亚甲基四氢叶酸还原酶对胃癌细胞基因表达的影响

目的 分析亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因的真核表达质粒对人胃癌细胞生存力、DNA甲基化酶基因及肿瘤相关基因转录水平的影响。方法 分别构建含有人野生型（正义）MTHFR（W）和反义MTHFR（A）的真核表达质粒，将其转染入人胃癌MKN45细胞，噻唑蓝（MTT）法检测细胞生存活力，定量PCR检测DNA甲基化酶及胃癌相关基因的转录水平。结果 转染野生型MTHFR质粒的胃癌细胞生存活力增高（P〈0、01），而转染反义质粒者生存活力降低（P〈0．01）。野生型MTHFR质粒下调c-myc、p21WAF1a和hMLH1基因表达，反义MTHFR质粒的转染则无明显的基因调控作用。结论 重组MTHFR表达质粒可影响细胞生存活力及人胃癌细胞相关基因的表达，可望成为肿瘤基因防治的新靶点。     

人胃癌组织DNA甲基化酶、去甲基化酶与肿瘤相关基因的表达

目的 探讨胃癌组织中甲基化酶、去甲基化酶基因与肿瘤相关癌基因和抑癌基因的关系。方法 取28例胃癌手术标本的癌区、癌旁、正常组织，分别以RT—PCR法和定量RT—PCR法检测DNA甲基化酶1(DNMT1)、去甲基化酶mbd2、甲基化结合蛋白MeDP2和p16^INK4A、c—myc等基因的转录水平，以相关分析等统计学处理研究各基因表达之间及分别与病理组织学之间的关系。结果 癌组织平均DNMT1和mbd2 mRNA分别明显高于和低于正常组织。胃癌组织中c—myc的表达增强，而MeCP2和p16^INK4A无明显变化。在正常组织中，MeCP2与mbd2，p16^INK4A与MeCP2、mbd2，c—myc与MeCP2的转录水平表现出一定的相关性，而当肿瘤发生后仅发现c—myc与mbd2的表达呈负相关。以上各基因与肿瘤生物学行为均无相关性。结论 肿瘤相关基因mRNA的表达与甲基化酶DNMT1无关，而与甲基结合蛋白有关。     

错配修复基因MLH1激活p53和线粒体凋亡通路参与雌激素诱导的结肠癌细胞凋亡

临床和流行病学研究显示雌激素替代治疗可降低绝经后妇女的结直肠癌发生风险。前期研究发现雌激素能上调结肠癌细胞的错配修复(MMR)基因MLH1表达,在MLH1基因缺失的结肠癌细胞中再表达MLH1能明显增强雌激素诱导的细胞凋亡。目的:探讨MLH1参与雌激素诱导结肠癌细胞凋亡所涉及的信号通路以及p53及其相关基因在此凋亡通路中的作用。方法:以含人野生型MLH1(hMLH1)全长cDNA的质粒转染MLH1基因缺失的人结肠癌细胞株HCT116。以转染空质粒的HCT1 16细胞作为对照,在有或无雌激素作用的条件下,采用电泳法检测凋亡DNA Ladder,蛋白质印迹法检测p53等凋亡相关蛋白表达。结果:转染hMLH1后,10~(-8)mol/L雌二醇(E_2)能明显诱导HCT116细胞凋亡。转染hMLH1并经E_2处理的HCT116细胞(D组)与经E_2处理但未转染hMLH1的HCT116细胞(B组)相比,其caspase-3、caspase-9、p53、Bax、胞质细胞色素C蛋白表达均显著增强,D组上述蛋白表达亦均高于转染hMLH1但未经E_2处理的HCT116细胞(C组)。结论:MMR基因MLH1主要通过激活p53和线粒体凋亡通路参与雌激素诱导的人结肠癌细胞株HCT116凋亡。     

p53缺失和突变对人肺癌细胞系恶性表型影响的比较

目的 比较研究外源正义和反义p53对所转染细胞系恶性表型的影响。方法 构建正义和反义p53C—DNA真核细胞表达载体pEGFP—p53(RS)，pEGFP—p53(AS)，载体有绿荧光蛋白基因监测基因转染和表达。经酶切图证明p53正向或反向联结。Liipofectin介导转染801D细胞(801D细胞有p53缺失和突变，蛋白表达阳性)，G418筛选，建立单克隆细胞系。PCR检测外源p53和neo基因。荧光显微镜检查转染细胞绿荧光蛋白表达。免疫组化染色证明突变蛋白表达。比较了pEGFP—p53(AS)和pEGFP—p53(RS)集落形成试验，裸鼠移植试验。FCM分析细胞周期。结果 酶切图证明pEGFP—p53(RS)和pEGFP—p53(AS)的p53c—DNA(RS)分别正向和反向联结质粒pEGFP。Lipofectin介导转染细胞801D细胞，G418筛选，获耐受集落，建立单细胞克隆转染细胞系pEGFP—p53(RS)—801D，pEGFP—p53(AS)801D和pEGFP—801D。PCR检测外源p53和neo基因存在于细胞，细胞可见绿色荧光，证明外源基因存在并稳定表达。免疫组化检测pEGFP—p53(AS)—801D，突变蛋白呈阴性，母系为阳性，显示反义p53封闭突变蛋白表达。pEGFP—p53(RS)—801D和pEGFP—p53(AS)801D细胞集落形成率和裸鼠移植成瘤率均降低，pEGFP—p53(RS)-801D更低。FCM分析细胞周期延滞。结论 有p53缺失和突变的人肺癌细胞系801D体内外恶性增殖明显，在同一细胞背景下，p53缺失比p53突变对恶性增殖起更重要作用。外源野生型p53在肿瘤细胞中可重建抑癌功能，外源反义p53可封闭突变蛋白表达，阻止细胞停留于G1期。     

HIV-1感染对T淋巴细胞p16INK4A基因甲基化及其表达的影响

目的；p16^INK4A基因在与AIDS相关的疾病中的表达缺陷，DNA甲基化可使基因转录下调。本研究观察人类免疫缺陷病毒I型（HIV－1）感染对T淋巴细胞的p16^INK4A基因的表达影响及其途径。方法：建立感染有野生型和突变体HIV－1病毒的T淋巴细胞Hut78细胞系，以RT－PCR、定量PCR和Western blotting检测细胞感染后不同时间的DNA甲基化酶（DNMT）1、3a和3b的mRNA（提高40％以上）和蛋白质水平；并由甲基化特异PCR（MSP）了解p16^INK4A基因甲基化改变，及通过RT－PCR研究该基因的mRNA表达情况。结果：无论野生型抑或突变体HIV－1感染，都能使Hut78细胞中DNMT1表达增强，DNMT3a和DNMT3b无明显变化。HIV－1感染可引起p16^INK4A基因启动子区甲基化水平提高和基因转录水平下调。结论；HIV－1感染可使p16^INK4A甲基化水平升高和表达降低，且与该病毒有无复制无关。     

错配修复基因hMSH2、hMLH1在非霍奇金

目的 探讨错配修复基因hMSH2、hMLH1在非霍奇金淋巴瘤中的表达及意义.方法 运用免疫组化SP法检测22例B细胞性非霍奇金淋巴瘤及18例NK/T细胞性非霍奇金淋巴瘤中hMSH2、hMLH1蛋白表达情况,并探讨其与非霍奇金淋巴瘤临床病理间的关系.结果 NK/T细胞非霍奇金淋巴瘤hMSH2、hMLH1蛋白表达缺失率分别为55.56%、44.44%;B细胞非霍奇金淋巴瘤分别为31.82%、50.00%,两种肿瘤间缺失率比较均无统计学意义.hMSH2、hMLH1蛋白表达缺失与患者性别及肿瘤是否发生于淋巴结无关.结论 错配修复基因hMSH2、hMLH1在非霍奇金淋巴瘤肿瘤组织中存在蛋白表达缺失,可导致基因组不稳定,该肿瘤易感.     

p53基因突变的霍奇金淋巴瘤R-S细胞错配修复基因蛋白的表达及意义

目的探讨错配修复基因在霍奇金淋巴瘤发生中的作用。方法采用免疫组化SP法检测霍奇金淋巴瘤标本中突变型p53蛋白及错配修复基因hMLH1、hMSH2蛋白表达情况。结果霍奇金淋巴瘤组织中R-S细胞hMSH2、hMLH1表达阳性率分别为50.00%、70.00%,未表现出错配修复基因hMSH2、hMLH1蛋白表达减低或缺失,突变型p53表达阳性率为100%。结论错配修复基因系统缺陷可能不是引发伴有p53基因突变的霍奇金淋巴瘤发生、发展的途径。     

胃癌相关基因GCRG213真核表达载体的构建及其对胃癌细胞MKN45的影响

目的 研究胃癌相关基因GCRG213正义、反义转染对胃癌细胞MKN45的影响.方法 采用分子克隆及基因转染技术将GCRG213基因转入哺乳动物细胞,并结合反义转染技术研究GCRG213基因对胃癌细胞恶性生物学行为的影响.结果结果 GCRG213正向和反向克隆正确插人真核表达载体pcDNA3.1(+);重组子pcDNA3.1-a、pcDNA3.1-b和空载体转染人胃癌细胞系MKN45细胞;正义转染其mRNA的表达上调,而反义转染下调;正义转染加快MKN45细胞生长增殖速度、降低细胞凋亡率,反义转染减慢MKN45细胞生长增殖速度,增加细胞凋亡率.结论 胃癌相关基因GCRG213可促进肿瘤细胞生长、分裂和转移,抑制肿瘤细胞的凋亡,可能是一个新发现的恶性肿瘤癌变的促进因素.     

p15^INK4B基因对人胰腺癌细胞系BxPC3增殖的影响

目的探讨p15^INK4B（p15）基因转染对人胰腺癌细胞系BxPC3细胞增殖的影响。方法采用脂质体将pCDNA3．1（＋）-p15质粒及阴性对照pCDNA3．1（＋）-neo质粒转染BxPC3细胞,以亲本细胞作为对照组。应用RT—PCR检测细胞p15^INK4B表达;Western blotting检测细胞p15蛋白表达;MTF法检测细胞增殖;透射电镜观察细胞超微结构变化;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率。结果p15转染组细胞恢复p15^INK4B和蛋白表达。培养第2天生长被抑制,至第7天,生长抑制率达47．9％。G0／G1期细胞占（61．56±3．96）％,显著高于空质粒转染组的（47．44±6．35）％和对照组的（49．22±7．23）％（P〈0．05）。出现明显的G1凋亡峰,细胞凋亡率为（5．27±1．04）％,显著高于空质粒转染组的（0．11±0．06）％和对照组的（0．09±0．07）％（P〈0．05）。透射电镜观察到p15转染组发生细胞凋亡。结论体外p15基因转染可以抑制人胰腺癌细胞系BxPC3细胞增殖,并能诱导其凋亡。     

pEGFP-prohibitin真核表达重组质粒的构建及其在人肝癌细胞系HepG2中的表达

目的构建pEGFP-prohibitin真核表达质粒,并鉴定其在pEGFP-prohibitin转染的人肝癌细胞系HepG2中的表达。方法采用高保真PCR扩增获得prohibitin的全长编码序列,构建真核表达载体pEGFP-prohibitin,并通过基因测序和BLAST比对鉴定重组质粒;提取pEGFP-prohibitin和pEGFP-N1质粒,并通过TurboFect转染试剂转染HepG2细胞;采用实时PCR和Western印迹方法分别在mRNA水平和蛋白质水平检测prohibitin蛋白在转染后HepG2细胞中的表达。结果成功构建pEGFP-prohibitin真核表达重组质粒,并将其成功转染HepG2细胞;pEGFP-prohibitin转染组细胞prohibitin的表达量比空载转染组和未转染组细胞明显增加。结论成功构建真核表达载体pEGFP-prohibitin,并证明抗增殖蛋白prohibitin在pEGFP-prohibitin转染人肝癌细胞系HepG2中高表达。     

胃癌组织中肿瘤相关基因甲基化及其表达与叶酸和代谢酶MTHFR基因多态性的关系

目的:探讨人胃癌组织中癌基c-myc,抑癌基因p16INK4A,p21WAF1,错配修复基NhMLH1和hM2SH2的甲基化状态及其表达与叶酸、MTHFR基因多态性的关系．方法:胃癌38例手术切除标本的癌区、癌旁和外周正常黏膜组织,运用FOL ACS:180自动化学发光系统测定叶酸含量,PCR-RFLP技术检测MTHFR基因677(C→T)和1298(A→C)两个常见多态,并分别以Real—time RT-PCR和甲基化特异性PCR (MSP)技术检测肿瘤相关基因的表达和甲基化状态．结果:c-myc表达升高,p16INK4A,hMLH1和hMSH2表达降低的胃癌黏膜组织其基因启动子区异常甲基化．p21WAF1,hMSH2表达降低, p16INK4A高甲基化者叶酸水平明显降低,c-myc低甲基化和表达升高者中均存在低叶酸水平．MTHFR 677CC基因型的胃癌黏膜组织p16INK4A甲基化升高且表达降低,而其余肿瘤相关基因的甲基化及其表达与MTHFR两个常见多态均无明显相关性．结论:DNA甲基化在胃癌的发生、发展中具有重要作用,叶酸水平和MTHFR基因多态性通过影响部分肿瘤相关基因的甲基化状态而调控其表达．     

siRNA沉默PPARα减弱羟喜树碱诱导的人结肠癌细胞凋亡

背景:多药耐药一直是遏制提高结肠癌化疗有效性的瓶颈问题。目的:探讨沉默PPARα能否减弱羟喜树碱诱导的人结肠癌细胞凋亡,从而阐明PPARα在羟喜树碱耐药中的潜在作用。方法:构建针对PPARα基因的siRNA干扰载体,并转染人结肠癌SW1116细胞,经G418筛选出稳定转染的细胞,以RT-PCR和蛋白质印迹法验证干扰效果。经羟喜树碱干预后,以MTT法检测细胞增殖,Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡。以定量RT-PCR检测不同浓度miR-506前体转染SW1116细胞后对PPARα下游调控靶基因mRNA表达的影响。结果:siRNA干扰载体Ⅲ的沉默效果最佳,PPARα mRNA和蛋白表达分别下调了约94.1%±3.4%和70.8%±8.6%。稳定转染siRNA的SW1116细胞的半数抑制浓度(IC_(50))为(332±19)μg/L,亲本SW1116细胞为(152±12)μg/L。在相同浓度羟喜树碱的作用下,亲本SW1116细胞的凋亡率显著高于稳定转染siRNA的SW1116细胞(150μg/L:7.0%±2.5%对2.8%±1.6%;300μg/L:32.4%±7.1%对18.5%±2.7%)。miR-506前体下调HMGCS-2表达,上调FABP-2、CCND1和TGF-β1表达,其中上调CCND1的作用最为明显。结论:成功构建了针对PPARα的siRNA干扰载体;沉默PPARα能增强SW1116细胞对羟喜树碱的抵抗性,可能与下调HMGCS-2表达并上调FABP-2、CCND1和TGF-β1表达有关。     

Functional significance of concomitant inactivation of hMLH1 and hMSH6 in tumor cells of the microsatellite mutator phenotype

Genetic or epigenetic inactivation of one of the DNA mismatch repair (MMR) genes in tumor precursor cells causes a profound mutator phenotype, known as the microsatellite mutator phenotype (MMP). This mutator phenotype induces mutations not only in cancer genes that drive tumorigenesis but also in other DNA repair genes. The functional significance of these successive DNA repair gene mutations, however, has not been substantiated. Here we show that the concomitant inactivation of two DNA MMR genes (hMLH1 and hMSH6) increases the mutator phenotype. We isolated cell clones of the SW48 MMP-positive cell line with either active or inactive hMSH6. All of these clones lacked expression of hMLH1 because of promoter hypermethylation. Compared with inactivation of hMLH1 alone, the additional inactivation of hMSH6 produced a higher mutation rate and a different spectrum of mutations in the endogenous hprt gene. These results confirm our model that the mutator phenotype can increase during tumorigenesis by the consecutive inactivation of different members of the DNA MMR system. Thus, a stronger mutator phenotype accelerates the accumulation of mutations in target cancer genes, which, in turn, speeds up tumor progression. The results of this study also have significant impact on our understanding of the mechanism of DNA MMR.     

Effects of KAI1 gene on growth and invasion of human hepatocellular carcinoma MHCC97-H cells

AIM: To study the effects of sense and antisense KAI1 genes on the growth and invasion of human hepatocellular carcinoma (HCC) cell line MHCC97-H. METHODS: KAI1 sense and antisense eukaryotic expression plasmids were constructed using subclone technique and transfected into MHCC97-H cells respectively by DOTAP liposome. After successful transfection was confirmed, in vitro growth curve, cell cycles, plate clone formation efficiency, invasive ability in Boyden Chamber assay and ultrastructural morphology were studied. RESULTS: KAI1 sense and antisense genes had no significant effects on the cell growth curve and cell cycles. After transfection with sense KAI1 gene, decreased invasive ability in Boyden Chamber assay and decreased amount of mitochondria, but no significant changes of plate clone formation efficiency were observed in MHCC97-H-S cells. The plate clone formation efficiency and invasive ability in Boyden Chamber assay were significantly increased in MHCC97-H-AS cells, after transfection with antisense KAI1 gene. Furthermore, increased amount of mitochondria, rough endoplasmic reticulum, Golgi apparatus and expanded endoplasmic reticulum were also noted in MHCC97-H-AS cells. CONCLUSION: Changes of KAI1 expression in HCC cells may alter their invasive and metastasis ability of the tumor.     

人核糖体蛋白S13与胃癌细胞多药耐药性的实验研究

目的 探讨人核糖体蛋白S13(RPS13)在胃癌多药耐药(MDR)机制中的作用。方法 采用RT-PCR法扩增RPS13 cDNA片段编码区序列全长，DNA重组技术构建正反义真核表达载体，经脂质体介导转染胃癌细胞SGC7901及胃癌耐药细胞SGC7901/VCR，斑点杂交检测转染细胞mRNA水平的变化；MTT法测定细胞对化疗药物的敏感性，流式细胞仪检测细胞周期。结果 RT-PCR法成功扩增出RPS13 cDNA片段编码区序列全长，并构建正反义真核表达载体；斑点杂交试验证实：正义转染细胞RPS13 mRNA水平上调，反义转染细胞其mRNA水平下调。RPS13正义核酸转染SGC7901细胞后，细胞对阿霉素、5-氟尿嘧啶和长春新碱的敏感性降低；转染反义核酸后，耐药细胞对丝裂霉素和长春新碱的敏感性增加。细胞周期测定表明高表达RPS13后，G1期、S期和G2期细胞的比例分别为47．0％、33．2％和19．8％；低表达RPS13后，G1期、S期和G2期细胞的比例分别为62．9％、1、0％和36．1％。结论 RPS13参与胃癌耐药细胞SGC7901／VCR的多药耐药。