人钠/碘转运体基因转染结肠癌SW480细胞及相关蛋白表达的检测

目的以重组人钠/碘转运体（hNIS）基因转染结肠癌SW480细胞并检测hNIS mRNA及蛋白的表达,为放射性碘治疗非甲状腺肿瘤提供新思路。方法将构建好的重组质粒（pcDNA3.1+-hNIS）进行酶切、测序鉴定并扩增、提取。SW480细胞分为重组质粒（pcDNA3.1+-hNIS）转染组、空白质粒（pcDNA3.1+）转染组、空白对照组,转染后以RT-PCR和Western blot检测各组细胞hNIS mRNA和蛋白的表达。结果酶切和测序结果显示插入的hNIS基因大小和方向均正确。RT-PCR和Western blot显示重组质粒转染组SW480细胞可见hNIS mRNA和蛋白的表达,而空白对照组和空白质粒转染组均未检测到hNIS mRNA和蛋白的表达。结论脂质体法可有效地将hNIS基因转染至SW480细胞并成功表达hNIS蛋白。     

Egr-1启动子调控hNIS基因的重组质粒构建及转染细胞株的建立

目的构建早期生长反应基因-1（Egr-1）启动子调控人钠碘转运体（hNIS）基因的重组质粒并稳定转染人宫颈癌细胞株Hela,评价Egr-1启动子对hNIS蛋白功能的辐射诱导作用。方法以Egr-1／pMRl8T为模板PCR扩增Egr-1启动子序列,亚克隆至真核表达载体FL％-hNIS／pcDNA3,构成重组质粒Egr-1-hNIS／pcDNA3,酶切电泳鉴定,通过FuGENEHD转染入Hela细胞,G418筛选抗性克隆,获取单克隆Hela—Egr-1-hNIS。分别采用流式细胞仪、RT．PCR检测Hela-Egr-1-hNIS细胞系中NIS基因和NIS蛋白的表达。动态摄取碘一125实验观察Hela—Egr-1-hNIS细胞和前期研究所得细胞株Hela—NIS（＋）给予不同剂量的x线辐照前后的摄碘功能。未转染的Hela细胞作为阴性对照组。结果成功构建重组质粒Egr-1．hNIS／pcDNA3,转染Hela细胞后获得了稳定表达细胞系Hela—Egr--一hNIS,流式细胞仪测得NIS表达效率为11．2％;RT—PCR检测到Hela—Egr-1-hNIS有NISmRNA的转录,而对照组无NIS蛋白表达。动态摄碘实验提示Hela—Egr-1-hNIS细胞摄碘能力比阴性对照Hela细胞提高了13倍;辐照后摄碘能力增强,在0～6Gy范围内与辐射剂量成正相关（r=0．960,P〈0．05）;而Hela—NIS（＋）组辐照后摄碘功能下降,与辐射剂量无相关性（r=-0．770,P〉0．05）。结论成功构建Egr-1启动子调控的稳定表达hNIS蛋白的Hela-Egr-1-hNIS细胞系,该细胞系具有较强的摄碘功能及辐射诱导作用,有望在体内治疗中获得更好的治疗效果。     

人KiSS-1基因克隆及其真核表达载体的构建

目的:克隆转移抑制基因KiSS-1的不含信号肽的表达序列,构建人KiSS-1基因的真核表达载体.方法:从人正常胰腺组织中提取总RNA,经RT-PCR得到KiSS-1基因开放阅读框cDNA序列,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达质粒pcDNA3/KiSS-1.结果:经PCR、酶切鉴定和基因序列测定,证实重组入载体pcDNA3的片段为目的基因开放阅读框的核苷酸序列.结论:重组质粒pcDNA3/KiSS-1的成功构建,为该基因相应蛋白质的表达和其抗体的制备研究提供基础.     

神经营养素3基因克隆及其真核表达载体的构建

目的 克隆大鼠神经营养素-3(NT-3)基因的表达序列,构建大鼠NT-3基因真核表达载体.方法 应用RT-PCR从大鼠脑组织总RNA中扩增NT-3基因cDNA,将其克隆到真核表达载体pcDNA3中构建重组质粒pcDNA3-N3,用限制酶酶切鉴定和DNA序列分析鉴定重组质粒.结果 RT-PCR产物为822 bp的特异片段,重组质粒酶切后产生822 bp和5.2 kb片段,DNA测序证实822 bp片段的碱基序列与大鼠NT-3 cDNA序列完全一致.结论 成功克隆大鼠NT-3基因表达序列并构建了NT-3基因真核表达载体pcDNA3-N3.     

VEGF基因RNA干扰质粒的构建与鉴定

目的构建干扰血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）基因RNA表达的重组质粒。方法设计3组针对VEGF基因的核糖核酸干扰（RNA interference,RNAi）序列,应用基因重组技术克隆入载体pcDNA3.1中,重组质粒分别命名为pcDNA3.1-VEGF-LH1、pcDNA3.1-VEGF-LH2和pcDNA3.1-VEGF-LH3,用DNA直接测序法和双酶切法鉴定构建的重组质粒。结果 DNA测序证实克隆入载体pcDNA3.1（-）中的序列正确,双酶切证实RNA干扰序列正确插入载体pcDNA3.1（-）。结论成功构建针对VEGF基因的RNAi质粒,为进一步研究该RNAi质粒在脉络膜新生血管形成中的作用奠定了基础。     

肝细胞癌组织中HBx基因缺失型突变体真核表达载体的构建和鉴定

目的 构建缺失型突变体HBx-d382和HBx-d431真核表达载体.方法 以pGM-T/HBx-d382和pGM-T/HBx-d431质粒为模板,PCR扩增含Kpn Ⅰ和Apa Ⅰ酶切位点的HBx基因片段.双酶切后再与载体pcDNA3载体重组连接.重组质粒转化到大肠杆菌DH5a后,经酶切鉴定和DNA序列测定,筛选出重组pcDNA3/HBx-d382和pcDNA3/HBx-d431真核表达载体.结果 成功构建了重组pcDNA3/HBx-d382和pcDNA3/HBx-d431真核表达载体,经DNA序列测定与比对,重组前后HBx基因片段序列一致.结论 pcDNA3/HBx-d382和pcDNA3/HBx-d431真核表达载体构建成功,可为HBx基因缺失型突变体,特别是HBx-d382基因的生物学功能研究提供基因材料.     

人UROC28基因真核表达载体的构建

目的:构建人UROC28基因的真核表达载体,观察其在HEK293细胞中的表达。方法:以PUC-19-UROC28质粒为模板,扩增UROC28基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pcDNA3中,酶切鉴定目的基因。重组质粒用脂质体转染HEK293细胞,Western blot观察基因表达情况。结果:PCR扩增的特异性片段长度为430bp,以此构建的重组质粒pcDNA3-UROC28,经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后显示5.4kb和430bp左右的两条片段,测序结果与GenBank中的人UROC28cds序列一致。证明UROC28因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcD-NA3中。Western blot证实pcDNA3-UROC28转染HEK293细胞24 h后有UROC28的表达。结论:成功构建了pcD-NA3-UROC28重组真核表达载体,并在HEK293细胞中表达。     

人生长激素的真核细胞表达质粒的构建及鉴定

目的　构建人生长激素的真核细胞表达质粒。方法　用双酶切从 pUC19-GHcDNA中克隆出生长激素基因 ,然后定向插入真核细胞表达载体pcDNA3中 ,行酶切和测序以鉴定。结果　重组的真核细胞表达质粒 pcDNA3-GHcDNA所含的GHcDNA序列和插入方向均正确。结论　本实验所构建的重组真核细胞表达质粒 pcDNA3-GHcDNA为进一步研究GH在体内表达的生理和病理作用有一定意义     

人谷胱甘肽硫转移酶M1 TV2基因真核表达载体的构建与鉴定

目的：构建人谷胱甘肽硫转移酶M1 TV2(GST M1 TV2)基因真核表达载体并进行序列分析。方法：用RT-PCR技术从人肺脏组织总RNA中分离扩增人GST M1 TV2基因的cDNA序列,将其插入到真核表达载体pcDNA3．1多克隆位点中,构建真核重组表达质粒pcDNA3．1-GST M1 TV2,并用PCR扩增、酶切分析及序列测定等方法对重组质粒进行鉴定。结果与结论：对人GST M1 TV2测序结果同GenBank序列完全一致,基因登陆号为AY532927、表明已成功构建了pcDNA3.1-GST M1 TV2真核重组表达质粒,为进一步进行真核细胞转染,研究毒物、药物代谢的机制提供了理论依据。     

真核表达载体pcDNA3.1-MAGE-1的构建

目的：构建含MAGE—1基因的重组真核表达质粒。方法：用RT—PCR方法从人肝细胞肝癌组织中扩增出MAGE-1基因cDNA序列，克隆至pGEM—T载体，测序证实基因碱基序列无误后，再克隆至真核表达载体pcDNA3.1( )，构建了pcDNA3.1—MAGE—1重组质粒。结果与结论：RT—PCR获得长度为927bp的阳性产物，经T载体和pcDNA3.1( )真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后。证实真核表达质粒pcDNA3．1—MAGE—1构建成功。     

人甲状腺钠/碘转运体基因全长的克隆及其重组表达质粒的构建

目的:利用基因工程的方法制备甲状腺钠/碘同向转运体(hNIS)cDNA,为今后的转基因治疗奠定物质基础。方法:采用TRIzol一步法,从甲状腺组织中提取总RNA,再应用RT-PCR扩增出hNIS基因全长,然后采用TOPO克隆技术构建重组表达质粒pcDNA3.1D/FLhNIS,并进行酶切和测序鉴定。结果:成功制备了hNIScDNA并构建了其重组表达质粒。结论:为最终实现131I治疗不摄碘的肿瘤提供了分子生物学基础。     

人中性粒细胞多肽1,3真核表达载体的构建与鉴定

目的：扩增人中性粒细胞多肽1，3(HNP1，3)基因片段，构建真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO／HNP1，3。方法：从健康人中性粒细胞中提取总RNA，用RT-PCR方法扩增出HNP1，3基因完整的cDNA片段，应用TA克隆插入pMD18-T载体，经酶切鉴定及序列分析确证后，将其亚克隆至真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO中。结果：从人中性粒细胞中克隆出人HNPl1，3基因，经测序分析与GenBank公布的人HNP1，3核苷酸序列同源性为100％，成功地构建了真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO／HNP1，3。结论：真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO／HNP1，3的成功构建，为后续重组基因的真核／表达及其对HIV-1抑制作用的研究奠定了实验基础。     

幽门螺杆菌napA基因真核表达系统的构建及其在小鼠体内的表达

目的构建幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）napA基因真核表达系统,了解其在小鼠肌细胞中的表达情况。方法根据GenBank中HpnapA基因序列（AF227075）和真核表达质粒多克隆位点序列设计引物,以Hp-RNA逆转录产物为模板,扩增HpnapA编码基因,用基因重组技术将目的基因定向克隆到pcDNA3多克隆位点上,转化大肠杆菌,经质粒扩增和DNA测序后,进行小鼠肌肉免疫、目的基因表达水平和抗体水平检测。结果经双酶切、PCR和测序验证,真核表达质粒HpnapA/pcDNA3构建成功。动物实验结果表明：真核重组质粒在小鼠肌细胞内获良好表达,表达产物能刺激机体产生一定效价的抗体。结论成功构建了HpnapA/pcDNA3真核重组表达质粒;用以免疫小鼠,在小鼠肌细胞内获较好表达并具有免疫原性,有用于疫苗研究的潜在价值。     

垂体腺瘤双重靶向性基因治疗的实验研究

目的构建并实验评价转染与转录双重靶向性基因治疗系统对垂体腺瘤的治疗作用。方法构建GE7基因导入系统介导的生长激素启动子调控的基因治疗系统,通过对垂体生长激素腺瘤GH3细胞的体外实验,以及垂体腺瘤裸鼠模型的体内实验,观察此系统用于垂体腺瘤基因治疗的可能性和靶向性。结果成功构建双重靶向性基因治疗系统;基因转染后,GH3细胞可检测到HSVTK蛋白,对照细胞为阴性;在此基础上予以GCV(4mg/L),GH3细胞存活率平均为106%,相同条件下,U2OS、HO8910PM的存活率分别为829%和935%(P<001);裸鼠皮下种植肿瘤经基因治疗后,治疗组肿瘤体积明显缩小(168mm3±17mm3),各对照组肿瘤体积均有不同程度的增大(P<001);治疗组裸鼠的生存期也较对照组明显延长(平均123d和40d,P<001)。结论GE7转染的生长激素启动子调控的基因治疗有望成为垂体腺瘤的靶向性治疗策略。     

大鼠GDNF真核表达载体的构建及其真在核细胞中的表达

目的：构建ｐｃＤＮＡ３／ＧＤＮＦ真核表达质粒并了解其在真核细胞内的表达．方法：将ＧＤＮＦ逆转录聚合酶链式反应产物克隆至ｐｃＤＮＡ３真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析并以脂质体介导法转染真核细胞,了解其在细胞内的表达及其表达蛋白的生物学活性．结果：酶切鉴定及测序分析表明重组ｐｃＤＮＡ３／ＧＤＮＦ表达质粒克隆成功,转染实验表明重组质粒能在真核动物细胞中表达出具有活性的ＧＤＮＦ蛋白．结论：以脂质体介导     

嗜肺军团菌mip基因的原核与真核表达重组质粒的构建

目的　扩增嗜肺军团菌 mip基因 ,导入载体 p UC18和 pc DNA3.1( ) ,构建重组质粒 p L pmip和pc DNA3.1- mip。方法　采用 PCR从嗜肺军团菌扩增得到 mip基因 ,导入载体 p UC18和 pc DNA3.1( ) ,构建重组质粒p L pmip和 pc DNA3.1- mip并转化大肠杆菌 ,用限制性酶切分析、PCR、序列分析进行鉴定。结果　扩增出 82 8bp的 mip基因 ;构建重组质粒 p L p Mip和 pc DNA3.1- mip。结论　成功扩增 82 8bp的嗜肺军团菌 Mip基因 ,构建重组质粒 p L p Mip和 pc DNA3.1- mip。     

SOCS－3基因真核载体的构建及瞬时表达鉴定

目的构建含小鼠细胞因子信号抑制蛋白-3（SOCS-3）基因的重组pcDNA3.1质粒,同时瞬时转染后,鉴定其在非洲绿猴肾细胞株COS-7中的表达。方法自小鼠肝脏标本中提取RNA进行RT—PCR,经克隆后获得pUC19-SOCS-3质粒,从中切出目的基因片段克隆至质粒pcDNA3．1中,以构建重组质粒pcDNA3.1-SOCS-3。后将构建完成的质粒瞬时转染COS-7细胞株,并随机分为未转染质粒组（对照组）、转染空质粒组和转染重组SOCS-3基因质粒组,同时采用免疫印迹法测定SOCS-3的表达。结果经测序鉴定证实,SOCS-3与美国国立生物技术信息中心核苷酸序列数据库提供的原始序列完全一致;同时经瞬时转染COS-7细胞后,转染重组质粒组的SOCS-3蛋白表达水平（光密度比值）显著高于对照组和转空质粒组（P〈0．01）。结论成功构建含小鼠SOCS-3基因的真核表达质粒,为进一步研究该基因在脂肪代谢中的抑制调节作用提供了技术平台。