姜黄素对肠上皮细胞屏障损伤保护作用的研究

背景:肠上皮紧密连接的破坏及其所致的肠黏膜屏障功能受损在肠道疾病的发病中起重要作用,姜黄素对受损的肠黏膜屏障具有保护作用。目的:探讨姜黄素对乙醇诱导的肠黏膜屏障损伤的保护作用。方法:培养Caco-2细胞以制备体外肠上皮细胞屏障模型,将其分为空白对照组、乙醇组和不同浓度姜黄素治疗组(5、20、80μmol/L)。以单层上皮的跨上皮细胞电阻(TEER)和荧光素钠透过率评估肠上皮屏障功能;蛋白质印迹法和免疫荧光法分别检测Occludin蛋白表达和定位;透射电镜观察细胞结构。结果:与空白对照组相比,乙醇组TEER降低,荧光素钠透过率显著升高(P0.05),Occludin蛋白表达显著降低(P0.05);免疫荧光法示Occludin蛋白表达不连续,荧光强度减弱;透射电镜示刷状缘排列紊乱,细胞间连接模糊。经姜黄素治疗后,上述指标均显著改善,其中20μmol/L姜黄素治疗组的疗效最为明显(P0.05)。结论:姜黄素对乙醇诱导的肠上皮细胞屏障损伤具有保护作用。     

过表达Atg5蛋白对巨噬细胞泡沫化程度的影响

目的探讨过表达Atg5蛋白对巨噬细胞泡沫化程度的影响。方法采用Atg5慢病毒和对照组病毒感染Raw264.7巨噬细胞,建立对照细胞系(对照组)和Atg5过表达细胞系(观察组)。两组细胞分别加入50 mL/L ox-LDL诱导形成泡沫化细胞。采用Western blot分析两组细胞蛋白p62、LC3、CD36和SR-A的变化;采用高效液相法检测两组细胞内胆固醇脂(CE)、游离胆固醇(FC)和总胆固醇(TC)的变化;采用免疫荧光和电子显微镜分析两组细胞内脂滴的含量;采用ELISA检测两组细胞培养上清中炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平。结果与对照组比较,观察组细胞自噬底物p62水平显著下调,LC3-II水平显著上调(P0.05)。与对照组比较,观察组巨噬细胞CE、FC和TC含量均显著下调(P0.05)。观察组细胞脂质水平和脂滴的数量较对照组明显下降(P0.05)。与对照组比较,观察组细胞炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平显著下调(P0.05)。结论自噬核心蛋白Atg5过表达可显著提高巨噬细胞自噬水平,可能通过自噬降解胞内胆固醇等脂质,预防巨噬细胞泡沫化,进而降低动脉粥样硬化的发生。     

西罗莫司对肝脏热缺血-再灌注损伤小鼠肝组织TLR4表达和细胞自噬功能的影响*

目的 探讨西罗莫司对肝脏热缺血-再灌注(I/R)损伤小鼠肝组织Toll样受体4(TLR4)表达和细胞自噬功能的影响。方法 将40只Balb/c小鼠随机分为对照组、模型组、小剂量西罗莫司干预组(1 mg.kg^-1)和大剂量西罗莫司干预组(3 mg.kg^-1),每组10只,采用手术夹闭小鼠Glison鞘左支和中支1 h构建部分肝脏I/R模型,其中干预组在造模前2 d腹腔注射西罗莫司。采用ELISA法检测血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素6(IL-6)含量,采用Western blot法检测肝组织TLR4、核因子κB(P65)、磷酸化核因子κB(p-P65)、微管相关蛋白1轻链3B-Ⅱ(LC3B-Ⅱ)和P62蛋白表达,使用透视电镜检测肝组织自噬小体数量。结果 在恢复灌注6 h后,模型组小鼠血清ALT、AST、TNF-α和IL-6水平分别为(1370.6±245.7)U/L、(1584.3±321.5)U/L、(69.4±8.8)pg/mL和(154.1±22.7)pg/mL,显著高于对照组【分别为(34.31±4.3)U/L、(72.8±13.9)U/L、(10.7±3.4)pg/mL和(36.2±6.9)pg/mL,P<0.05】,而小剂量和大剂量西罗莫司干预组血清ALT和AST水平均显著低于模型组(P<0.05);模型组小鼠肝组织TLR4蛋白表达和p-p65/p65比值均较对照组显著升高(P<0.05),小剂量和大剂量西罗莫司干预组小鼠均较模型组显著降低(P<0.05),而LC3B-Ⅱ、P62蛋白表达和自噬小体数量均较模型组显著增加(P<0.05)。结论 西罗莫司可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路激活抑制炎症反应,同时通过诱导肝细胞自噬,有效减轻小鼠部分肝脏热缺血-再灌注损伤。     

慢性阻塞性肺疾病患者IL-6、IL-8、TNF-α水平与支气管黏膜自噬的相关性分析

目的研究慢阻肺患者炎症因子与支气管黏膜组织自噬作用之间的相关性。方法选取上海交通大学医学院附属新华医院呼吸科20例慢阻肺患者和10例健康者,分为3组:A组(轻度+中度组)、B组(重度+极重度组)和对照组。采集血、肺泡灌洗液(BALF)、支气管黏膜组织。检测血清、BALF中炎症因子水平及支气管黏膜组织自噬作用。结果 (1)与对照组相比,血清IL-6、IL-8及TNF-α在A组无统计学意义,B组明显增高(IL-6P0.05,IL-8、TNF-αP0.01)。BALF中A组和B组IL-6水平均明显升高(P0.05),B组IL-8及TNF-α水平明显增高(TNF-αP0.05,IL-8P0.001);(2)与对照组相比,A组、B组中Atg5的mRNA及Beclin1的蛋白表达在均显著低于对照组(P0.01),LC3B的蛋白表达均显著降低(A组P0.05,B组P0.01),而P62的mRNA及蛋白表达均显著增加(P0.01);(3)血清、BALF中IL-8水平与支气管黏膜自噬作用呈负相关(r0,P0.01)。结论 IL-6、IL-8、TNF-α在慢阻肺的进展过程中明显升高。自噬作用在慢阻肺的进展过程中明显降低。IL-8水平的升高可能与慢阻肺患者自噬受损有关。     

氧化型低密度脂蛋白通过Akt/mTOR/p70S6K通路诱导血管内皮细胞自噬

目的 探讨氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, oxLDL)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)自噬和Akt/mTOR/p70S6K信号通路的影响.方法 将培养的HUVECs分为oxLDL组和对照组,分别用100 μg/ml oxLDL和等体积磷酸盐缓冲液处理.在培养6 h和12 h后收集细胞.应用透射电子显微镜观察自噬小体,实时荧光定量聚合酶链反应检测微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)和p62 mRNA表达,应用蛋白质印迹法检测LC3、p62、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR和p-p70S6K/p70S6K蛋白表达.结果 与对照组相比,oxLDL处理组细胞内的自噬小体数量明显增多(P<0.05),LC3 mRNA及蛋白表达水平均显著增高(P均<0.05),而p62 mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P均<0.05).此外,oxLDL处理组Akt、mTOR、p70S6K磷酸化蛋白表达水平均较对照组显著降低(P均<0.01),但Akt、mTOR和p70S6K总蛋白表达水平与对照组无显著差异.结论 oxLDL可通过抑制Akt/mTOR/p70S6K信号通路诱导HUVECs自噬.     

动力相关蛋白1通过诱导线粒体自噬对高糖导致心肌细胞损伤的影响

目的明确动力相关蛋白(Drp)1通过诱导线粒体自噬对高糖条件下心肌细胞起保护作用。方法以Lac Z空病毒(LV-Lac Z)或Drp1过表达腺病毒(LV-Drp1)转染大鼠原代心肌细胞24 h,再用含葡萄糖(5.5 mmol/L)的正常培养基(NG)或含葡萄糖(33 mmol/L)的高糖培养基(HG)处理大鼠心肌细胞72 h。实验分组:1:(1)阴性对照(NG+Lac Z)组;(2)正常Drp1过表达(NG+Drp1)组;(3)高糖阴性对照(HG+Lac Z)组;(4)高糖Drp1过表达(HG+Drp1)组。采用免疫荧光法检测自噬体数量,用JC-1染色法检测线粒体膜电位水平,采用Western blot法检测Drp1、Parkin(一种E3泛素化连接酶),微管相关蛋白1轻链3(LC3)、p62蛋白表达水平,TUNEL法检测细胞凋亡率。结果与对照组相比,高糖处理组自噬体数量明显减少(P0.05),线粒体膜电位显著下降(P0.05),线粒体自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Parkin水平下调(P0.05),Drp1,P62表达水平显著增高(P0.05),心肌细胞凋亡率升高(P0.05);与高糖组比较,Drp1过表达组可显著增加自噬体数量(P0.05),线粒体膜电位上升(P0.05),Drp1,Parkin,LC3-Ⅱ表达水平显著上升(P0.05),P62水平显著下降(P0.05),心肌细胞凋亡率下降(P0.05)。结论高糖可引起SD大鼠原代心肌细胞自噬水平降低和线粒体功能障碍,是糖尿病心肌病发病机制之一。Drp1通过提高线粒体自噬水平改善线粒体功能,降低高糖条件下心肌细胞凋亡率。     

巴西苏木素调控自噬对高糖诱导血管内皮细胞损伤的影响

目的探讨巴西苏木素对高糖诱导血管内皮细胞损伤的保护作用及其可能机制,为中药苏木治疗糖尿病大血管病变提供实验依据。方法培养人脐静脉内皮细胞,采用MTT法确定巴西苏木素浓度,高糖诱导损伤后加入巴西苏木素,透射电镜观察自噬体;小管形成实验观察血管生成;蛋白免疫印迹检测自噬相关基因BECLIN1、LC3-Ⅱ、p62蛋白的表达。结果选定用于实验的巴西苏木素浓度为15 mg/L;透射电镜显示高糖组细胞中自噬体数量较对照组少,而巴西苏木素组细胞中自噬体数量较对照组和高糖组多;BECLIN1、LC3-Ⅱ的蛋白表达在高糖组较对照组低,在巴西苏木素组较高糖组高(P0.05);p62的蛋白表达在高糖组较对照组高,在巴西苏木素组较对照组和高糖组低(P0.05)。结论巴西苏木素可能通过调控自噬而对高糖诱导血管内皮细胞损伤发挥保护作用。     

内源性二氧化硫抑制血管紧张素Ⅱ致心肌肥厚小鼠心肌细胞自噬的研究

目的探讨内源性二氧化硫(SO_2)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)致心肌肥厚小鼠心肌细胞自噬的抑制作用。方法 9周龄健康C57BL小鼠16只,按随机数字表法随机分为野生型对照组(WT Con组)、野生型+AngⅡ组(WT AngⅡ组);心肌特异性天冬氨酸氨基转移酶2(AAT2)转基因小鼠16只,按随机数字表法随机分为AAT2对照组(AAT2 Con组)、AAT2+AngⅡ组(AAT2 AngⅡ组)。每组8只。每只小鼠在背部皮下植入预装生理盐水或AngⅡ的胶囊渗透压泵,连续给药4周。检测4组小鼠全心重/体重(HW/BW)比值;HE染色观察心肌细胞结构变化;免疫组织化学染色检测心肌标志分子α重链肌球蛋白(α-MHC)的表达;高效液相色谱检测心肌组织SO_2含量;Western blot检测内源性SO_2生成酶AAT1和AAT2、心肌表型标志分子α-MHC和β-MHC以及心肌自噬标志分子Beclin-1、LC3、Atg4B以及p62蛋白表达变化。结果与WT Con组相比,WT AngⅡ组心肌组织SO_2含量显著降低(P0.01),AAT1蛋白表达无明显变化(P0.05),AAT2蛋白表达显著减少(P0.05),HW/BW明显增加(P0.01),心肌纤维明显增粗,免疫组织化学法显示心肌细胞浆中α-MHC蛋白表达明显减弱,Western blot结果显示心肌细胞α-MHC蛋白表达显著降低(P0.01),β-MHC蛋白表达显著升高(P0.01),心肌组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著升高,Beclin-1和Atg4B蛋白表达显著升高,p62蛋白表达显著降低(均P0.01)。与WT Con组相比,AAT2 AngⅡ组小鼠心肌组织SO_2含量和AAT2蛋白表达显著升高(P0.01),AAT1的蛋白表达无显著变化(P0.05),HW/BW显著降低(P0.05),心肌纤维的增粗显著减轻,α-MHC蛋白向β-MHC蛋白的转化显著降低(P0.01),心肌细胞自噬水平显著降低。结论内源性SO_2/AAT2体系可抑制AngⅡ致小鼠心肌肥厚及心肌细胞自噬。     

辛芍组方对缺血/再灌注损伤的神经细胞炎症反应和氧化应激的影响

目的 探讨辛芍组方对缺血/再灌注损伤的神经细胞炎症反应和氧化应激的影响。方法 建立小鼠海马神经元HT22细胞氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)模型，不进行其他处理的作为模型对照(Con)组，使用不同浓度(0.31、0.62、1.25 mg/L)的辛芍组方处理建模后的HT22细胞，作为0.31 mg/L组、0.62 mg/L组、1.25 mg/L组。正常培养的HT22细胞作为正常(Normal)组。采用细胞计数(CCK)-8试剂盒检测细胞活性；采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、IL-1β炎症因子水平；采用试剂盒检测过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。采用Western印迹检测微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3Ⅱ)、自噬相关蛋白(P62)、低氧诱导因子(HIF)-1α蛋白表达；采用荧光显微镜检测细胞自噬体数量。结果 与Normal组比较，Con组细胞OD值显著降低，TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著升高，MDA含量显著升高，CAT、SOD活性显著降低，LC3Ⅱ蛋白表达和自噬小体数量显著升高，P62...     

探讨心力衰竭不同阶段自噬水平变化

目的:探讨心力衰竭发展过程中心肌细胞自噬是如何变化的。方法:8~10周的雄性C57BL/6小鼠,体重控制在24~26g,经主动脉缩窄(AB)构建心肌肥厚模型,分别于不同时间点(0天、1周、3周、4周及8周)运用超声心动图评估小鼠心功能;Western blot检测心脏组织中LC3B-Ⅱ/GAPDH比值、beclin-1及P62蛋白水平;同时运用电子显微镜检测心肌细胞中自噬小体数量。结果:AB术后第1周,心脏组织中LC3B-Ⅱ/GAPDH及beclin-1的表达下降(P0.05),心脏组织中p62表达水平升高(P0.05),这种变化一直持续到术后3周(P0.05);但在第4周时,LC3B-Ⅱ/GAPDH比值在手术组和非手术组中无明显差异,而手术组心脏组织中beclin-1的表达量较非手术组高;而术后第8周时,LC3B-Ⅱ/GAPDH及beclin-1的表达均升高(P0.05),p62明显降低(P0.05)。此外,运用电子显微镜检测心脏组织中自噬小体数量,发现AB术后3周内自噬小体减少,第4周时,自噬小体数量开始增多,第8周时明显增多。结论:心肌肥厚过程中,自噬水平下降;AB术后第4周,心功能逐步由代偿转变为失代偿,而在心力衰竭时,心脏组织中自噬水平明显升高。     

糖尿病大鼠主动脉自噬水平的变化及雷帕霉素的干预作用

目的观察糖尿病大鼠主动脉自噬水平的变化及雷帕霉素的干预作用,探讨雷帕霉素是否通过调节自噬、内质网应激和细胞凋亡对糖尿病大鼠主动脉产生保护作用。方法雄性SD大鼠用随机数字表法分为正常对照组、糖尿病组和雷帕霉素干预组。采用链脲佐菌素制备1型糖尿病大鼠模型。雷帕霉素干预组给予雷帕霉素2mg/(kg·d)灌胃。于实验第8周留取血标本,用于血生物化学指标和脂联素水平检测,然后处死动物并迅速取出胸主动脉和腹主动脉,测定主动脉Beclin1、微管相关蛋白轻链3(LC3)、p62、C/EBP同源蛋白(CHOP)、Caspase-12、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、Bax和Bcl-2的mRNA和蛋白表达。结果与正常对照组比较,糖尿病组大鼠血清脂联素水平显著降低(P0.05),主动脉壁增厚,内皮严重受损,主动脉Beclin1、LC3的mRNA和蛋白表达水平及Bcl-2mRNA表达水平显著降低(P 0. 05),主动脉p62、CHOP、Caspase-12和GRP78的mRNA和蛋白表达水平及Bax mRNA表达水平显著升高(P0.05)。与糖尿病组比较,雷帕霉素干预组大鼠血清脂联素水平显著升高(P0.05),主动脉组织病理改变显著减轻,主动脉Beclin1、LC3的mRNA和蛋白表达水平及Bcl-2 mRNA表达水平显著升高(P0.05),主动脉p62、CHOP、Caspase-12和GRP78的mRNA和蛋白表达水平及Bax mRNA表达水平显著降低(P0.05)。结论糖尿病大鼠主动脉组织自噬水平降低,雷帕霉素可能通过激活自噬和减轻内质网应激和细胞凋亡水平对糖尿病大鼠主动脉产生保护作用。     

贝母素甲对小鼠脑缺血再灌注损伤炎症反应及自噬的影响

目的通过探讨贝母素甲(PM)对小鼠脑缺血再灌注损伤(CIRI)的炎症反应和自噬的影响。方法 SPF级,健康C57BL小鼠144只,按体重随机分为假手术组、模型组、阿司匹林(ASA)组、PM低、中、高剂量组。使用颈内动脉线栓法建立小鼠脑缺血再灌注损伤模型,其中PM低、中、高剂量组于造模前3 d分别灌胃给药1 mg/(kg·d),2 mg/(kg·d),4 mg/(kg·d),ASA组灌胃给药2 mg/(kg·d),观察各组小鼠行为学、脑梗死体积、脑组织水含量和脑组织海马的病理形态学的变化,测定脑组织中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-10和自噬蛋白LC3-Ⅱ的表达。结果与假手术组比较,模型组小鼠脑组织病理损伤严重,行为学评分明显升高(P0.01),TNF-α和IL-1β含量明显升高(P0.05),IL-10含量和自噬蛋白LC3-Ⅱ的表达量显著降低(P0.01);与模型组比较,ASA组、PM给药组明显改善行为学评分,脑梗死率、脑组织水含量、脑匀浆TNF-α、IL-1β含量明显降低(P0.05),IL-10含量和自噬蛋白LC3-Ⅱ的表达量显著升高(P0.01),且呈剂量依赖性。结论 PM对小鼠脑CIRI有较好的保护作用,其机制可能与抑制炎症反应和促进自噬有关。     

乌司他丁对过氧化氢诱导的肠上皮屏障损伤的保护作用

背景:肠上皮细胞间紧密连接的破坏及其所致的肠黏膜屏障功能受损在一系列胃肠道疾病的发生、发展中起重要作用。目的:探讨乌司他丁对过氧化氢(H_2O_2)诱导的肠上皮屏障损伤的保护作用。方法:以Caco-2细胞体外培养制备肠单层上皮屏障模型,将其分为空白对照组(不予干预)、H_2O_2组(500μmol/L H_2O_2)和低浓度(500 U/mL)、高浓度(3 000 U/mL)乌司他丁治疗组并予相应处理。检测丙二醛(MDA)水平、超氧化物歧化酶(SOD)活性,以跨上皮细胞电阻(TEER)和荧光素钠透过率评估上皮屏障功能,蛋白质印迹法和免疫荧光法检测紧密连接蛋白ZO-1、occludin的表达和定位,透射电镜观察紧密连接超微结构。结果:与空白对照组相比,H_2O_2组Caco-2细胞单层上皮MDA水平、荧光素钠透过率明显升高,SOD活性、TEER、ZO-1和occludin蛋白表达明显降低,差异均有统计学意义(P0.05)。透射电镜观察和免疫荧光法检测显示H_2O_2组细胞刷状缘受损,细胞间连接模糊,ZO-1、occludin蛋白分布断续不完整,荧光强度低。乌司他丁治疗组上述指标均较H_2O_2组显著改善(P0.05),高浓度组改善更为明显。结论:乌司他丁对H_2O_2诱导的肠单层上皮屏障损伤有一定保护作用,其机制可能与其抗氧化活性以及调节紧密连接蛋白表达和分布有关。     

α-硫辛酸通过mTOR通路抑制缺血再灌注诱导的PC12细胞自噬性凋亡

目的研究α-硫辛酸(LA)对PC12细胞缺血再灌注损伤的保护作用及其分子机制。方法传代培养PC12细胞,PC12细胞缺氧/复氧(氧糖剥夺4 h,复氧18 h)模拟缺血再灌注损伤模型。实验分为正常组、缺氧/复氧组、缺氧/复氧+α-LA、缺氧/复氧+自噬抑制剂巴弗洛霉素(Baf)A1组。CCK8筛选α-LA的有效作用浓度;流式细胞术检测细胞凋亡变化;Western印迹检测细胞促凋亡蛋白B细胞淋巴瘤(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)、酶切caspase-3、自噬标志分子SQSTM-1/P62、LC3-Ⅱ/Ⅰ及mTOR通路的表达变化。结果缺氧/复氧显著降低PC12细胞的存活率(P<0.05),Western印迹结果显示Bax、酶切caspase-3、LC3-Ⅱ/Ⅰ的表达水平均显著升高(P<0.05),P62和p-mTOR的表达水平降低(P<0.05);与缺氧/复氧组比较,给予α-LA和Baf A1均能显著降低缺氧/复氧诱导的凋亡水平(P<0.05)。结论α-LA通过抑制缺氧/复氧诱导的过度自噬进而减少过度自噬诱导的细胞凋亡。     

羟基红花黄素A对缺血性心力衰竭大鼠心肌自噬及ERK1/2通路的影响

目的:探讨羟基红花黄素A(HSYA)对缺血性心力衰竭(IHF)大鼠心肌自噬及细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)通路的影响。方法:将72只大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性对照组(卡托普利组)、低剂量HSYA组(L-HSYA)、中剂量HSYA组(M-HSYA)、高剂量HSYA组(H-HSYA),每组12只。采用冠脉结扎法建立缺血性心力衰竭大鼠模型。超声仪检测大鼠左心室心功能水平,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清N-末端脑钠肽前体(NTpro BNP)和超敏肌钙蛋白(hs-TnT)水平,透射电镜观察心肌细胞自噬,Western blot法检测心肌组织自噬相关因子微管相关蛋白1(Beclin1)、微管相关蛋白轻链3(LC3)、泛素和LC3结合蛋白p62(p62)、ERK1/2蛋白表达。结果:与模型组比较,阳性对照组、M-HSYA和H-HSYA组大鼠左室收缩末期室间隔厚度(LVSs)、左室舒张末期室间隔厚度(LVSd)、收缩末期左心室后壁厚度(LVPWs)、舒张末期左心室后壁厚度(LVPWd)、左心室射血分数(LVEF)及LHSYA组LVSd显著升高(均P 0. 05);心电图T波幅度和ST段抬高幅度显著降低,QT间期显著缩短(均P 0. 05);大鼠血清NT-proBNP和hs-TnT水平显著降低(均P 0. 05),心肌细胞自噬小体数量减少,自噬率显著降低(P 0. 05);心肌组织Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达显著降低(均P 0. 05),p62和p-ERK1/2蛋白表达显著升高(均P 0. 05)。结论:IHF大鼠心肌损伤与自噬关系密切,HSYA可能通过激活ERK1/2信号通路抑制IHF大鼠心肌细胞自噬。     

外源性睾酮通过诱导自噬致大鼠肾脏损伤

目的 探索外源性睾酮(TP)致大鼠肾脏损伤的作用及可能机制.方法 SD雄性大鼠48只,随机分为6组(每组8只):control组、TP组、TP+氯喹(CQ)组、TP+甘草甜素(Gly)组、CQ(自噬抑制剂)组、Gly〔高迁移率族蛋白(HMG)B1抑制剂〕组.各组大鼠处理21 d后,测量其体重、肾脏湿重、计算肾脏指数;苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠肾脏组织病理形态学变化;免疫组化法和Western印迹印迹法分析大鼠肾脏组织自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ、Beclin1、P62、HMGB1的定位和表达情况.结果 与control组比较,TP组大鼠肾脏湿重、肾脏指数无明显变化(P>0.05);肾小球毛细血管襻多呈分叶状改变,肾小囊间隙变窄,肾小管上皮细胞水肿,管腔变窄;肾脏组织LC3B-Ⅱ、Beclin1和HMGB1蛋白表达水平上调(P<0.05),联合给予TP与CQ后,仅见少数肾小体血管球呈分叶状改变,肾小管水肿明显减轻;Beclin1、LC3B-Ⅱ和HMGB1蛋白表达水平均下调(P<0.05);TP+Gly组大鼠肾脏组织病理学改变及自噬相关蛋白表达水平结果 与TP+CQ组类似.结论 外源性TP可能通过上调细胞自噬致大鼠肾脏组织损伤的发生,HMGB1可能参与此过程自噬水平的调节.     

外源性雄激素通过诱导自噬促大鼠睾丸萎缩

目的探讨外源性雄激素对大鼠睾丸萎缩的影响及其可能机制。方法 48只SD雄性大鼠随机分成6组,每组8只:对照组(control)、雄激素(丙酸睾丸酮,TP)组、雄激素+氯喹(TP+CQ)组、雄激素+甘草甜素(TP+Gly)组、氯喹(CQ,自噬抑制剂)组、甘草甜素〔Gly,高迁移率族蛋白(HMGB) 1抑制剂〕组。各组分别处理21 d后,测量体重、睾丸湿重、睾丸指数;采用HE染色法观察睾丸组织病理学改变; Western印迹法大鼠睾丸组织Beclin-1、LC3B-Ⅱ、p62、HMGB1蛋白表达情况。结果给予大鼠TP干预21 d后,大鼠睾丸湿重、睾丸指数均显著降低(P<0. 01);睾丸生精小管发生萎缩,各级生精细胞排列紊乱、层数减少,未见成熟的精子;睾丸组织Beclin-1、LC3B-Ⅱ和HMGB1蛋白表达均显著上调(P<0. 05),p62蛋白表达无明显变化(P>0. 05)。联合给予TP和CQ后,大鼠睾丸指数显著增加(P<0. 05);生精小管和各级生精细胞损伤明显改善,可见到成熟的精子;睾丸组织Beclin-1、LC3B-Ⅱ和HMGB1蛋白表达水平均显著下调(P<0. 05),p62蛋白表达仍无明显变化(P>0. 05)。联合给予TP和Gly后,各观测指标变化与联合给予TP和CQ后结果类似,且两组各指标均无明显差异(P>0. 05)。结论外源性雄激素可能通过上调自噬水平引发大鼠睾丸萎缩病理过程发生,此过程中HMGB1可能调节自噬水平改变。     

siRNA靶向抑制eIF2α基因对非酒精性脂肪性肝病自噬及凋亡的影响

目的探讨siRNA靶向抑制eIF2α基因对非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)细胞模型自噬及凋亡的影响。方法体外0.6 mmol/L油酸诱导HepG2细胞脂质沉积建立NAFLD细胞模型,将HepG2细胞分为对照组、模型组、eIF2α-siRNA干扰组、NC-siRNA干扰组。油红O观察各组细胞内脂滴分布。采用Real-time PCR检测各组细胞eIF2αmRNA表达情况。LC3质粒标记绿色荧光蛋白(GFP-LC3)转染HepG2细胞后,荧光显微镜下观察细胞内绿色点状聚集的自噬小体分布,Honchst 33258染色观察细胞凋亡情况。Western blotting检测自噬、凋亡相关蛋白P62、LC3Ⅱ、Beclin-1、Bcl-2、Bax、Caspase-3及p-eIF2α、eIF2α的表达。结果 Real-time PCR及Western blotting实验表明,与对照组相比,模型组eIF2α蛋白及mRNA表达差异无统计学意义(P0.05);与模型组相比,eIF2α-siRNA干扰组eIF2α蛋白及mRNA表达明显下降。与对照组相比,模型组p-eIF2α表达增加;与模型组相比,eIF2α-siRNA干扰组p-eIF2α表达明显下降。荧光显微镜观察提示,与对照组相比,模型组自噬体数量明显降低;与模型组相比,eIF2α-siRNA干扰组自噬体数量明显增加。Hoechst 33258染色分析提示,与对照组相比,模型组凋亡率明显增加;与模型组相比,eIF2α-siRNA干扰组凋亡率明显减少。Western blotting检测提示,与对照组相比,模型组细胞Bax、P62、Caspase-3蛋白表达均增加,而Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均降低(P均0.05),经过eIF2α-siRNA干扰后,eIF2α-siRNA干扰Bax、P62、Caspase-3蛋白表达均降低,而Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ增加。结论 siRNA靶向抑制eIF2α基因通过增强自噬及抑制细胞凋亡改善NAFLD,细胞模型脂肪变性。     

幽门螺杆菌对肠化生胃黏膜Cdx2和肿瘤坏死因子-α蛋白表达的影响

目的探讨幽门螺杆菌对慢性浅表性胃炎伴肠化生胃黏膜尾型同源异型核基因(Cdx)2和肿瘤坏死因子(TNF)-α蛋白表达的影响。方法选择30例慢性浅表性胃炎、30例轻度肠化生,35例中度肠化生和35例重度肠化生患者进行幽门螺杆菌(Hp)检查,并检测各组在不同Hp感染情况、Hp阳性Hp根除前后Cdx2和TNF-α蛋白的表达情况。结果 Cdx2、TNF-α蛋白在慢性浅表性胃炎组(胃炎组)、轻、中、重度肠化生组的表达阳性率逐渐升高,且Cdx2表达在不同组间比较差异均有统计学意义(P0.05);TNF-α表达在胃炎组及不同程度肠上皮化生组间比较差异均有统计学意义(P0.05),随着肠化生加重,Hp感染率呈增加趋势,不同Hp感染情况时各组内Cdx2表达差异均无统计学意义(P0.05),TNF-α表达差异均有统计学意义(P0.05); Hp阳性经Hp根除后Cdx2阳性表达率下降,但仅有轻度肠化生组差异有统计学意义(P0.05);Hp阳性经Hp根除后TNF-α蛋白表达率下降,轻度肠化生组、中度肠化生组差异均有统计学意义(P0.05),重度肠化生组差异无统计学意义(P0.05)。结论监测Cdx2、TNF-α蛋白表达水平有助于判断肠上皮化生程度,胃黏膜轻度肠化生根除Hp后可逆转,中度肠化生胃黏膜根除Hp后胃黏膜炎症可减退。     

祛风生脉颗粒对大鼠缺血心肌微血管内皮细胞自噬及血管新生的影响

目的观察祛风生脉颗粒对大鼠缺血心肌微血管内皮细胞(CMECs)自噬及血管新生的影响。方法制备祛风生脉颗粒高剂量(Q-G组)、中剂量(Q-Z组)、低剂量(Q-D组)大鼠含药血清,分别与大鼠缺血CMECs共孵育,同时制备空白血清,分别与大鼠缺血CMECs(MX组)和正常大鼠CMECs(ZC组)共孵育。电镜观察各组细胞自噬小体及超微结构变化,Western-blot分析微管蛋白轻链3(LC3)–Ⅱ/Ⅰ比值及P62蛋白表达;划痕法观察细胞迁移能力,倒置相差显微镜下计数管腔形成数。结果与ZC组相比,MX组电镜下观察到自噬小体,但未见到自噬溶酶体,LC3–Ⅱ/Ⅰ比值及P62蛋白表达均升高(P 0.05),细胞迁移数和管腔形成数均较ZC组降低(P 0.05);与MX组相比,Q-D组和Q-Z组电镜下观察到自噬小体增多,同时观察到较多的自噬溶酶体,LC3–Ⅱ/Ⅰ比值升高,P62蛋白表达降低(P 0.05),细胞迁移数和管腔形成数均较MX组增多(P 0.05);与Q-D组和Q-Z组相比,Q-G组电镜下观察到自噬溶酶体数目进一步增多;与MX组相比,Q-G组LC3–Ⅱ/Ⅰ比值显著升高,P62蛋白表达明显降低(P 0.01),细胞迁移数和成管数较MX组均显著增多(P 0.01)。结论祛风生脉颗粒能改善缺血CMECs迁移和成管能力,从而促进缺血心肌血管新生,其作用与药物剂量呈正相关,机制可能与增强缺血CMECs自噬有关。