌的发生发展过程.     

CD147RNA干扰对前列腺癌PC-3细胞系生物学行为的影响

目的 研究针对CD147 RNA干扰对前列腺癌PC-3细胞系生物学行为的影响.方法 利用针对CD147 RNA干扰片段构建的表达载体转染PC-3细胞,获得稳定表达株.通过RT-PCR和Western blotting 鉴定后进行前列腺癌细胞侵袭力实验和动物实验.结果 RT-PCR和Western blotting结果表明干扰片段可以较好地封闭前列腺癌PC-3细胞CD147分子mRNA和蛋白表达水平;与转染空质粒组相比.CD147干扰组前列腺癌PC-3细胞侵袭力下降,荷瘤裸鼠成瘤力下降(P＜0.05),抑瘤率达32.82%.结论 KNA干扰封闭CD147基因能抑制前列腺癌细胞的侵袭力和成瘤力.有可能成为前列腺癌基因治疗的新途径.     

RNA干扰CD147稳定表达前列腺癌PC-3细胞株的建立

目的 为研究CD147分子在前列腺癌PC-3细胞中的生物学功能,通过RNA干扰(RNAi)技术建立稳定低表达CD147分子的前列腺癌PC-3细胞株.方法 利用脂质体2000将靶向CD147干扰质粒导入前列腺癌细胞中,干扰前列腺癌细胞中CD147分子的表达;有限稀释法获取单个细胞克隆,通过G418筛选出抗性克隆并利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术和Western-blot免疫印迹法分别从转录水平和蛋白水平进行鉴定.结果 与转染pSilencer-Scramble对照质粒比较,转染pSilencer-CD147干扰质粒明显抑制CD147基因和蛋白表达水平(P<0.05).结论 靶向CD147的干涉载体能有效沉默PC-3细胞中CD147基因和蛋白的表达,通过G418筛选建立出稳定细胞株,为进一步研究CD147的功能打下基础.     

PED/PEA-15在前列腺癌中的表达及对前列腺癌细胞凋亡的影响

目的 通过构建PED／PEA-15特异的siRNA载体-探讨PED／PEA-15对前列腺癌细胞（PC-3）凋亡的影响。方法 应用免疫组化SP法检测前列腺癌和正常前列腺组织中PED／PEA-15的表达；用RT-PL、R法检测PC-3细胞中PED／PEA-15的表达。体外合成PED／PEA-15特异性siRNA序列．并克降入真核表达载体psiRNA-hHlnco。以脂质体法转染psiRNA-PED／PEA-15至PC-3细胞中．以RT-PCR和Western blot法检测psiRNA-PEI）／PEA-15对PED／PEA-15表达的影响；用MTT和流式细胞术检测其对PC-3细胞凋亡的影响。结果 免疫组化和RT-PCR均显示PED／PEA-15在前列腺癌中高表达；正常前列腺组织没有或只有很弱的表达。酶切和DNA测序证实合成的siRNA基因序列正确，并已被准确克隆入psiRNA-hHlnco载体。psiRNA-PEI）PEA-15可特异性抑制PC-3细胞中PED/PEA-15的表达。转染psiRNA-PED／PEA-15的PC-3细胞凋亡显著增加（P＜0．05）。结论 PED／PEA-15可阻抑前列腺癌细胞凋亡。其表达对前列腺癌的发展有重要作用。     

survivin短发夹状RNA真核表达载体的构建及其对宫颈癌细胞survivin表达的影响

目的:构建survivin基因短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体,并观察其对宫颈癌细胞survivin 表达的抑制作用.方法:设计、合成2对survivin特异性微小片段RNA引物(s1、s2),退火连接后利用DNA重组技术,将其分别克隆入真核表达载体pSilencer 2.1-U6 neo,酶切、鉴定测序后,经脂质体转染宫颈癌HeLa细胞,G418筛选阳性克隆,半定量RT-PCR检测survivin mRNA表达,Western blot检测survivin蛋白表达.结果:成功构建了survivin shRNA真核表达载体pSilencer2.1-s1和pSilencer2.1-s2,G418筛选24 d后出现阳性克隆,转染pSilencer2.1-s1和pSilencer2.1-s2的HeLa细胞中,survivin表达呈现不同程度下调,pSilencer2.1-s2的干涉效果较好.结论:成功构建并筛选出干涉效果较好的survivin shRNA真核表达载体,为进一步研究其对宫颈癌细胞生物学行为的影响奠定了实验基础.     

RNAi沉默survivin基因表达对膀胱癌EJ细胞增殖的影响

目的 通过RNA干扰(RNAi)阻断EJ细胞中survivin基因的表达,研究survivin基因沉默后对细胞生长和细胞凋亡的影响.方法 将合成的DNA正义链及反义链变性、退火,形成的双链DNA与pSilencer2.0线性质粒以T4 DNA连接酶连接,重组质粒经酶切、DNA测序鉴定后,用脂质体法转染EJ细胞,通过RT-PCR、免疫印迹检测干扰效果.MTT法检测细胞生长的影响,流式细胞仪检测转染后EJ细胞的凋亡变化.结果 酶切及测序证实设计合成的DNA片段已正确插入载体.RT-PCR、免疫印迹检测实验表明:pSilencer2.0-SVV1、pSilencer2.0-SVV2重组载体均能有效地阻断EJ细胞中survivin基因的表达,使survivin基因在mRNA和蛋白水平上的表达明显下调(P<0.01),后者抑制效果更佳.转染后的EJ细胞生长速度明显变慢.转染pSilencer2.0-SVV2实验组细胞的凋亡增加了17.0%.结论 重组真核载体能有效抑制EJ细胞的survivin表达,抑制细胞的增殖,诱导细胞凋亡.