神经特异性转录因子DAT1酵母双杂交诱饵载体的构建

目的：用神经特异性转录因子DAT1构建酵母双杂交系统中的诱饵载体。方法：根据GenBank中提供的DATl序列设计引物，以小鼠脑组织cDNA文库为模板，PCR扩增DAT1，并与pLexA载体连接，测序鉴定。用醋酸锂法转化酵母菌EGY48，在选择性培养基上观察pLexA-DATl在EGY48中的表达。结果：PCR扩增出的DNA片段约490bp，大小正确，构建的融合表达载体pLexA-DAT1，测序结果表明序列完全正确，融合区域的读码框正确。转化了pLexA-DAT1的酵母菌EGY48在加有X-Gal的SD／Gal／Raf／-His／-Ura营养缺陷型诱导平板上菌落不变蓝，证明LexA-DAT1融合蛋白本身不具有激活p80p-LaeZ报告基因的能力，可以用作进一步的实验。结论：获得了在酵母细胞中正确表达且未自主激活报告基因的融合表达载体pLexA-DAT1，可作为酵母双杂交系统中的“诱饵”。     

小鼠4-1BBL基因真核表达载体构建及其在COS-7细胞中的表达

目的：构建含小鼠4-1BBL编码区cDNA序列的真核表达载体，并检测其在COS-7细胞中的表达。方法：将目的基因4-1BBL克隆人pUCl9载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定。亚克隆入真核质粒pIRES2-EGFP，构建真核表达载体pIRES2-EGFP-m4-1BBL。用脂质体法将重组质粒转入COS-7细胞，以RT-PER和观察细胞内荧光的方法检测m4-1BBL的表达。结果：酶切鉴定和序列分析证实，重组质粒含有人4-lBBL全长cDNA编码序列，转染实验表明4-lBBL基因能在COS-7细胞中表达。结论：鼠4-1BBL全长cDNA基因真核表达载体构建及其在COS-7中的表达均获成功，为进一步研究奠定了基础。     

骨唾液蛋白非融合荧光蛋白载体的构建及其在特异性骨转移乳腺癌细胞中的稳定表达

目的 构建骨唾液蛋白(BSP)非融合荧光表达载体,建立稳定高效表达BSP和荧光蛋白的乳腺癌细胞系,为进一步研究BSP在乳腺癌细胞骨转移中的作用奠定基础。方法 从构建好的pB-hBSP载体中用PCR方法扩增hBSP基因,通过BglⅡ和PstⅠ两个限制性酶切位点定向克隆至真核表达载体pIRES2一EGFP,构建重组载体pIRES2-hBSP-EGFP。利用脂质体转染的方法将构建好的重组质粒转入特异性骨转移的乳腺癌细胞株MDA-MB-23180中,并利用G418和流式细胞仪筛选阳性克隆。结果 成功构建hBSP和EGFP非融合表达的真核表达载体pIRES2-hBSP EGFP,并成功转染特异骨转移的乳腺癌细胞株,获得hBSP的稳定转染细胞株,荧光显微镜下可观察到荧光蛋白标记。结论 真核表达载体CRFS2-hBSP-EGFP的构建及hBSP稳定转染细胞株的获得为研究BSP在乳腺癌骨转移中的作用奠定了的基础。     

人表皮生长因子基因的克隆及其真核表达载体的构建

人表皮生长因子（ｈｕｍａｎｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ｈＥＧＦ）具有促进表皮细胞增殖的作用，与免疫性皮肤病及创面组织修复有着密切的关系。随着分子生物学理论和技术的发展，人们对外源性基因在真核系统中表达的机理有了进一步了解〔１〕。为了进行ｈＥＧＦ基因的真核表达及表皮组织基因治疗方面的研究，我们采用逆转录ＰＣＲ方法扩增了ｈＥＧＦ及其信号肽基因，并选用ｐＢＫＣＭＶ穿梭质粒构建了ｈＥＧＦ基因真核表达质粒。１　材料和方法１．１　主要试剂限制性内切酶ＮｈｅⅠ、ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ及Ｔ４Ｄ…     

蛋白激酶C受体与转录因子Twist在宫颈癌组织中表达及其临床意义

目的探讨蛋白激酶C受体(RACK-1)与转录因子Twist在宫颈癌组织中的表达及其临床意义。方法收集潍坊市第二人民医院自2016年1月至2018年3月收治的85例首次行宫颈癌根治手术治疗的宫颈癌患者的癌组织及距离癌周5 cm以上正常组织的标本,采用免疫组化法检测宫颈癌组织和癌旁正常组织中RACK-1、Twist的表达情况,分析其与宫颈癌患者临床病理特征参数的相关性。结果宫颈癌组织中RACK-1阳性表达率为58.8%(50/85),高于正常组织的14.2%(12/85),差异有统计学意义(P<0.05)。宫颈癌组织中Twist阳性表达率为62.4%(53/85),高于正常组织的11.8%(10/85),差异有统计学意义(P<0.05)。RACK-1阳性表达与宫颈癌患者的淋巴结转移、分化程度、国际妇产科联盟分期、脉管瘤栓形成、深肌层浸润均有关(P<0.05)。Twist阳性表达与宫颈癌患者的淋巴结转移、脉管瘤栓形成相关(P<0.05)。在宫颈癌组织中,RACK-1与Twist蛋白的表达呈显著正相关(r=0.469,P<0.05)。结论 RACK-1、Twist高表达与宫颈癌的发生、发展及转移密切相关,RACK-1、Twist可能成为治疗宫颈癌的潜在靶点。     

人睫状神经营养因子的原核表达及其初步纯化

目的：优化条件实现人睫状神经营养因子（ｈｕｍａｎｃｉｌｉａｒｙｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ,ｈＣＮＴＦ）ｃＤＮＡ在大肠杆菌中的高效表达。方法：ＣＮＴＦ克隆进ｐＢＶ２２０后,表达,凝胶过滤纯化,１０日龄鸡背根神经节（Ｅ１０ＤＲＧｓ）测定其生物活性。结果：ＣＮＴＦ在ＨＢ１０１中高效表达,并具有生物活性。结论：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ观察到相对分子质量约为２４×１０３的预期表达产物,优化表达条件后发现其在ＨＢ１０１中的表达状况最好,用凝胶过滤纯化的重组蛋白能促进Ｅ１０ＤＲＧｓ的生长     

视神经损伤后睫状神经营养因子受体的表达变化

视神经创伤、青光眼等疾患主要影响视网膜神经节细胞 (RGCs) ,RGCs的死亡是视功能发生不可逆性改变的直接原因 ,因此 ,关于RGCs存活和再生的研究一直倍受眼科界关注。近十年来的研究发现 ,睫状神经营养因子 (CNTF)能明显促进RGCs的存活和再生[1,2 ] 。睫状神经营养因子受体 (CNTFR )是CNTF的特异性结合蛋白 ,它的表达变化与CNTF的作用密切相关。为进一步了解CNTFRmRNA在视神经损伤及修复过程中的表达情况 ,笔者应用逆转录聚合酶链反应 (RT -PCR)方法对其进行了半定量研究。1　材料与方法1.1　实验动物和材料由上海西普尔 -…     

胶质细胞源性神经营养因子基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

目的：分离胶质细胞源性神经营养因子（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ,ＧＤＮＦ）基因,并在Ｅ．ｃｏｌｉ中获得表达。方法：从人多形性成胶质细胞瘤细胞株ＢＴ３２５ 中提取总ＲＮＡ ,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术分离ＧＤＮＦ基因,构建表达载体ｐＢＶ－ＧＤＮＦ,转化大肠杆菌,温控诱导ＧＤＮＦ的表达。结果与结论：分离得到的人ＧＤＮＦ基因,在大肠杆菌中得到高效表达,表达产物占全菌总蛋白的２４．７％ ,初步纯化后纯度达９０％ 以上。     

脑源性神经营养因子在视网膜神经细胞bcl-2蛋白动态表达中的作用

目的探讨脑源性神经营养因子在视网膜神经细胞bcl-2蛋白动态表达中的作用。方法选择新生小牛视网膜神经细胞进行传代培养,当传至第2代时随机分为观察组及对照组,两组神经细胞个数相同,观察组在接种后的第3天加入脑源性神经营养因子(浓度为50μg/L),对照组不加入任何营养因子。分别于给药后的第2、4、6天应用Western blotting法检测两组视网膜神经细胞中bcl-2蛋白的表达情况。结果观察组给药后第2天bcl-2蛋白表达灰度值为0.451±0.049、给药后第4天bcl-2蛋白表达灰度值为0.376±0.043、体外培养1个月神经元细胞存活数为13.10±1.35、NSE阳性表达细胞数10.53±1.12,均显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);给药后第6天bcl-2蛋白表达灰度值为0.291±0.037,与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论在短时间内,脑源性神经营养因子对视网膜神经细胞bcl-2蛋白的表达具有促进作用,能够在一定意义上保护视网膜神经元细胞。     

神经营养因子受体蛋白在受激光损伤视网膜中的表达

目的探讨TrkA、TrkC和p75NTR受体蛋白在激光损伤视网膜中的表达及意义。方法采用Wistar二级大鼠分别于532nm调Q倍频Nd:YAG激光损伤后12h、24h、3d、7d、14d、28d取眼球,用HE染色、免疫组织化学染色观察视网膜组织形态及TrkA、TrkC和p75NTR蛋白在激光损伤视网膜中的变化。结果TrkA、TrkC和p75NTR在激光损伤视网膜时均有表达,且呈动态变化。TrkA主要分布于视网膜内侧的节细胞核、M櫣ller细胞内侧端突起及内核层内侧端其他细胞(如双极细胞);TrkC主要分布于外核层,位于细胞浆中;p75NTR主要分布于外核层M櫣ller细胞外侧端突起。结论TrkA、TrkC和p75NTR受体表达参与激光损伤视网膜的病理过程。     

新的白血病相关基因LRP15真核表达载体构建及在K562细胞中的表达

 目的构建LRP15基因开放阅读框架(ORF)序列的真核表达载体,并观察其在K562细胞中的表达情况.方法采用RT-PCR方法自1例白血病患者中克隆LRP15cDNA片段,将目的基因LRP15克隆入pGEM-T载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定.将鉴定过的DNA片段插入真核质粒pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA-LRP15.脂质体介导法将其转染K562细胞,72 h以RT-PCR方法检测转染细胞中LRP15基因的表达情况.结果酶切鉴定和序列分析证实,重组质粒含有人LRP15基因ORF序列;转染实验表明LR15基因能在K562细胞中表达.结论成功构建LRP15基因真核表达载体,并在K562细胞中获得表达,为进一步研究LRP15基因的功能奠定了基础.     

人宫颈癌HPC2基因的克隆及其原核和真核表达载体的构建

目的:构建人宫颈癌HPC2基因的原核及真核表达载体,进一步研究该基因在宫颈癌发生中的作用。方法:从人宫颈癌HeLa细胞中提取总RNA。用RT-PCR方法扩增出人宫颈癌HPC2全序列基因,插入pT7 b lue载体。酶切鉴定及序列分析后,构建人HPC2基因的原核及真核表达载体。结果:成功扩增出人宫颈癌HPC2基因;并构建pGEX4T1-HPC2原核表达载体及pCMV-F lag-HPC2真核表达载体。结论:人HPC2基因的原核及真核表达载体的构建为深入研究HPC2基因与宫颈癌的发生奠定了基础。     

重构型人caspase-8基因原核表达载体的构建及其表达

目的：构建三种重构型人caspase—8基因的原核表达载体，转染大肠杆菌并诱导其表达。方法：将人caspase—8催化结构域基因及两种大、小亚基基因次序颠倒的重构型人caspase—8基因克隆人原核表达载体pBV220，转染大肠杆菌并诱导表达。结果：成功构建了三种重构型人caspase—8基因的原核表达载体。转染大肠杆菌后，经温度诱导，重构型人caspase—8基因获得了高效的表达。结论：在大肠杆菌中成功表达了三种重构型人caspase—8基因。     

人PD-1分子基因克隆及其在COS-7细胞中表达的研究

目的：克隆人PD—1分子的编码序列cDNA，将其重组进真核表达载体中，并表达于COS—7细胞。方法：从活化的人T细胞cDNA文库中以PCR方法克隆编码人PD—l的编码cDNA序列，将其克隆进真核表达载体pcDNA3．1( )，构建成重组表达载体。并测序证实。用脂质体法转染COS—7细胞，流式细胞仪检测PD—1分子的膜表达。结果：PCR方法扩增出—880bp左右的基因片段，插入pcDNA3．1( )载体后构建成重组表达质粒，经测序证实扩增的片段为人PD—l编码序列。将重组质粒转染COS—7细胞，流式细胞仪检测显示有21．10％的细胞表达人PD—1分子。结论：本研究为进一步研究PD—1分子在免疫耐受、自身免疫性疾病中的作用奠定了基础。     

人中性粒细胞多肽1真核表达载体的构建与表达

目的 构建人中性粒细胞多肽1(HNPl)基因真核表达载体,为探讨HNP1基因工程生产的可能性奠定基础。方法 从健康人中性粒细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出HNPl基因cDNA片段,将纯化PCR产物与pMD18-T载体连接,经酶切鉴定及测序确证,将其亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO中．用脂质体转染CA3S-7细胞,用BA-ELISA法检测转染细胞上清中HNP1的表达。结果 从人中性粒细胞中克隆出人HNP1基因,经测序分析与GenBank公布的人HNP1核苷酸序列完全一致,并在COS-7细胞中获高效瞬时表达。结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO／HNP1,为后续哺乳动物工程细胞株的建立奠定了实验基础。     

人表皮细胞生长因子基因真核表达质粒pcDNA3-hEGF的构建

目的 :构建人表皮细胞生长因子 (hEGF)基因真核表达质粒 ,为深入研究hEGF在组织修复中的分子调节机制及临床应用提供物质基础。方法 :含hEGFcDNA的pUC18-hEGF质粒于大肠杆菌JM10 9内扩增 ;提取及纯化pUC18-hEGF质粒 ;经DNA序列分析其所含hEGFcDNA ;限制性酶切hEGFcDNA片段 ,连接酶连接到真核表达质粒pcDNA3 -neo内 ,克隆出真核表达质粒pcDNA3 -hEGF ;再经限制性酶切鉴定hEGF表达质粒。结果 :提取及纯化的pUC18-hEGF质粒含有大小正确的hEGFcDNA碱基片段 ,其碱基序列为编码目的基因的正确序列 ;凝胶电泳结果证明已将此片段克隆到pcDNA3 -hEGF内。结论 :成功地构建了hEGF基因的真核表达质粒pcDNA3 -hEGF。     

S100A2全长基因真核表达载体pEGFP-N2-S100A2的构建及其在胃癌细胞系BGC-823中的表达

 目的 克隆S100A2 cDNA,构建pEGFP-N2-S100A2重组表达载体,转染胃癌细胞系BGC-823,为探讨其对胃癌细胞系的影响奠定实验基础.方法 应用RT-PCR 和DNA 重组技术构建pEGFP-N2-S100A2 融合蛋白表达载体,质粒经测序正确后,用脂质体转染BGC-823 细胞.结果 重组质粒经限制性酶切鉴定得到与S100A2全长基因长度一致(294 bp) 的酶切产物; 测序分析证实,重组质粒中含有一与GenBank 上登录的S100A2基因(NM-005978) 序列完全一致的序列,表明成功地完成了表达载体的构建; 荧光显微镜下可见转染的BGC-823 细胞有绿色荧光蛋白的表达.结论 构建完成真核表达载体pEGFP-N2-S100A2,S100A2基因在BGC-823细胞内成功表达.