初发慢性髓系白血病bcr/abl融合基因转录子与临床关系的观察

目的　研究初发慢性髓系白血病bcr/abl融合基因转录子类型与临床关系。方法　使用RT PCR对 5 1例初发CML患者进行bcr/abl融合基因转录子检测。结果　b3a2型患者血小板数高于b2a2型患者 ,但b3a2型患者WBC数低于b2a2型患者 (P <0 .0 5 ) ;血红蛋白浓度与b2a2型患者比较无差异 (P >0 .0 5 ) ;b3a2型和b2a2型患者比较AKP和Ph1染色体比例无差异 (P >0 .0 5 ) ;M bcr/abl阳性患者伴m bcr/abl阳性率为 47 0 % ,其中b3a2型患者有m bcr/abl融合基因转录子 14例 ,b2a2型患者有 10例。结论　b3a2型CML患者初发时更易有血小板升高表现 ,但b2a2型患者更易有WBC数升高的表现 ,较多的初发CML患者同时伴有m bcr/abl阳性。     

染色体核型和bcr/abl融合基因表达与慢性髓细胞白血病急变的关系

目的 探讨慢性髓细胞白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)的细胞遗传学特性及其与病程发展的关系.方法 短期培养法直接法G显带检测CML的骨髓染色体核型,双色荧光原位杂交检测CML的bcr/abl融合基因,统计学方法采用t 检验.结果 264例CML患者的骨髓染色体检测,检测出Ph染色体阴性14例,阴性率5.3 %,其余为Ph染色体阳性,阳性率为94.7%.在观察到CML急变的43例患者中,标准Ph染色体22例,Ph染色体阴性9例,双Ph染色体2例,变异Ph染色体3例,标准Ph染色体伴其它染色体易位3例,Ph染色体阴性伴其它染色体易位1例,Ph染色体阴性伴倒位2例,Ph染色体阳性伴倒位1例.43例患者中24例患者急变时发生了染色体核型及融合基因改变,19例患者染色体核型及融合基因没有发生变化;[t(9;22)(q11;34)]的CML患者与[Ph-,变异Ph,复杂染色体]的CML患者急变时间(月)差异有统计学意义(P＜0.05).结论(1)慢性髓细胞性白血病加速/急变期发生克隆演化;(2)[Ph-,变异Ph,复杂染色体]的CML患者急变时间(月)明显短于[t(9;22)(q11;34)]的CML患者;(3) 染色体核型和bcr/abl融合基因表达可为诊断提供可靠、可循的依据,对预后判断有重要意义.     

bcr/abl融合基因在慢性粒细胞白血病中的表达及临床意义

目的 探讨bcr/abl融合基因的表达在慢性粒细胞白血病(CML)中的诊断、疗效及预后观察中的意义.方法 采用荧光定量逆转录多聚酶链反应(FQ -PCR)技术,对8例复治CML患者和作为对照组的2例急性非淋巴细胞性白血病患者的骨髓或外周血进行bcr/abl融合基因检测;同时比较患者的血象、骨髓象等相关实验室指标.结果 CML中7例慢性期(CP)和1例急变期(BC)患者,均不同程度地表达了bcr/abl融合基因,而对照组该融合基因的表达为阴性.结论 bcr/abl基因是CML发病的分子基础,定量检测bcr/abl融合基因对于CML的诊断、临床分型、疗效观察及预后判断有重要意义.     

RT-PCR检测慢性粒细胞白血病患者bcr/abl融合基因结果分析

目的探讨逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）体系检测慢性粒细胞白血病（CML）bcr/abl融合基因的临床价值。方法 Trizol试剂提取细胞RNA,用特异引物RT-PCR检测bcr/abl融合基因,并作灵敏度实验。结果本研究灵敏度可达104的稀释水平,46例CML患者bcr/abl融合基因的阳性率为91.3%,其中b3a2有27例,b2a2有15例。结论 RT-PCR检测bcr/abl融合基因检测弥补了细胞形态学诊断的不足,并为CML临床治疗和预后判断提供了指导。     

双色ES探针检测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的应用研究

目的:探讨使用bcr/abl双色ES探针的荧光原位杂交(fluorescence in-situ hybridization,FISH)应用于慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因检测的意义.方法:使用荧光原位杂交方法对2005年1月至2006年2月本院收治的12例慢性粒细胞白血病患者之骨髓细胞进行检测分析.结果:12例CML均检出bcr/abl基因的存在,其中2例伴ASS基因缺失.结论:使用bcr/abl双色ES探针进行荧光原位杂交能为bcr/abl融合基因的检测提供准确直观的依据.     

慢性粒细胞性白血病bcr/abl融合基因的表达

目的：研究慢性粒细胞性白血病患者bcr／abl融合基因阳性率及其临床意义。方法：取慢性粒细胞性白血病(CML)患者骨髓或外周血，提取单核细胞的总RNA，用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)，观察其ber／abl基因的表达。结果：9例CML患者中，8例ber／abl基因阳性，占88.9％。结论：bcr／abl基因检测可以用来辅助CML的临床诊断。     

用DNA-PCR方法于基因组水平检测K562细胞及慢性粒细胞白血病患者bcr/abl融合基因

目的：在慢性粒细胞白血病（慢粒）细胞系K562及慢粒患者中尝试基于DNA水平的bcr／abl融合基因检测方法。方法：以Waller的“L—T DNA PCR”方法为基础，并针对其引物位置设计的缺陷，改进设计了一套DNA—PCR引物，分别提取K562细胞及慢粒患者外周血单个核细胞DNA，进行bcr／abl融合基因扩增，并对扩增片段进行序列测定。结果：运用DNA—PCR方法成功地扩增出了K562细胞及2名CML患者外周血基因组的bcr／abl融合基因片段，随后进行的片段测序进一步明确了融合基因的断裂位点。结论：DNA—PCR提供了一种基于基因组DNA水平的新检测手段，结合测序能鉴定融合基因的断裂位点，若结合定量PCR的方法则能监测患者的治疗效果与预后，还能检测患者经化疗后的残留微小病灶。     

bcr/abl基因在慢性粒细胞性白血病中的发病作用及bcr/abl反义基因治疗

慢性粒细胞性白血病(CML)最有效治疗手段为骨髓移植(BMT)。但异体BMT供髓者缺乏，且有发生移植物抗宿主病的危险。自体BMT常因骨髓净化不彻底导致复发。所以探讨CML细胞生物学行为改变的原因，是探索CML病因进而力争治愈CML的关键。 　　1　bcr/abl表达产物及功能 　　90%以上CML患者骨髓全部造血细胞内出现Ph1染色体，由位于9号染色体q34.11的c-abl基因与位于22号染色体q11.21的c-sis基因相互易位，形成t(9;22)(q34.11;q11.21)所致。22号染色体上断裂点集中在约5 800 bp的区域内，称M-bcr。CML中bcr/abl融合方式有2种：bcr第3及第2外显子分别与abl第2外显子融合成b3a2及b2a2型，二者差75 bp，均表达210 000的蛋白，即p210bcr/abl (p210)。此外还有bla2型(p185)，主要见于ALL。     

ES探针荧光原位杂交法检测bcr/abl融合基因

目的探讨应用ES型bcr/abl探针(双色单融合)荧光原位杂交技术(FISH)在检测bcr/abl融合基因中的价值。方法慢性髓细胞性白血病(CML)初诊或复诊患者30例(骨髓标本43份),行普通染色体核型分析和ES型bcr/abl探针荧光原位杂交分析。结果 43份骨髓标本,6份未做骨髓培养,6份培养失败,在其余31份培养成功的标本中,找到Ph1染色体9份,另有1份标本多次检查都发现存在21p+染色体异常;43份骨髓都经FISH检测,13份标本发现bcr/abl融合基因。结论 ES型bcr/abl探针对CML初诊病例的bcr/abl融合基因有较高的检出率;对复发病例,不仅能辅助诊断CML,而且在监测白血病微小残留病灶、判断疾病的进展上均有较高的灵敏度。     

RT-PCR检测慢性粒细胞白血病患者骨髓细胞集落bcr/abl mRNA的表达

采用ＲＴＰＣＲ 技术对ＣＭＬ 患者骨髓细胞１４ ｄ 的细胞集落群和部分１４ ｄ 或２８ ｄ 的单个细胞集落ｂｃｒ／ａｂｌ ｍ ＲＮＡ 表达进行分析。结果显示：所检测的骨髓细胞集落ｂｃｒ／ａｂｌ 基因的表达均呈阳性,即为ＣＭＬ 集落,与细胞遗传学分析结果一致。该方法为研究ＣＭＬ 造血前体细胞基因表达及其诊断、治疗监测提供了灵敏、有效的分析手段;并可作为研究ＣＭＬ 发病、治疗及筛选抗ＣＭＬ 药物较为理想的方法。     

In Situ-RT PCR定量检测16例慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因

目的：研究原位逆转录多聚酶链反应技术（In Situ-RT PCR)在检测慢性粒细胞白血病（CML）bcr/abl融合基因中的应用价值及其意义。方法：用In Situ-RT PCR方法测定CML病人bcr/abl融合基因表达量,结果：在不破坏完整性条件下细胞系K552和CML病人检测到bcr/abl mRNA的扩增产物,表现为细胞浆内出现蓝紫色颗粒,计算这种阳 细胞的百分率来相对定量地,CML病人bcl/abl mRNA的表达水平,这种检测技术的敏感性达10^-4水平以上,结论：In Situ-RT PCR可以相对定量地检测CML病人bcl/abl mRNA的表达,直观地评价α－干扰素（α－IFN）,骨髓移植（BMT）等治疗CML的疗效,本检测方法敏感性高,又可用做微小残留病（MRD）的检测。αα     

筑巢式PCR检测慢性粒细胞白血病bcr/ablm RNA

目的：观察慢性粒细胞性白血病（CML）患者bcr／ablmRNA的表达情况。方法：应用逆转录筑巢式聚合酶链反应（NestedPCR）检测了32例CML患者的bcr／ablmRNA。结果：30例检测到bcr／ablmRNA;其中19例检测到bcrexon3／ablexon2mRNA,7M表达bcrexon2／abl。exon2mRNA．4例同时表达这两种mRNA。结论：NestedPCR是检测CML患者bcr／ablmRNA有效而敏感的方法。     

黄连解毒汤通过抑制血红素加氧酶-1发挥逆转慢性粒细胞白血病加速期的作用

目的:探讨黄连解毒汤(HLJDT)对慢性粒细胞白血病(CML)加速期的治疗作用,以及HLJDT及其主要活性成份之一的黄芩素对血红素加氧酶-1(HO-1)表达的影响。方法:通过对1例CML的患者口服HLJDT治疗6个月的观察,外周血检查和骨髓穿刺分析治疗前后外周血象和骨髓象的变化;流式细胞术分析HLJDT和黄芩素对CML细胞系K562的活细胞计数的影响;逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测患者骨髓单个核细胞HO-1基因的表达;蛋白印记检测经黄芩素处理后K562细胞HO-1蛋白的表达水平。结果:口服HLJDT对CML加速期的治疗有效,可明显降低骨髓和外周血原始粒细胞和早幼粒细胞数,使疾病重新回复到慢性期;并且在体内能降低肿瘤细胞HO-1基因的表达,在体外,HLJDT能抑制K562细胞的增殖,且其主要成份黄芩素亦有相同作用,并且下调HO-1蛋白的表达。结论:HLJDT具有治疗CML加速期的作用,其机理与抑制HO-1基因和蛋白的表达有关;因此,HLJDT具有潜在的临床应用价值。     

bcr/abl特异性siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建bcr/abl的特异性siRNA真核细胞表达载体,并初步探索对K562细胞bcr/ablmRNA和P210蛋白的影响。方法根据GenBank数据库提供的bcr/abl基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计双链小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA),再转化为能表达其小发卡结构RNA(smallhairpinRNAs,shRNA)的DNA序列,并与pTER质粒定向连接,构建受控于人RNA聚合酶启动子H1的真核表达载体pTER117、pTER363,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定;在脂质体的介导下转染K562细胞,用RT-PCR分析bcr/ablmRNA的表达,细胞化学染色检测P210蛋白的表达。结果构建bcr/abl融合基因siRNA真核表达载体pTER117、pTER363,经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致,转染K562细胞24h后,pTER117、pTER363分别使bcr/ablmRNA的相对水平下降52%、43%,使P210蛋白分别下降47%、40%。结论bcr/abl融合基因siRNA真核细胞表达载体构建成功,并有效干扰K562细胞bcr/abl的表达。     

慢性粒细胞白血病骨髓细胞体外培养净化作用实验研究

目的 :采用 FISH方法直接在干细胞水平对慢性粒细胞白血病 (CML )患者自体骨髓体外培养前后的间期细胞进行 bcr/abl融合基因检测 ,从而探讨 CML 骨髓细胞体外培养对自体骨髓移植物的净化作用。方法 :分离初治的慢性期 Ph+ CML 7例骨髓单个核细胞 (MNCs) ,体外培养 10 d,用免疫磁珠 (MACS)富集培养前后的 CD34+ 细胞 ,通过流式细胞仪检测培养前后 MNCs中 CD34+ 干细胞比例 ,然后用 FISH方法检测其中 bcr/abl融合基因 ,同时分别用正常人细胞及 K5 6 2细胞株作阴性及阳性对照。结果 :(1) 7例患者骨髓细胞培养前后 CD34+ 细胞中 bcr/abl融合基因平均检出率分别为 85 .3%± 4 .9%和 78%± 5 .1% ,有统计学意义 (P<0 .0 5 ) ,(2 )培养前培养体系中 CD34+ 细胞数量为 (6 .0 6 0± 1.5 6 4 )× 10 5个 ,培养后体系中的 CD34+细胞数量为 (5 .974± 1.4 2 4 )× 10 5个 ,两者无明显差异 (P>0 .0 5 )。 (3)在对照组中假阳性率为 2 .5 % ,假阴性率为 2 %。结论 :自体骨髓细胞体外培养对 CML 病人的骨髓肿瘤细胞有一定程度的净化作用 ;FISH技术直接在干细胞水平检测 bcr/abl融合基因 ,且能定量分析 ,较传统方法更适合对骨髓净化进行评价 ,为骨髓净化提供了一种更方便、可靠的评定方法     

Bcr/abl同靶点小干扰RNA与反义寡核苷酸对K562细胞的作用比较

目的比较靶向Bcr／abl基因b3a2融合位点的小干扰RNA（small interferon RNA,SiRNA）及作用靶点完全相同的反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide,ASODN）对人白血病K562细胞的增殖抑制作用,并联用三氧化二砷（As2O3）,比较二者对K562细胞化疗增敏作用。方法体外转录方法合Bcr／abl b3a2融合住点SiRNA,lipofectamine^TM2000转染,改良MTT法检测药物对K562细胞增殖的抑制作用。结果SiRNA和相同作用靶点的ASODN均显示出明显的细胞增殖抑制效应,SiRNA抑制K562细胞的IC50为97．47nmol／L,ASODN抑制K562细胞的IC50为10．71μmol／L;50nmol／L SiRNA与As2O3联用后,明显提高K562细胞对As2O3的敏感性,相同浓度的ASODN对细胞无明显化疗增敏作用。结论本实验结果提示针对Bcr／abl基因融合位点设计的极低浓度的SiRNA即能显著抑制K562细胞增殖,提高细胞对化疗药物的敏感性,其效果明显强于同靶位点的ASODN,显示了RNAi技术应用于慢性髓系白血病的良好前景。     

抗慢性粒细胞性白血病bcr/abl mRNA真核表达载体的构建

目的：构建一个含M1RNA、具有特异性抗慢性粒细胞性白血病（CML）细胞融合基因bcr/ablmRNA的真核表达载体，以用于CML的分子靶向治疗。方法：以pTK117为模板，通过PCR方法合成一个带有导引序列（GS）的M1RNA，再将PCR产物克隆到真核表达载体pNAV-1上，得到重组质粒pAVGS4，转化大肠埃希菌JM109，以碱裂解法小量抽提，酶切电泳鉴定，并测序鉴定。结果：以EcoRI和SalI酶切、1％的琼脂糖凝胶电泳显示在500和6500bp附近各有一条明亮的条带。应用PCR方法测序的结果与模板序列一致。结论：构建的pNAV-1经酶切和测序鉴定，与目标序列一致，含有核酶、具有抗bcr/abl mRNA的真核表达载体构建成功，预期可用于CML细胞株和原代细胞的实验研究。