Effects of cyclin D1 antisense oligodeoxyneucleotides on the growth and expression of G<Subscript>1</Subscript> phase regulators in gastric carcinoma cells

Summary To investigate the effects of Cyclin D1 antisense oligodeoxyneucleotides (ASODN) on the growth, cell cycle progression and expression of G₁ phase regulators in human gastric carcinoma cell lines SGC7901 and HS746T, phosphorothioate-modified Cyclin D1 ASODN were encapsulated by Lipofect AMINE2000 and transfected into gastric carcinoma cells. Dose-dependent inhibitory effects were induced by Cyclin D1 ASODN in two gastric carcinoma cell lines. Treatment of gastric carcinoma cells with 0.2 μmol/L CycliN D1 ASODN for 24 h could significantly inhibit their growthin vitro andin vivo, reduce expression of Cyclin D1mRNA to 26.3% (SGC7901) and 17.3% (HS746T) respectively. The percentage of cells in G₀/G₁ phase was increased as revealed by flow cytometry. Immunohistochemical staining showed that the expression of p21 was increased and the expression of Cyclin D1 and pRb was decreased in the two cell lines; the expression of p27 was increased in HS746T, but unchanged in SGC7901. Cyclin D1 ASODN could inhibit the growth and the expression of Cyclin D1 mRNA in gastric carcinoma cells, influence the cell cycle and expression of its regulators. SHUAI Xiaoming, male, born in 1972, Doctor in Charge     

人反义端粒酶RNA转染SGC-7901细胞后细胞周期调控基因表达的改变

目的：观察反义人端粒酶RNA(Human telomerase RNA components,hTR)转染的SGC－7901胃癌细胞（7901－ahTR)细胞周期调控基因表达的变化。方法 采用RT－PCR、Western印迹和免疫组化方法检测SGC－7901和7901－ahTR细胞p21、p27、p16、c-myc等基因mRNA和蛋白的表达。结果 反义hTR转染的7901细胞p21和p27表达增加,PCNA和c-myc表达下调,而cyclinD1和p16mRNA表达无明显变化。结论 抑制端粒酶活性能调节多种细胞周期调控基因的表达,从而抑制肿瘤细胞的增殖和诱导分化。     

survivin反义寡核苷酸诱导胃癌细胞凋亡及对多西他赛的增敏作用

目的探讨生存素（survivin）反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide,ASODN）对人胃癌细胞株SGC7901的凋亡诱导、对多西他赛的化疗增敏作用。方法设计合成特异性靶向survivin ASODN。将胃癌细胞株分为空白对照组（Sham组）、单纯脂质体对照组（Lip组）、正义寡核苷酸转染对照组（Lip-SODN组）、ASODN转染组（Lip-ASODN组）。转染48 h后,Western blot法检测各组细胞survivin表达情况,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,MTT法检测转染细胞对多西他赛的敏感性。结果脂质体介导survivin ASODN转染后的胃癌细胞survivin蛋白表达明显下降,细胞凋亡率明显高于各对照组（P〈0.05）,对多西他赛的IC50值明显低于各对照组（P〈0.05）,细胞生长抑制率明显高于各对照组（P〈0.05）。结论survivin ASODN转染胃癌细胞能下调survivin蛋白表达,诱导胃癌细胞凋亡,抑制细胞增殖,增强多西他赛化疗敏感性。     

生存素反义寡核苷酸对人胃癌细胞增殖的抑制作用

目的 探讨生存素（survivin）反义寡核苷酸（ASODN）对人胃癌细胞SGC7901增殖的抑制作用。方法 设计合成特异性靶向生存素的反义寡核苷酸。胃癌细胞株SGC7901分为4组：空白对照组、单纯脂质体对照组、正义链转染对照组、ASODN转染组。作用48h后收获各组细胞。Westernblot法检测各组细胞生存素表达情况，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，MTT法检测各组细胞的生长抑制率。结果 脂质体介导生存素反义寡核苷酸转染后的胃癌细胞出现生存素蛋白表达明显下降；ASODN转染组细胞凋亡率明显高于各对照组（P〈0．05），而各对照组问差异无显著性（P〉0．05）；ASODN转染组细胞的抑制率明显高于各对照组（P〈0．05），而各对照组问差异无显著性（P〉0．05）。结论 生存素反义寡核苷酸转染胃癌细胞能下凋生存素蛋白表达，诱导胃癌细胞凋亡，抑制细胞增殖，具有明显的抗癌作用。     

Bmi-1基因RNA干扰对胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响

目的构建针对Bmi-1基因的RNAi表达载体,观察其对胃癌细胞SGC-7901增殖和凋亡的影响。方法利用慢病毒表达体系pHelperl．0／pHelper2．0／pGCL—GFP,成功构建针对Bmi-1基因的RNAi重组质粒vshRNA—Bmi-1,适时定量PCR（real—timePCR）检测稳定转染后胃癌细胞SGC-7901中Bmi-1mRNA表达,流式细胞术检测细胞凋亡,MTr法检测其增殖能力。结果稳定转染vshRNA—Bmi-1后SGC-7901细胞Bmi-1mRNA表达明显下降,总抑制效率达85％;癌细胞增殖减慢,凋亡率明显增加。结论构建针对Bmi-1基因的RNAi表达载体,成功转染胃癌细胞SGC-7901,可促进癌细胞凋亡,抑制其增殖能力。     

TGFα对胃癌细胞cyclin E和cyclin D1表达的影响

目的 探讨TGFα对胃癌细胞cyclinE和D1表达的促进作用，为研究TGFα促胃癌发生发展机制提供重要信息。方法 ①细胞体外培养，用无血清RPMI-1640阻断法进行G0／G1期同步化，用碘化丙啶染色和流式细胞术，检测其同步化率；②细胞经G0／G1期同步化后，给予2.5％低浓度血清＋RPMI-1640培养处理，以及在此基础上分别加入10、30、50μg／L TGFα处理，均作用5h；用免疫荧光染色及流式细胞术，检测细胞cyclinE和D1的表达情况。结果 细胞经无血清RPMI-1640阻断法处理，其G0／G1期的百分率由常规培养的54％上升到72％；加入TGFα处理后，细胞cyclinE和D1表达均显著高于单用低血清培养（均P〈0.001），并随TGFα剂量的增加而增加；当TGFα浓度为50μg／L时，两者的表达与单用低血清培养比，分别增加了25.18％和27.52％（均P〈0．001）。结论 TGFα可显著促进胃癌细胞cyclinE和D1的表达，从而发挥其促细胞周期进程的作用。     

黄芪超滤膜提取物对人SGC7901胃癌细胞增殖及转移的影响

目的：研究黄芪超滤膜提取物对人SGC7901胃癌细胞增殖和转移的影响。方法：应用四氮唑蓝比色法（MTT法）测定黄芪超滤膜提取物对人SGC7901胃癌细胞增殖的抑制作用,应用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法、Western-Blot法研究黄芪超滤膜提取物对SGC7901胃癌细胞环氧化酶（COX-2）、血管内皮生长因子-c（VEGF-c）表达的影响。结果：黄芪超滤膜提取物对SGC7901胃癌细胞的增殖有一定的抑制作用,使SGC7901胃癌细胞阻滞于G0/G1期,对SGC7901胃癌细胞COX-2、VEGF-c的表达有显著抑制作用。结论：黄芪超滤膜提取物能有效抑制SGC7901胃癌细胞的增殖周期,并可抑制COX-2、VEGF的表达。     

组蛋白脱乙酰基酶抑制剂丁酸钠对胃癌细胞系生长及p16基因表达的影响

目的 探讨组蛋白脱乙酰基酶抑制剂丁酸钠(NaB)对体外培养的胃癌细胞系SGC7901和BGC823生长及p16基因表达的影响.方法 应用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期分布,膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素染色法检测细胞凋亡率,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白质印迹法检测p16基因mRNA及蛋白质表达,甲基化特异性PCR法(MSP)检测p16基因的甲基化状态.结果 NaB处理后SGC7901和BGC823细胞生长受到抑制,1×10-3,3×10-3,5×10-3mol/L NaB处理72 h后两株细胞G0/G1期细胞数量显著增加,S期细胞数显著降低(P<0.01),呈现G1阻滞,各浓度组细胞凋亡率均显著增加(P<0.01).p16基因在SGC7901及BGC823细胞中低表达,启动子区呈异常甲基化状态,NaB处理后在两株细胞中表达均增强.结论 NaB对胃癌细胞具有生长抑制作用,其机制可能与阻滞细胞周期、诱导凋亡及上调p16基因表达有关,NaB可能通过增加组蛋白乙酰化水平及甲基化下调增加胃癌细胞中p16基因的表达.     

脂肪酸-辅酶A连接酶4的表达与胃癌细胞增殖、凋亡的关系

目的:研究脂肪酸-辅酶A连接酶4(FACL4)在胃癌中的表达,及其与8-溴-环腺苷酸(8-Br-cAMP)调控胃癌细胞增殖、凋亡的关系。方法:采用逆转录聚合酶链反应技术,检测23例胃腺癌组织和癌旁正常胃黏膜、以及8-Br-cAMP作用SGC7901细胞后FACL4 mRNA的表达水平。应用流式细胞仪及透射电镜技术,检测2×10-5mol/L浓度的8-Br-cAMP作用48 h后SGC7901细胞的凋亡情况。结果:与正常胃黏膜相比,胃腺癌组织及SGC7901细胞中FACL4 mRNA表达水平显著上调(P<0.05),胃腺癌组织FACL4 mRNA阳性表达率为87%。2×10-5mol/L的8-Br-cAMP可抑制SGC7901细胞中FACL4的表达,从而抑制胃癌细胞增殖,诱导细胞凋亡。结论:FACL4在胃癌组织中表达增高,8-Br-cAMP作为选择性FACL4抑制剂,可抑制胃癌细胞增殖和FACL4表达,诱导胃癌细胞凋亡,可能成为胃癌诊治的一个新靶点。     

RNA干扰突变型p53基因对胃癌SGC7901细胞生物学行为的影响

目的:利用RNA干扰(RNAi)技术稳定沉默人胃癌SGC7901细胞中的突变型p53基因,观察其对细胞生物学行为的影响。方法:p53小干扰RNA(siRNA)重组质粒用脂质体介导法转染SGC7901细胞,另设未转染组和对照组。RT-PCR和Western blot分别检测p53基因mRNA和蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖情况及其对奥沙利铂药物敏感性的变化,流式细胞仪检测细胞周期分布和凋亡,平板克隆形成试验、裸鼠移植瘤成瘤实验分析细胞成瘤性变化。结果:p53 siRNA可显著下调SGC7901细胞中突变型p53基因mRNA和蛋白的表达,实验组较未转染组和对照组细胞生长曲线左移。实验组的G0/G1期细胞数较对照组和未转染组分别减少7.4%和6.7%,进入S期的细胞数增加17.2%,奥沙利铂诱导的细胞凋亡率明显降低,未转染组、对照组和实验组细胞的IC50分别为15.88μmol/L、14.32μmol/L和20.34μmol/L。与未转染组和对照组相比,实验组细胞平板克隆形成数量显著增多,裸鼠体内细胞成瘤性增加。结论:p53 siRNA可有效抑制突变型p53基因在胃癌SGC7901细胞中的表达,但利用RNA干扰技术靶向突变型p53基因在胃癌的治疗上尚存在不确定性。     

全反式维甲酸对人胃癌细胞株caveolin-1表达和定位的影响

目的探讨全反式维甲酸(ATRA)对人胃癌细胞株SGC7901的增殖及对胞膜蛋白caveolin-1表达和定位的影响。方法 MTT法检测不同浓度(5、10、25μmol/L)ATRA对SGC7901细胞增殖的影响;免疫荧光法检测cavolin-1在细胞中的定位,Western blot检测caveolin-1的表达。结果 ATRA可明显抑制人胃癌细胞株SGC7901的增殖。ATRA处理3 d后,SGC7901细胞caveolin-1的表达无明显变化,但caveolin-1在胞浆中的分布明显降低,胞膜上分布明显增加。结论 ATRA可明显抑制SGC7901的增殖,促进caveolin-1在细胞膜上定位。     

Gli1基因在胃癌组织中的表达及其对胃癌细胞生物学特性的影响

目的：探讨胶质瘤相关癌基因1（Gli1）在胃癌组织中的表达,阐明Gli1基因对胃癌细胞增殖和迁移能力的影响。方法：收集95例胃癌患者胃癌组织和癌旁组织,RT-qPCR法检测胃癌组织和癌旁组织中Gli1mRNA表达水平,免疫组织化学法检测胃癌组织和癌旁组织中Gli1蛋白表达水平。以人胃癌细胞株MKN28、BGC823和SGC7901为研究对象,胃永生化上皮细胞株GES-1作为对照,RT-qPCR法检测各细胞株中Gli1mRNA表达水平。将Gli1-siRNA转染BGC823细胞后,实验分为对照组、con-siRNA组和Gli1-siRNA组;RT-qPCR法检测各组细胞中Gli1mRNA表达水平,CCK-8检测细胞增殖情况,Transwell小室检测细胞迁移能力,Western blotting法检测各组细胞P27、基质金属蛋白酶2（MMP-2）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）蛋白的表达水平。结果：胃癌组织中Gli1mRNA表达水平和蛋白阳性表达率明显高于癌旁组织（t=27.606,P<0.01;χ²=54.782,P<0.01）。在GES-1、MKN28、SGC7901和BGC823细胞中Gli1mRNA表达水平比较差异有统计学意义（F=86.341,P<0.01）。Gli1-siRNA组Gli1mRNA表达水平明显低于对照组和con-siRNA组（F=48.322,P<0.01）。Gli1-siRNA组胃癌细胞增殖率明显低于对照组和con-siRNA组（F=54.428,P<0.01）。Gli1-siRNA组胃癌细胞的迁移数低于对照组和con-siRNA组（F=257.788,P<0.01）。与对照组比较,con-siRNA组细胞中P27、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平差异均无统计学意义（P>0.05）;与con-siRNA组比较,Gli1-siRNA组细胞中P27蛋白表达水平明显升高（t=-3.776,P=0.020）,MMP-2和MMP-9蛋白表达水平明显降低（t=3.479,P=0.025;t=5.487,P=0.005）。结论：Gli1在胃癌组织表达水平高于癌旁组织,抑制Gli1基因的表达能抑制胃癌细胞增殖和迁移能力。     

bcl—2 mRNA反义寡核苷酸对胃癌SGC—7901细胞端粒酶活性的影响

目的 探讨bcl-2反义寡核苷酸（antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotide,ASODN)对胃癌SGC－7901细胞端粒酶活性的影响。方法 应用脂质体瞬时转染法介导bcl-2反义寡核苷酸,处理人胃癌细胞系SGC－7901后,分别采用Northern blot、Western blot检测bcl-2 mRNA、蛋白表达,用端粒微孔板杂交法检测端粒酶活性。结果 bcl-2 ASODN处理的胃癌SGC－7901细胞端粒酶活性明显受到抑制,并与ASODN的浓度和处理时间有关。结论 bcl-2反义寡核苷酸可抑制胃癌细胞端粒酶活性。     

miRNA-34a 对人胃癌 SGC-7901细胞增殖、凋亡的影响

目的：研究 microRNA-34a(mir-34a)在人胃癌细胞中的表达水平及对胃癌 SGC-7901细胞增殖、凋亡的影响。方法通过实时定量 PCR(RT-PCR)检测人正常胃黏膜上皮细胞 GES 及人胃癌细胞株 AGS、SGC-7901、MKN-45、BGC-823中 mir-34a 的表达水平。体外将表达人 mir-34a ( has-mir-34a)慢病毒感染人胃癌 SGC-7901细胞。荧光显微镜观察评估细胞感染情况,MTT 实验、流式细胞术检测感染后胃癌SGC-7901细胞的增殖、细胞周期及凋亡情况。结果胃癌细胞 AGS、SGC-7901、MKN-45、BGC-823中 mir-34a 的表达水平较正常胃黏膜上皮细胞 GES 明显降低,其中以胃癌 SGC-7901细胞降低最为明显(P <0．01)。与阴性对照组相比, mir-34a 感染组 SGC-7901细胞增殖明显减慢( P <0．01), G1/ G0期细胞比例显著增加(P <0．05),细胞凋亡率显著升高(P <0．01)。结论 mir-34a 在多种人胃癌细胞,尤其是SGC-7901细胞中呈低表达。 mir-34a 可以抑制胃癌 SGC7901细胞的增殖,诱导细胞周期停滞及细胞凋亡。     

西达本胺对胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡及Notch1、Sirt1基因表达的影响研究

目的:通过研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂西达本胺对Notch1、Sirt1基因表达的影响来探讨其对胃癌细胞株SGC-7901的体外抗增殖作用。方法:采用MTT法观察不同浓度西达本胺对SGC-7901细胞增殖抑制作用,流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率,RT-PCR检测Sirt1基因表达情况,蛋白质印迹法检测Notch1蛋白表达情况。结果:西达本胺在体外可抑制胃癌细胞SGC-7901增殖,呈浓度、时间依赖性;其可促进细胞凋亡,减少Sirt1基因的表达,下调Notch1蛋白的表达。结论:西达本胺可通过抑制Sirt1基因表达、下调Notch1蛋白的表达来抑制细胞增殖、促进细胞凋亡而发挥体外抗胃癌作用。     

鬼臼毒素抗胃癌细胞株SGC 7901作用的实验研究

目的:研究鬼臼毒素抗胃癌SGC 7901细胞株的作用,为鬼臼毒素用于临床治疗胃癌提供依据.方法:不同浓度的鬼臼毒素(0,5,10,20和50mg/L)处理SGC 7901细胞后,采用MTT比色法和平板克隆形成实验检测细胞的增殖;采用流式细胞术检测细胞周期分布和细胞凋亡;裸鼠成瘤实验检测鬼臼毒素对SGC 7901细胞体内致瘤能力的影响.结果:鬼臼毒素呈时间与剂量依赖性抑制SGC 7901细胞生长,明显降低SGC 7901细胞平板克隆,显著诱导SGC 7901细胞凋亡,并使SGC 7901细胞阻滞于G2/M期,还能显著降低SGC 7901细胞裸鼠移植瘤的体积及质量.结论:鬼臼毒素能抑制胃癌SGC 7901细胞的生长,诱导SGC 7901细胞凋亡,并能抑制GC7901细胞的体内致瘤能力,此为鬼臼毒素临床治疗胃癌提供了科学依据.     

SKI-Ⅱ对胃癌SGC7901细胞血管内皮生长因子表达影响实验研究

目的 观察应用SKI-Ⅱ对胃癌SGC7901细胞内血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）表达的影响并对其机制进行初步研究。方法 常规培养胃癌SGC7901细胞,给予不同浓度SKI-Ⅱ干预及DDP干预,MTT法测定各组胃癌SGC7901细胞增殖情况;免疫细胞化学和Western-blot检测药物作用对Sphk1、VEGF表达的影响。结果 MTT检测SGC7901细胞与不同浓度的SKI-Ⅱ共同培养,细胞的生长受到不同程度的抑制,其作用具有剂量依赖性,并随时间的延长逐渐增强,免疫组化及western-blot检测显示SKI-II作用后可显著下调肿瘤细胞SphK1和VEGF蛋白的表达,单用DDP对SphK1、VEGF无作用。结论 SKI-Ⅱ可以通过下调VEGF和Sphk1蛋白表达而有效抑胃癌SGC7901细胞增殖。     

多西紫杉醇对在体和离体人胃癌SGC7901细胞的作用机制的探索

目的探索多西紫杉醇对在体和离体人胃癌SGC7901细胞的生长抑制作用及其机制。方法将人胃癌细胞种植于培养皿贴壁,用集落形成实验法观察其对体外培养的人胃癌细胞对细胞存活率的影响,光学显微镜和电子显微镜观察形态学改变,并通过流式细胞仪检测细胞周期变化。结果多西紫杉醇可以抑制SGC7901细胞于S期,抑制SGC7901细胞生长增殖,并呈浓度依赖性,差异统计学意义（P〈0.05）。结论多西紫杉醇能明显抑制SGC7901细胞增殖。     

Hsa_circ_0001947对胃癌细胞增殖和凋亡的影响

［摘要］目的: 探讨环状RNA hsa_circ_0001947(circ_0001947)在胃腺癌细胞和组织中的表达及其对胃癌细胞增殖和凋亡的影响。方法: 通过高通量测序筛选出5例临床胃腺癌、癌旁组织标本中差异表达的5种环状RNA,挑选升高表达最明显的circ_0001947继续研究。实时荧光定量PCR检测circ_0001947在75例临床胃腺癌、癌旁组织以及胃癌BGC-823,HGC-27,MGC-803,SGC-7901细胞株、正常人胃黏膜上皮GES-1细胞株中的表达。将细胞株BGC 823、SGC 7901各分为两组,设si circ_0001947组(转染si RNA)和si NC组(转染无关序列)。细胞培养0、12、24、48、72 h后,采用CCK 8实验测定细胞活力。采用克隆形成实验测定细胞增殖能力;流式细胞术测定细胞凋亡率,蛋白印迹测定凋亡相关蛋白Cleaved-caspase-3,Bcl-2和Bax表达水平。结果： 高通量测序筛选出的胃腺癌组织中差异表达的环状RNA为hsa_circ_0000033,hsa_circ_0000038,hsa_circ_0004916,hsa_circ_0058092,hsa_circ_0001947。circ_0001947在胃腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P<0.01),在胃癌BGC-823,HGC-27,MGC-803,SGC-7901细胞株中表达量明显高于正常胃黏膜上皮GES-1细胞株(P均<0.05)。si RNA能够明显抑制BGC 823、SGC-7901细胞中circ_0001947表达。si-circ_0001947组BGC 823,SGC-7901细胞光密度值明显低于si-NC组(P均<0.01);si circ_0001947组BGC 823,SGC-7901细胞克隆形成率和细胞凋亡率明显低于si NC组(P均<0.01)。与si-NC组相比,si-circ_0001947组BGC 823,SGC 7901细胞中Cleaved caspase-3 及Bax表达明显上调,Bcl 2表达明显下调(P均<0.05)。结论： circ_0001947在胃癌细胞和组织中呈高表达,干扰circ_0001947表达可抑制胃癌细胞增殖并诱导其凋亡。     

HO-1siRNA表达载体的构建及其稳定转染SGC7901细胞系的建立

目的:构建携带绿色荧光蛋白的HO-1基因siRNA表达载体,通过将载体转染入胃癌细胞株SGC7901筛选稳定转染细胞株.方法:参照前期工作,构建可用于筛选阳性克隆并带有绿色荧光的HO-1基因siRNA表达载体,采用脂质体转染法将载体转入SGC7901细胞中,并用G418进行阳性克隆筛选,获得稳定转染细胞系.结果:经酶切和测序验证,证实表达载体构建成功,将HO-1 siRNA表达载体转入SGC7901后,通过G418筛选获得稳定转染细胞系,经检测HO-1的表达水平明显低于为未转染的细胞.结论:本实验成功地构建了HO-1基因siRNA表达载体,筛选出HO-1基因沉默的稳定转染胃癌细胞系,为今后研究HO-1基因的作用机制提供了实验基础.