胶质纤维酸性蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的为获得高纯度的人胶质纤维酸性蛋白（GFAP）。方法从人脑胶质瘤组织中提取mRNA,采用RT-PCR的方法克隆GFAP基因全长序列,利用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ将GFAP基因插入到原核表达载体pGEX4T2,对重组表达载体pGEX4T2-GFAP进行双酶切和测序鉴定。选择测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21,用终浓度为1mmol/L的异丙基-β-D-硫酸代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达GFAP-GST融合蛋白。经亲和层析纯化获得GFAP融合蛋白,并通过SDS-PAGE和western blot进行鉴定。结果重组质粒经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误。宿主菌BL21经IPTG诱导表达并纯化得到目的蛋白GFAP-GST融合蛋白,经SDS-PAGE鉴定分子量约为70～90kD,符合预期,westernblot证实该目的蛋白能被特异性抗人GFAP多克隆抗体识别。结论成功构建GFAP表达载体,并可通过原核表达获得高纯度的目的蛋白,为进一步开展相关研究打下基础。     

基因重组BDNF蛋白在大肠杆菌中的表达纯化与功能鉴定

目的构建脑源性神经营养因子（BDNF）基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达，以获取高产量、低成本、高纯度且具有生物学活性的BDNF蛋白。方法以人的全长BDNF cDNA为模板，用PCR方法扩增成熟区BDNF的cDNA，应用基因重组技术将人BDNF cDNA克隆到质粒pET-30a（＋）中，进行限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定。将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）LysS，经IPTG诱导表达后，用Ni-NTA亲和层析纯化获取蛋白，用SDS-PAGE和western blot方法鉴别，噻唑蓝（MTT）法检测重组蛋白对PC12细胞增殖的影响。结果扩增出的人BDNF cDNA片段克隆进了原核表达载体，经酶切和核酸测序鉴定，得到了正确的重组质粒pET-BDNF，并在大肠杆菌中获得了表达。纯化后的蛋白经考马氏亮蓝染色呈单一条带；用抗BDNF的抗体进行western blot分析证明目的蛋白获得了表达。基因重组BDNF蛋白能够促进PC12细胞增殖。结论本研究成功构建了表达基因重组人BDNF的原核表达载体，基因重组人BDNF蛋白在大肠杆菌中获得了表达和纯化，所获得的基因重组蛋白具有较好的生物学活性。     

杆状病毒蛋白表达系统制备可溶性LRIG1蛋白及其鉴定

目的为进一步研究肿瘤的治疗提供高质量的可溶性多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白(sLRIG1)。方法用重组sLRIG1的杆状病毒(Bac-sLRIG1)感染sf9昆虫细胞,表达的蛋白经提纯,获得sLRIG1蛋白,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹进行分析鉴定。结果使用杆状病毒表达载体系统(BEVS)成功表达了重组sLRIG1蛋白,最佳感染复率为5,孵育时间为72 h,经鉴定蛋白表达正确,纯度高达95%。结论用BEVS可成功获得大量高纯度重组sLRIG1蛋白,可满足后续实验的需要。     

大鼠FLRT3 C端结构域蛋白的原核表达和纯化

BACKGROUND： Studies have suggested that fibronectin leucine-rich transmembrane protein 3 （FLRT3） is related to injury and regeneration of the nervous system. However, the expression and biological characteristics of these proteins remain poorly understood.
OBJECTIVE： To obtain FLRT3 C-terminal gene fragments, to effectively express and purify the target proteins. D
ESIGN, TIME AND SETTING： An observational study of cellular and molecular biology was performed at the laboratory of Histology and Embryology in Xiangya School of Medicine, Central South University between October 2007 and June 2008.
MATERIALS： Three Sprague Dawley adult rats were used to extract total RNA from rat brains. The pGEX4T3 and Escherichia coil （E. coil） JM109 were purchased from Promega. E. coil BL21 was provided by Novagen.
METHODS： FLRT3 protein coding C-terminal DNA fragments, at a length of 786 bp, were amplified using RT-PCR technique from rat total RNA. The amplified products were cloned into the expression vector pGEX4T3. A recombinant expression vector was then constructed and introduced into E. coil BL21. IsopropyI-D-thiogalactopyranoside was applied to induce expression of recombinant GST fusion proteins, followed by isolation, purification, and renaturation of inclusion bodies that comprised recombinant proteins. Finally, the purified recombinant protein was obtained.
MAIN OUTCOME MEASURES： Determination of FLRT3 C-terminal DNA sequence; expression of target proteins was assayed by SDS-PAGE electrophoresis; purified recombinant protein was identified with Western blot methods. RESULTS： FLRT3 protein coding C-terminal DNA fragments, at a length of 786 bp, were successfully harvested through RT-PCR amplification, and were then clones into the prokaryotic expression vector pGEX4T3. The results of the sequence were consistent with the known gene sequence. SDS-PAGE analysis demonstrated that there was a specific protein band in the recombinant GST fusion proteins at a relative molecular mass of 56,600. The recombinant protein was observed in the inclusion body, and highly purified recombinant proteins were obtained through a series of methods, such as rinsing, purifying, dissolving, and renaturing.
CONCLUSION： From adult Sprague Dawley rats, FLRT3 C-terminal gene fragments were successfully cloned and shown to be effectively expressed in E. coil BL21. Moreover, highly purified GST fusion proteins were obtained.     

肾上腺脑白质营养不良蛋白ATP结合区的原核表达与鉴定

目的　构建人肾上腺脑白质营养不良 ( adrenoleukodystrophy,ALD)蛋白 ( ALD protein,ALDP) ATP结合区的原核重组载体并进行表达和鉴定。方法　自行设计引物 ,通过 PCR技术 ,以人全血 RNA为模板扩增ALDP ATP结合区编码序列 ,PCR产物经 Eco R /Xho 双酶切后 ,将其克隆至 p GEX-4T-2载体中 ,在大肠杆菌 BL2 1中诱导 GST融合蛋白的表达。结果　在 IPTG的诱导下 ,重组菌高效表达出一相对分子质量约为42 0 0 0的产物 ,与预期大小相符。对重组质粒的序列分析表明 ,插入片段的序列与 Genbank登录的编码序列完全一致。Western blot结果显示 ,目的条带可被鼠抗人 ALDP单克隆抗体识别。结论　人 ALDP ATP结合区的编码序列已被克隆至 GST融合表达载体 p GEX-4T-2 ,并在大肠杆菌 BL2 1中获得高表达。     

脑胶质瘤P^53蛋白表达的初步研究

作者随机选取２２例星形细胞瘤的新鲜标本作冰冻切片，然后采用抗Ｐ＾５３单克隆抗体ｐＡｂ２４０，按ＡＢＣ法作免疫组化检测。结果发现星形细胞瘤Ｉ级Ｐ＾５３蛋白表达阳性率为０，Ⅱ级阳性率为２５％，Ⅲ－Ⅳ级阳性率为５０％，三组间的阳性率有极显著差异。本文还讨论了Ｐ＾５３基因的生物学特性及其与临床的关系。     

人His-AWP1融合蛋白表达载体的构建及其在原核生物的表达

目的 获取了His-AWP1融合蛋白，为了阶段深入研究AWP1的结构。功能及筛取与其相互作用的蛋白打下基础。方法 应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法从人ECV304内皮细胞系中克隆AWP1cDNA，并将其重组于能表达6个组氨酸残基的原核表达质粒pET-14b中，经酶切，序列鉴定，选择正确重组克隆。将其质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达，用Ni^2 -NTAHis柱纯化和SDS-PAGE分离蛋白。结果 克隆到一个627bp的AWP1cDNA片段，重组质粒目的DNA测序正确，纯化出了一个分子量约为38kD的融合蛋白，结论 用基因工程方法在原核细胞表达并成功纯化出His-AWP融合蛋白。     

急性重型脑外伤后脑蛋白表达变化的蛋白质组研究

目的应用蛋白质组学技术，研究重型人脑外伤后的脑皮层蛋白质组表达变化的情况。方法提取脑挫伤部位皮层的总蛋白。通过双向电泳，分离蛋白。应用胶内酶切、生物质谱，鉴定由图像分析软件所得出的具有表达差异的蛋白质点。结果在急性期8h内，目前已发现138个蛋白质点，表达水平具有显著性差异变化。在已鉴定出的83个蛋白点中，属于64种蛋白质。依其功能可分为：细胞骨架、代谢反应、核酸蛋白合成与更新、信号传导、氧化应激反应、功能未知等几类。在急性期，大多数差异蛋白表达水平呈波动变化。结论蛋白质组技术作为一个有力的大规模、高通量的分析蛋白质混合物工具，可快速的建立脑蛋白表达谱。在急性期，脑蛋白质表达呈剧烈变化主要为参与细胞代谢反应、结构修复等组织代偿反应。     

HSV-1 VP22及microdystrophin基因融合表达重组质粒的构建及其生物学特性的初步研究

目的 构建人单纯疱疹病毒1型(HSV-1)病毒蛋白22(VP22)及microdystrophin基因融合表达重组质粒,体外研究其表达及HSV-1 VP22介导的蛋白转导特性,为进一步利用此重组质粒治疗Duchenne型肌营养不良症(DMD)奠定基础.方法 从质粒pSINrep5-VP22中PCR扩增HSV-1 VP22全长基因.然后克隆至真核表达载体pAVX1中,构建重组质粒pAVP22:再用Not I酶切含microdystrophin基因的pBSK-MICRO质粒,获得microdystrophin基因,片段回收后定向插入质粒pAVP22中,获得重组质粒pAVP22-MICDYS:然后将重组质粒pAVP2-MICDYS转染至小鼠成纤维细胞3T3细胞.通过RT-PCR、Western blot及间接免疫荧光检测microdystrophin基因的转录及蛋白表达;最后收集转染后3T3细胞上清,感染人间充质干细胞(MSCs),检测重组蛋白在人MSCs中的表达情况来分析HSV-1 VP22是否可以介导VP22-microdyslrophin融合蛋白的转导.结果 成功构建了含有HSV-1 VP22和microdystrophin基因的重组质粒.并在体外得到了很好表达:同时也证实HSV-1 VP22提高了microdystrophin基因在3T3细胞中的表达效率,并可介导VP22-mizrodystrophin蛋白从3T3细胞到人MSCS间的转导.结论 该重组质粒的构建及体外成功表达和蛋白转导特性的确定为下一步用该重组质粒进行DMD疾病治疗研究奠定了基础.     

原核表达的Neuritin蛋白对PC12细胞突起生长的影响

目的纯化原核表达的Neuritin蛋白,通过观察其对PC12细胞和研究其神经生物学功能。方法采用镍离子金属螯合亲和层析法纯化Neuritin蛋白,Bradford法对纯化的Neuritin蛋白进行定量,然后加入到PC12细胞,通过观察PC12细胞突起的生长情况和细胞形态的变化,研究其促进细胞突起生长的功能。结果纯化后的Neuritin蛋白经SDS-PAGE电泳显示,获得唯一蛋白条带,即Neuritin蛋白;Bradford定量法计算出其浓度为0.45 mg/ml,纯化的Neuritin蛋白加入到PC12细胞培养液中,PC12细胞长出突起,发生类神经元样改变。结论原核表达的Neuritin蛋白得到有效纯化及复性,纯化的Neuritin蛋白能促进神经突起生长,考虑Neuritin促进突触发生和调节突触可塑性等方面具有重要作用,为实验室进一步功能研究打下了一定的基础,同时作为新的神经营养因子在治疗神经疾病及其损伤中具有良好的应用前景。     

Protein therapy using heme-oxygenase-1 fused to a polyarginine transduction domain attenuates cerebral vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage

A sequence of 11 consecutive arginine residues (11R) is one of the best protein transduction domains for introducing proteins into cell membranes. Heme-oxygenase-1 (HO-1) is involved in heme catabolism and reduces the contractile effect of hemoglobin after subarachnoid hemorrhage (SAH). Therefore, we constructed 11R-fused HO-1 protein to achieve successful transduction of the protein into the cerebral arteries and examined the therapeutic effect of the 11R-HO-1 protein for cerebral vasospasm (CV) after SAH. We injected the 11R-HO-1 protein into the cisterna magna of male rats and, several hours after the injection, performed immunofluorescence staining and western blotting analysis of the rat basilar arteries (BAs) to determine transduction efficacy. We also assessed intraarterial HO-1 activity as cGMP (cyclic guanosine 3′, 5′-cyclic monophosphate) accumulation in SAH and determined whether protein transduction of 11R-HO-1 quantified the therapeutic effect in a rat double-hemorrhage model of SAH. The BAs expressed significantly more HO-1 in the group injected with 11R-HO-1 (3.56±0.54 (11R-HO-1) versus control (saline)), and transduction of 11R-HO-1 resulted in higher activity (>3.25-fold) in rat BAs with SAH. Moreover, the results of the rat double-hemorrhage model showed that the 11R-HO-1 protein significantly attenuated CV after SAH (317.59±23.48 μm (11R-HO-1) versus 270.08±14.66 μm (11R-fused enhanced green fluorescent protein), 252.05±13.95 μm (saline), P<0.01).     

2-BFI对EAE小鼠血脑屏障通透性和AQP4 mRNA表达的影响

目的观察2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉(2-BFI)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠血脑屏障和水通道蛋白4(AQP4)mRNA表达的影响。方法 C57BL/6小鼠39只随机分为正常对照组、EAE组和2-BFI干预组。各组每日进行神经功能缺损评分;第20天进行病理学检查;伊文思蓝荧光定量方法检测血脑屏障通透性;电子显微镜观察血脑屏障的超微结构变化;Real-time PCR法测定AQP4 mRNA的表达水平。结果与EAE组比较,2-BFI干预组小鼠神经功能缺损及血脑屏障病理损伤减轻,AQP4 mRNA的表达水平明显降低,均差异有统计学意义。结论 2-BFI对EAE小鼠的神经保护作用与减少AQP4 mRNA的表达、减轻血脑屏障通透性有关。     

蛋白质转导及在神经科学研究中的应用

蛋白质转导或蛋白质治疗是通过表达载体法或化学交联法将具有治疗作用的外源性蛋白质与称为蛋白质转导域的氨基酸片段相连，以非受体和非温度依赖的方式穿越细胞膜进入胞内达到治疗疾病的目的，这种内在化的异质蛋白质不仅依旧保持了原有的生物学活性和功能。而且能在保持血脑屏障完整的情况下进入脑内。目前，蛋白质转导技术除了用于转导肿瘤特异抗体和药物进行抗肿瘤治疗以及制备抗感染或抗病毒的疫苗外。也已广泛应用于神经科学和与神经疾病相关的研究。     

人肌肉生长抑素蛋白原核表达及纯化

目的:克隆人肌肉生长抑素(myostatin)基因并在大肠埃希菌中表达,纯化目的蛋白后制成冻干粉剂。方法:通过RT-PCR方法得到人myostatin基因的cDNA序列,构建重组克隆质粒pGEM5zf(+)myostatin-s及表达质粒pET32a(+)-myostatin-s,在合适条件下通过大肠埃希菌表达系统诱导表达并纯化该蛋白(myostatin-s),最终制成冻干粉剂。结果:成功构建重组质粒,并经测序与GeneBank资料Myostatin(GI:2623581)序列完全一致。经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导及纯化获得相对分子质量为33 000融合蛋白,并经Western blot证实后制成冻干粉剂。结论:通过重组基因片段可以获得纯化myostatin的成熟肽片段-融合蛋白myostatin-s,制成的冻干粉剂将为进一步人肌肉生长抑素免疫学研究奠定基础。     

大鼠全脑缺血再灌流后脑组织P53及P21蛋白的表达

目的　探讨大鼠全脑缺血再灌流后Ｐ５３、Ｐ２１蛋白的表达及其与迟发性神经元死亡（ＤＮＤ）的关系。方法　在４ 血管闭塞法全脑缺血模型上,采用ＨＥ及ＬＳＡＢ染色法,观察脑组织病理改变,检测脑组织Ｐ５３、Ｐ２１蛋白的表达,以及蛋白合成抑制剂放线菌酮对其的影响。结果　全脑缺血１５ ｍ ｉｎ 再灌流后,脑组织Ｐ５３、Ｐ２１蛋白表达增加,且两者分布接近。海马结构、丘脑、下丘脑等白质区（再灌流后６ ｈ）较皮层、海马的神经细胞核（２４ ｈ）先检测到Ｐ５３、Ｐ２１蛋白,７２ ｈ 表达达高峰。并且以缺血损伤最严重的海马ＣＡ１ 区Ｐ５３、Ｐ２１蛋白表达为强。另外,放线菌酮可抑制脑组织Ｐ５３、Ｐ２１蛋白的表达,并对ＤＮＤ具有一定的保护作用。结论　全脑缺血再灌流损伤后,脑组织Ｐ５３、Ｐ２１蛋白表达增加,放线菌酮可抑制其表达,并对ＤＮＤ起保护作用,提示Ｐ５３、Ｐ２１蛋白参与了全脑缺血后ＤＮＤ的凋亡机制,并对其起促进作用     

rhG—CSF增加实验性脑缺血周围区的nestin蛋白表达

目的研究重组人粒细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony-stimulatingfactor,rhG-CSF)对大鼠局灶性脑缺血的神经元保护作用.方法用线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型,于再灌注不同时间点对治疗组和对照组进行神经缺损评分(NSS);并用免疫组织化学方法测定神经上皮干细胞蛋白(nestin)的表达.结果与对照组相比,rhG-CSF治疗组大鼠的神经缺损评分明显降低(P＜0.05);治疗组脑梗死区周围的nestin表达较对照组增多.结论脑缺血再灌注后,一定剂量rhG-CSF可能通过提高nestin的表达,增加神经细胞的修复,改善脑卒中的预后.     

Brain injury-dependent expression of activity-dependent neuroprotective protein

Activity-dependent neuroprotective protein (ADNP), a crucial brain development factor, contains a unique sequence, termed NAPVSIPQ, which protects mice against closed head injury (CHI). The aim of this study was to determine whether CHI affects ADNP mRNA expression in the injured brain hemisphere. Male C57JBL/6J mice were subjected to CHI. Brains were removed 5 h, 24 h, 7 d, and 29 d post-CHI. A comparison was made between ADNP mRNA in the injured versus the noninjured hemisphere using real-time polymerase chain reaction. A nonsignificant change (p>0.05) was found 5 h, 24 h, and 7 d post-CHI. However, a significant increase (p < 0.05) in ADNP mRNA expression was detected in the injured cerebral hemisphere 29 d post-CHI. The data presented may be associated with ADNP’s crucial involvement in brain development and response to injury.     

髓磷脂碱性蛋白的提纯及其对PBMC产生TNF和IFN的影响

目的 探讨髓磷脂碱性蛋白（MBP）诱导EAE产生的可能原因。方法 通过酸抽提和CM－Sephadex50层析,分离提取牛MBP,观察其致AE活性,用生物活性法检测MBP刺激的PMBC上清中TNF和IFN的活性。结果 分离 纯化得到电泳1条主带的MBP,证明其具有致EAE活性,MBP刺激的PBMC可产生TNF和IFN。结论 MBP可通过在外周刺激PBMC产生炎性因子TNF和IFN诱导EAE的产生。