切割MDR1 RNA的核酶（Ribozyme）对肝癌多药耐药细胞株BEL…

为逆转肿瘤多药耐药基因产物Ｐ－ｇｐ蛋白质所介导的肿瘤细胞对多种化疗药物的耐受性，设计愈了一种能切割ＭＤＲ１ｍＲＮＡ第１９６密码子ＧＵＣ序列的锤头状核酶并定向克隆于转录病毒载体ｐＤＦＯＲ－ｎｅｏ的ＢａｍＨＩ钭点。经病毒包装细胞ＰＡ３１７包装后感染人肝癌多药耐药细胞株ＢＥＬ－７４０２／ＤＯＸ细胞，经Ｇ４１８筛选得到稳定的转化细胞株。     

核酶对肝癌耐药细胞株BEL—7402／DOX耐药性的逆转作用

为逆转多药耐药ｍｄｒ－１基因产物Ｐ－ｇｐ蛋白所介导的肿瘤细胞对多种化疗药物的耐受性，作者设计合成了一种能切割ｍｄｒ－１ｍＲＮＡ第１９６密码子ＧＵＣ序列的锤头状核酶（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ），并定向克隆于逆转录病毒载体。经ＰＡ３１７包装后，病毒上清感染ＢＥＬ－７４０２／ＤＯＸ细胞株。经Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交证实，ＰＡ３１７及转化的ＢＥＬ－７４０２／ＤＯＸ细胞中均有病毒的高表达，ＲＴ－ＰＣＲ结果表明，转化细胞中ｍｄｒ－１ｍＲＮＡ与未转化细胞相比明显减少甚至不能扩增出来，流式细胞技术检测发现转化细胞表面Ｐ－ｇｐ的表达与非转化细胞相比明显下降。ＭＴＴ法检测发现转化细胞对多种化疗药物重新产生较高的敏感性。结果提示，此Ｒｉｂｏｚｙｍｅ转化ＢＥＬ－７４０２／ＤＯＸ细胞后能有效抑制ｍｄｒ－１基因的表达，使已产生耐药的肝癌细胞的多药耐药表型发生逆转。     

mdr-1特异性核酶逆转卵巢癌的多药耐药

目的：探讨卵巢癌多药耐药的机制及应用核酶对阿霉素(ADM)引起的多药耐药(MDR)的逆转。方法应用共聚焦激光显微镜(confocal)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白免疫印迹法(Western blot)等检测卵巢癌细胞株A2780及阿霉素耐药株A2780／ADM多药耐药基因(mdr-1)及其编码的p-糖蛋白(p-gp)的表达,并比较导入mdr-1特异性核酶后A2780／ADM细胞MDR表型的改变。结果：A2780／ADM细胞对ADM的耐药性是A2780细胞的8．43倍。A2780／ADM细胞中mdr-1基因和p-gp表达较A2780细胞增高,转染mdr-1核酶基因后,A2780／ADM细胞的mdr-1 mRNA和p-gp表达明显下降。结论:ADM所致的卵巢癌细胞MDR与mdr-1基因过度表达有关,应用mdr-1核酶能在一定程度上逆转A2780／ADM细胞的MDR。     

索拉非尼体外逆转人肝癌耐药细胞BEL-7402/5-FU多药耐药性机制的研究

目的:研究索拉非尼对人肝癌耐药细胞BEL-7402/5-FU多药耐药性逆转作用及可能机制.方法:MTT法检测索拉非尼对BEL-7402/5-FU细胞的抑制率及无细胞毒性剂量的索拉非尼对化疗药物的逆转作用;流式细胞仪检测细胞内罗丹明-123和多柔比星荧光强度;RT-PCR检测MDR1、ABCG2和LRP等耐药基因mRNA表达情况;蛋白质印迹法检测P-gp表达情况.结果:2.5 ttg/mL索拉非尼对BEL-7402/5-FU细胞无细胞毒作用,对氟尿嘧啶,表柔比星和紫杉醇的逆转倍数分别为2.54、4.92和2.23倍,其相对逆转率分别为66.7%、96.5%和76.8%;流式细胞仪检测显示,BEL-7402/5-FU细胞内多柔比星(P＜0.05)和罗丹明-123(P＜0.05)浓度明显增加;RT-PCR显示,MDR1(P＜0.05)和ABCG2(P＜0.01)表达明显下降,对LRP表达无明显影响(P＞0.05);蛋白质印迹法显示,P-gp表达明显下降(P＜0.01).结论:索拉非尼具有部分逆转肝癌多药耐药的作用,可能与下调MDR1/P-gp和ABCG2的表达、抑制P-gp功能以及增加细胞内化疗药物浓度有关;而此作用可能与LRP无关.     

肝癌多药耐药细胞株的建立及其多药耐药机理的研究

 为建立人肝癌多药耐药细胞株并研究其多药耐药的机理，本文应用BEL－7402细胞株，通过不断提高培养液中阿霉素（Doxorubicin）的浓度，长期筛选培养，得到肝癌多药耐药株BEL7402/DoX。经MTT法检测BEL－7402对长春新碱（VCR）等8种抗癌药的抗性提高了27－1100倍不等。以流式细胞技术检测了此细胞株表面MDR1蛋白P－gp、多药耐药相关蛋白MRP及谷胱甘肽硫转移系统（GSH/GST）的表达；用RT－PCR方法检测了MDR及MRP基因表达水平。发现BEL7402/Dox细胞表面P－gp表达为93.5～97.4％；MRP的表达为84.7～90.2％；RT－PCR证实此细胞株中有MDR及MRPmRNA的高表达；未发现GSH/GST的表达升高。     

核酶对人肺腺癌细胞多药耐药的逆转

目的 探讨针对多药耐药基因（ｍｄｒｌ）的核酶对肺腺癌细胞多药耐药的逆转作用。方法以ｍｄｒｌ ｍＲＮＡ ８８０位点为靶位点,通过脂质介导,将抗ｍｄｒｌ核酶表达质粒（ｐＨ β Ａｐｒ－ｌ ｎｅｏ／ｍｄｒｌ－Ｒｂ）导入肺腺癌耐药细胞株Ａ５４９／Ｒ。分别采用ＲＴ－ＰＣＲ、流式细胞仪检测术、罗丹明聚集及ＭＴＴ方法,观察细胞的ｍｄｒｌ ｍＲＮＡ、Ｐ糖蛋白（Ｐ－ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ,Ｐｇｐ）表达和对阿霉素敏     

MDR1基因稳定表达的人肝癌多药耐药细胞株的建立

目的 建立多药耐药基因(MDR1)稳定表达的人肝癌Bel-7402耐药细胞株，为应用RNA干扰技术逆转肿瘤多药耐药基因的表达提供实验模型。方法 应用阿霉素(ADM)长期培养筛选建立Bel-7402耐药细胞株，应用MTT法、流式细胞仪(FCM)及逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)对该细胞株相关特性(耐药范围、致死剂量、p-糖蛋白功能及其表达阳性率、MDR1基因检测)进行比较研究。结果 经MTT法检测，耐药细胞株耐药性明显增高，FCM检查发现从敏感细胞到耐药细胞，其阿霉素潴留功能由77．7％降至25．1％，P-糖蛋白(P—gp)阳性率由1．4％升高至54．0％，RT-PCR检查显示该细胞中MDR1 mRNA呈高表达。结论 成功建立了稳定表达MDR1基因的人肝癌Bel-7402耐药细胞株，该细胞中P—gp呈高表达，稳定性好。     

槐耳清膏体外逆转人肝癌耐药细胞BEL-7402/5-Fu多药耐药性

[目的]研究槐耳清膏对人肝癌耐药细胞BEL-7402/5-Fu多药耐药性逆转作用及可能机制。[方法]MTT法检测槐耳清膏对BEL-7402/5-Fu细胞的抑制率及无细胞毒性浓度的槐耳清膏对化疗药物的逆转作用;流式细胞仪检测细胞内罗丹明-123和阿霉素荧光强度;RT-PCR检测MDR1、ABCG2和LRP基因表达情况;Western blot检测P-gp表达情况。[结果]0.01mg/ml槐耳清膏对BEL-7402/5-Fu细胞无细胞毒作用,对氟尿嘧啶、表阿霉素和紫杉醇的逆转倍数分别为3.67倍、2.38倍和2.16倍,相对逆转率分别为72.8%、70.1%和74.9%;流式细胞仪检测显示BEL-7402/5-Fu细胞内阿霉素和罗丹明-123浓度明显增加;RT-PCR显示MDR1表达明显下降,对ABCG2和LRP表达无明显影响;Western blot显示P-gp表达明显下降。[结论]槐耳清膏具有部分逆转肝癌多药耐药的作用,可能与下调MDR1/P-gp表达、抑制P-gp功能以及增加细胞内化疗药物浓度有关;而此作用可能与ABCG2和LRP无关。     

肺癌化疗多药耐药与逆转策略

恶性肿瘤化疗失败的主要原因是多药耐药的发生。研究表明,多药耐药的机制十分复杂,P-gp、TopoⅡ、GST-π、金属硫蛋白(metallothionein,MT)及p53基因突变等是肺癌产生多药耐药的物质基础。本文重点介绍非小细胞肺癌耐药因子及耐药逆转的对策,以指导临床化疗药物的筛选及治疗方案的优化,有助于提高肺癌患者的生存期和生存率。     

逆转录病毒载体介导的核酶基因转移有效恢复肿瘤细胞的化疗敏感性

为了研究抗MDR1核酶逆转肿瘤细胞中P-gp介导的多重耐药性(MDR)的作用。方法： 首先,我们建立了单纯由P-gp介导的、20倍耐药的人Daudi淋巴瘤细胞的模型 Daudi/MDR20。同时我们将表达不同抗MDR1核酶的逆转录病毒载体（N2A+tRNA i met-196MDR1-Rz,N2A+tRNA i met -196MDR1-sRz 和 N2A+tRNA i met -iMDR1-sRz）转染到GP+envAM12细胞中进行包装,获得了高滴度的病毒［（1.1～2.5）×10 5 cfu/ml］。后者用于感染Daudi/MDR20。结果： 通过一系列分子生物学检测证实,携带3种核酶的逆转录病毒不但整合到DNA中,而且也高水平表达相应的核酶tRNA i met -iMDR1-sRz,tRNA i met -196MDR1-sRz 和tRNA i met -196MDR1-Rz。结果表明,tRNA i met -iMDR1-sRz和tRNAimet-196MDR1-sRz转导的Daudi/MDR20细胞完全逆转了对长春新碱的敏感性,并伴随着MDR1 mRNA和P-gp表达的阻断。结论： 逆转录病毒载体高效介导的抗MDR1核酶的基因转移能够完全逆转肿瘤细胞中P-gp依赖的MDR。     

逆转录病毒载体介导的核酶基因转移有效恢复肿瘤细胞的？…

目的：为了研究抗ＭＤＲＩ核酶逆转肿瘤细胞中Ｐ－ｇｐ介导的多重耐药性（ＭＤＲ）的作用。方法：首先,我们建立了单纯由Ｐ－ｇｐ介导的、２０倍耐药的人Ｄａｕｄｉ淋巴瘤细胞的模型－Ｄａｕｄｉ／ＭＤＲ２０。同时我们将表达不同抗ＭＤＲ１核酶的逆转录病毒载体（Ｎ２Ａ＋ｔＲＮＡｉｍｅｔ－１９６ＭＤＲ１－Ｒｚ,Ｎ２Ａ＋ｔＢＮＡｉｍｅｔ－１９６ＭＤＲ１－ｓＲｚ和 Ｎ２Ａ＋ｔＲＮＡｉｍｅｔ－ｉＭＤＲＩ－ｓＲｚ）转染到ＧＰ＋ｅｎｖＡＭ１２细胞中进行包装,获得了高滴度的病毒［（１,１～２．５）×１０ｃｆｕ／ｍｌ］。后者用于感染Ｄａｕｄｉ／ＭＤＲ２０。结果：通过一系列分子生物学检测证实,携带３种核酶的逆转录病毒不但整合到ＤＮＡ中,而且也高水平表达相应的核酶ｔＲＮＡｉｍｅｔ－ｉＭＤＲ１－ｓＲｚ,ｔＲＮＡｉｍｅｔ－１９６ＭＤＲ１－ｓＲｚ和ｔＲＮＡｉｍｅｔ－１９６ＭＤＲ１－Ｒｚ。结果表明,ｔＲＮＡｉｍｅｔ－ｉＭＤＲ１－ｓＲｚ和ｔＲＮＡｉｍｅｔ－１９６ＭＤＲ１－ｓＲｚ转导的Ｄａｕｄｉ／ＭＤＲ２０细胞完全逆转了对长春新碱的敏感性,并伴随着ＭＤＲ１　ｍＲＮＡ和Ｐ－ｇｐ表达的阻断。结论：逆转录病毒载体高效介导的抗ＭＤＲ１核酶的基因转移能够完全逆转肿瘤细     

A Comparative Analysis of the Sensitivity of Multidrug Resistant (MDR) and Non-MDR Cells to Different Anthracycline Derivatives

Because of the fact that tumor cell sensitivity to cytotoxic agents may play a major role in cancer treatment, and several anthracyclines are widely used for first-line treatment of leukemia, lymphoma and other tumors, and since the overexpression of the mdr-1 gene-coded 170 Kd glycoprotein (P170) decreases cell sensitivity to anthracyclines, we investigated the relationship between P170 overexpression and the cytotoxicity of two classic anthracyclines (Daunorubicin or DNR and Doxorubicin or DX) and two lipophilic anthracycline derivatives (Idarubicin or IDA and Iododoxorubicin or IDX). For these purposes, we used multidrug resistant (MDR) and non-MDR tumor and leukemia cell lines and the MTT-microcultured tetrazolium colorimetric assay. We showed that mdr-1 gene overexpression was strongly associated with the development of a high level of resistance to DNR and DX, but not to the derivatives IDA and IDX. These data suggest that more lipophilic anthracycline derivatives may also be active in MDR cell systems.     

桂皮酸诱导BEL—7402人肝癌细胞分化的研究

目的 探讨植物成分桂皮酸诱导ＢＥＬ－７４０２人肝癌细胞分化的作用。方法 用桂皮酸处理ＢＥＬ－７４０２人肝癌细胞,观察细胞增殖、甲胎蛋白（ＡＦＰ）分泌量、鸟氨酸氨基甲酰转移酶（ＯＣＴ）、酪氨酸－α－酮戊二酸转氨酶（ＴＡＴ）、碱性磷酸酶（ＡＬＰ）和γ－谷氨酰转肽酶（γ－ＧＴ）活性的变化。结果 １．０ｍｍｏｌ／Ｌ桂皮酸均显著抑制肝癌细胞增殖,并使代表肝细胞分化的ＯＣＴ、ＴＡＴ和ＡＬＰ比活力明显升高（Ｐ〈     

甲基莲心碱对耐阿霉素人乳腺癌细胞多药耐药性的逆转

目的研究甲基莲心碱逆转耐阿霉素人乳腺癌细胞多药耐药性(MDR)的作用及机制。方法采用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞毒性;PI 染色流式细胞计数测定细胞凋亡;间接免疫荧光流式细胞术检测细胞 P-gp 的表达;HPLC 检测细胞内药物浓度。结果 Nef(1、5、10μmol·L~(-1))对人乳腺癌细胞(MCF-7/S)和耐阿霉素人乳腺癌细胞(MCF-7/ADM)无显著毒性作用。阿霉素(ADM)对敏感株 MCF-7/S 的 IC_(50)为0.13μg·mL~(-1)而对 MDR 细胞株 MCF-7/ADM 的 IC_(50)为11.63μg·mL~(-1),MCF-7/ADM 细胞较MCF-7/S 细胞对 ADM 耐药88倍,1、5、10μmol·L~(-1) Nef 能使 ADM 对 MCF-7/ADM 细胞的 IC_(50)从11.63μg·mL~(-1)依次下降至4.59、2.44、0.27μg·mL~(-1)。MCF-7/ADM 细胞对 ADM 具有凋亡抗性,Nef(1、5、10μmol·L~(-1))能克服 MCF-7/ADM 细胞对 ADM 的凋亡抗性。MCF-7/ADM 细胞较 MCF-7/S 细胞高表达 P-gp,Nef(10μmol·L~(-1))处理24h 后,MCF-7/ADM 细胞 P-gp 表达明显下降。ADM 作用3h 后,MCF-7/ADM 细胞内 ADM 的浓度比 MCF-7/S 细胞少2.8倍,Nef(10μmol·L~(-1))可使 MCF-7/ADM 细胞内 ADM 的浓度增加3.2倍,但并不增加 MCF-7/S 细胞内 ADM 的浓度。结论 Nef 具有逆转耐阿霉素人乳腺癌细胞 MDR 的作用,其作用机理与促进 MDR 细胞内 ADM 积累和下调 MDR 细胞 P-pg 表达有关。     

甲基莲心碱对耐阿霉素人乳腺癌细胞多药耐药性的逆转

Objective: To study the reversal effect of neferine on adriamycin (ADM) resistant human breast cancer cell line MCF-7/ADM. Methods: The cytotoxic effect of Nef or ADM was determined by 3-[4, 5-dimethylthiazol-2.-yl], 5-diphenyl tetraxolium bromid (MTT) assay. Apoptosis and the expression of P-glycoprotein (P-gp) were detected by flow cytometry (FCM). The intracellular ADM concentration was measured by HPLC. Results: Nef at 1, 5, 10 mol/L decreased the IC₅₀ of ADM to MCF-7/ADM from 11.63 g/mL to 4.59, 2.44, 0.27 g/mL respectively. MCF-7/ADM could resist the apoptosis induced by ADM while Nef (1-10 mol/L) could augment ADR-mediated apoptosis. Nef (10 mol/L) increased the accumulation of ADM up to 2.88 fold in MCF-7/ADM but not in sensitive cells MCF-7/S and reduced the expression of P-gp in MCF-7/ADM cells. Conclusion: Nef can circumvent multidrug resistance (MDR) of MCF-7/ADM cells and the mechanism was associated with the increase of intracellular accumulation of ADM and the reduced expression of P-gp in MCF-7/ADM cells.     

阿托伐他汀逆转BEL-7402/5-FU细胞多药耐药的体外实验研究

目的:研究阿托伐他汀对人肝癌细胞株BEL-7402/5-FU多药耐药(multi-drug resistance,MDR)的逆转效果及可能的作用机制.方法:MTT法确定阿托伐他汀的逆转作用浓度,检测其对BEL-7402/5-FUMDR的逆转作用;流式细胞仪检测阿托伐他汀对BEL-7402/5-FU细胞内Rho123浓度的影响;免疫组化及Western-blotting检测阿托伐他汀作用后BEL-7402/5-FU细胞中P-gp及Bcl-xl蛋白质的表达水平.结果:浓度小于125 ng/ml的阿托伐他汀对BEL-7402/5-FU细胞无明显抑制作用;阿托伐他汀(10 ng/ml)联合5-FU(FA10)的逆转倍数为单用5-FU的5.49倍,此浓度的阿托伐他汀作用后BEL-7402/5-FU细胞内Rho123的浓度较对照组升高了1.52倍;P-gp蛋白质水平较对照组无明显变化,Bcl-xl蛋白质水平较对照组显著降低.结论:阿托伐他汀对BEL-7402/5-FU细胞的MDR有逆转作用,这可能与其抑制P-gp的功能及Bcl-xl的蛋白质表达水平有关,但具体分子机制尚需进一步的研究.     

Knockdown of MDR1 Increases the Sensitivity to Adriamycin in Drug Resistant Gastric Cancer Cells

Gastric cancer is one of the most frequently occurring malignancies in the world. Development of multipledrug resistance (MDR) to chemotherapy is known as the major cause of treatment failure for gastric cancer.Multiple drug resistance 1/P-glycoprotein (MDR1/p-gp) contributes to drug resistance via ATP-dependent drugefflux pumps and is overexpressed in many solid tumors including gastric cancer. To investigate the role of MDR1knockdown on drug resistance reversal, we knocked down MDR1 expression using shRNA in drug resistantgastric cancer cells and examined the consequences with regard to adriamycin (ADR) accumulation and drugsensitivity.Two shRNAs efficiently inhibited mRNA and protein expression of MDR1 in SGC7901-MDR1 cells.MDR1 knockdown obviously decreased the ADR accumulation in cells and increased the sensitivity to ADRtreatment. Together, our results revealed a crucial role of MDR1 in drug resistance and confirmed that MDR1knockdown could reverse this phenotype in gastric cancer cells.