阿托伐他汀抑制ApoE-/-小鼠腹腔巨噬细胞LPS刺激下NF-κB p65核转位

目的 观察阿托伐他汀对脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)刺激载脂蛋白E基因缺陷(apolipoprotein E knockout,ApoE-/-)小鼠腹腔巨噬细胞NF-κB p65核转位的影响.方法 采用LPS 10 ng/ml刺激分离纯化的ApoE-/-小鼠腹腔巨噬细胞,并给予1、5、10 μmol/L不同浓度的阿托伐他汀进行干预,免疫荧光染色结合激光共聚焦显微镜观察NF-κB p65核转位,Western blot法检测NF-κB p65核内表达,ELASA法检测细胞上清液IL-6水平.结果 激光共聚焦及Western blot均观察到阴性对照组核内NF-κB p65表达较低,其平均荧光强度为(3.71±0.26);阳性对照组核内NF-κBp65表达较阴性对照组显著增高[(16.12±1.28),P＜0.05];不同剂量阿托伐他汀干预组细胞核内NF-κB p65表达呈剂量依耐性逐渐降低,其平均荧光强度分别为(10.95±0.71)、(7.61±0.73)、(4.56±0.39),差异具有统计学意义(P＜0.05);同时可发现药物干预组细胞上清液IL-6分泌量也呈剂量依耐性逐渐降低(P＜0.05).结论 阿托伐他汀能抑制ApoE-/-小鼠腹腔巨噬细胞LPS刺激下NF-κB p65核转位及其随后炎性介质IL-6分泌.     

LPS直接诱导对肺微血管内皮细胞核因子κB活化的影响

目的探讨内毒素(lipopolysaccharide, LPS)的直接诱导作用对肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells, PMVECs)核因子κB(NF-κB)活化的影响.方法 100 ng/ml LPS刺激PMVECs 0、0.5、1、2、4、6、8 h或1、10、100 ng/ml LPS刺激1 h后,凝胶电泳迁移率分析(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)检测NF-κB的活化,免疫细胞化学(ICC)观察其亚基p50、p65的核转位.并通过加入NF-κB活化阻断剂TPCK观察其对100 ng/ml LPS刺激1 h诱导活化的影响.结果 LPS的直接刺激能迅速活化NF-κB,诱导其p50、p65亚基核转位,1 h即达到高峰,且呈剂量依赖关系,后逐渐下降.TPCK能显著抑制其活化(P<0.01).结论 LPS的直接刺激能诱导NF-κB的活化,这可能是LPS诱导炎症反应的一个重要环节.     

地氟醚预处理对缺氧/复氧损伤ECV304细胞NF-κB活性的影响

目的探讨地氟醚预处理对缺氧/复氧(A/R)损伤ECV304细胞NF-κB活性的影响。方法选用ECV304细胞株.实验分为两部分:(1)将细胞分为空白对照组及TNF-α不同持续时间刺激组共6组,用West-ernblot法分析NF-κB的抑制因子IκB蛋白的降解和磷酸化。(2)将细胞分为5组,即空白对照组(Ⅰ组)、A/R组(Ⅱ组)、A/R TNF-α10ng/mL刺激组(Ⅲ组)、地氟醚1.0MAC预处理 A/R组(Ⅳ组)和地氟醚1.0MAC预处理 A/R TNF-α10ng/mL刺激组(Ⅴ组)。用间接免疫荧光法检测各组细胞NF-κB/p65亚基的定位。结果TNF-α刺激ECV304细胞后,IκB-α蛋白降解的时间高峰为30min,而IκB-α磷酸化的时间高峰为1h。A/R损伤可激活ECV304细胞中NF-κB的活性,而经1.0MAC地氟醚预处理后,由TNF-α激活的上述变化可受到抑制。免疫荧光分析显示,TNF-α刺激可使NF-κB/p65荧光标记由胞浆区转入胞核区,而经地氟醚预处理后,NF-κB/p65入核明显减少。结论抑制NF-κB的激活可能是地氟醚预处理减少ECV304细胞缺氧/复氧损伤的机制之一。     

NF-κB抑制剂对脂多糖刺激的退变人椎间盘髓核细胞炎症因子表达的影响

目的 观察脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激退变人椎间盘髓核细胞前后,核因子kappB(NF-κB)与炎症因子表达及相互关系.方法 体外培养退变的人椎间盘髓核细胞,设立对照组、LPS (500 μg/mL)刺激组、NF-κB抑制剂(BAY11-7082)+LPS(500 μg/mL)刺激组.ELISA方法检测各组细胞培养液中炎症因子TNF-α及IL-1β的含量,免疫荧光法检测各组髓核细胞内p65的表达及定位,Western blot检测TNF-α、IL-1β、NF-κB结合蛋白p65以及磷酸化p-p65的表达,Real-time PCR检测TNF-α及IL-1β的表达.结果 LPS刺激髓核细胞后,p65入核增多,p-p65表达明显增加,ELISA实验结果表明LPS刺激组细胞培养液中炎症因子TNF-α及IL-1β表达水平升高(P＜0.05),Western blot及Real-time PCR检测结果也表明其髓核细胞内炎症因子TNF-α及IL-1β表达水平明显上升(P＜0.05);而与LPS刺激组相比,NF-κB抑制剂+LPS刺激组p65入核减少,p-p65表达明显降低,细胞培养液中炎症因子TNF-α及IL-1β表达水平降低(P＜0.05),Western blot及Real-time PCR检测结果也表明其髓核细胞内炎症因子TNF-α及IL-1β表达水平明显下降(P＜0.05).结论 LPS能够通过激活人退变髓核细胞NF-κB信号通路,促进炎性因子TNF-α及IL-1β表达增多,抑制NF-κB信号通路后可明显减轻炎性因子的表达.     

罗格列酮对MODS大鼠外周血单个核细胞内NF-κB表达的影响

目的 探讨过氧化物酶体增生物激活受体γ(PPARγ)激动剂罗格列酮(ROSI)对多器官功能障碍综合征(MODS)大鼠外周血单个核细胞(PBMC)内核因子-κKB(NF-κB)表达的影响.方法 健康雄性SD大鼠40只,随机分为4组(每组10只):①止常对照组;②LPS刺激组;③罗格列酮(ROSI)预处理组;④选择性拮抗剂2-氯-5-硝基苯胺(GW9662)预处理组.在每组操作结束后4h取血用于PBMC的分离.免疫细胞化学法检测PBMC内NF-κB p65的表达活性,并进行图像分析.结果 在正常组大鼠PBMC内NF-κB p65表达较少.LPS刺激组NF-κB p65表达显著增加,与正常组比较差异显著(P＜0.01).ROSI组NF-κB p65表达减少,与LPS刺激组比较显著降低(P＜0.01).GW9662组NF-κB p65表达与LPS刺激组比较无显著差异性(P＞0.05).结论 罗格列酮可能通过抑制NF-κB的表达活性而对MODS大鼠起保护作用.     

锌指蛋白A20及其相关炎症因子在椎间盘髓核细胞退变前后的表达变化

目的 检测椎间盘髓核细胞退变前后锌指蛋白A20及其相关炎症因子的表达变化.方法 获取我院骨科患者术中切除的椎间盘组织,分为正常组和退变组,采用阿辛蓝染色观察人椎间盘髓核细胞的退变情况,免疫组化观察人椎间盘髓核细胞A20、TNF-α、IL-1β及NF-κB p65蛋白的表达.体外培养胚胎小鼠髓核细胞,分为对照组(只加入等量的PBS)、内毒素(LPS)刺激组和NF-κB抑制组,分别以Real-time PCR检测LPS刺激细胞和加入NF-κB抑制剂后,A20、TNF-α、IL-1β、Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶-4(ADAMST-4)、Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶-5(ADAMST-5)、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)的表达变化;Western blot检测A20、TNF-α、IL-1β、ADAMTS4、ADAMTS-5、MMP-13、p65、磷酸化p65(p-p65)的表达变化.结果 退变组髓核细胞数量显著少于正常组,并有明显的聚集现象;退变组髓核细胞中A20、TNF-α、IL-1β、p65蛋白表达明显高于正常组;LPS刺激胚胎小鼠髓核细胞后,LPS刺激组A20、TNF-α、IL-1β、ADAMST-4、ADAMST-5、MMP-13mRNA与蛋白的表达均高于NF-κB抑制组与对照组(P＜0.05),A20、TNF-α、IL-1 β、ADAMTS-4、ADAMTS-5、MMP-13、p65、p-p65蛋白含量也较NF-κB抑制组与对照组显著增高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 髓核细胞炎症反应与椎间盘退变的发生、发展密切相关,A20可能通过NF-κB信号通路对抑制髓核细胞退变时炎症反应起到关键作用.     

青藤碱对胶原诱导性关节炎大鼠滑膜细胞NF-κB的抑制作用

目的 观察青藤碱(sinomenine,SN)对胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis, CIA)大鼠滑膜细胞核因子-κB(NF-κB)的DNA结合活性及核转位的影响,以阐明该药抗炎的可能机制.方法 以CIA大鼠为模型,收集膝关节滑膜细胞体外培养,设正常对照组、CIA组、CIA 甲氨喋呤10 μmol/L(阳性对照组)、CIA SN 50 μmol/L组、CIA SN 500 μmol/L组.应用荧光标记与激光共聚焦扫描显微镜检测滑膜细胞NF-κB p65亚基核转位,电泳迁移率改变分析法(EMSA)检测NF-κB与DNA序列的结合活性.结果 与正常对照组相比,CIA大鼠滑膜细胞可见明显的p65亚基核移位,NF-κB的DNA结合活性显著升高(P＜0.01),SN在50 μmol/L及500 μmol/L时可呈浓度依赖性地抑制CIA大鼠滑膜细胞p65亚基核转位及NF-κB的DNA结合活性,甲氨喋呤在10 μmol/L时可下调NF-κB的DNA结合活性但未抑制p65亚基的核转位.结论 SN抑制滑膜细胞内NF-κB p65 核转位和NF-κB的DNA结合活性为其抗炎机制之一.     

凉膈散药物血清对脂多糖诱导体外培养巨噬细胞核转录因子-κB的影响

目的观察凉膈散药物血清对脂多糖(LPS)诱导的体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞核转录因子-κB(NF-κB)变化的影响．探讨凉膈散解毒作用的细胞信号转导调控机制。方法制备凉膈散药物血清；提取并体外培养小鼠腹腔巨噬细胞；以凉膈散药物血清及LPS共同刺激已培养细胞，免疫荧光法检测巨噬细胞NF-κB亚基p65，用激光扫描共聚焦显微镜观察并测定各组小鼠腹腔巨噬细胞核的p65的荧光表达情况。结果小鼠巨噬细胞经LPS刺激1h后，其核内的荧光强度(代表p65的表达量)显增强。与LPS刺激组相比：抑制剂TLCK组、凉膈散药物血清不同剂量组的荧光强度值均较低．有显性差异，以TLCK及凉膈散大剂量组强度值最低，中、小剂量组次之；空白血清不同剂量组则均无显差异。药物血清不同剂量组之间有显差异，呈剂量依赖性关系；空白血清不同剂量组之间无显性差异。结论不同剂量凉膈散药物血清均能抑制LPS所致的细胞核内p65升高，且呈剂量依赖性，这可能是凉膈散解毒作用的细胞信号转导机制之一。     

槐定碱预处理对LPS诱导RAW264.7细胞表达NF-κB的影响

目的观察槐定碱预处理对LPS诱导RAW264.7细胞NF-κB p65、TNF-α表达的影响,探讨槐定碱抗内毒素机制。方法培养RAW264.7细胞,分为空白对照组、槐定碱预处理对照组、LPS模型组、槐定碱预处理＋LPS组。各组处理完毕后5、30、60、120min,分别获取细胞与细胞培养液。Western Blot和RT-PCR分别检测细胞NF-κB p65蛋白与mRNA表达,放免法检测细胞培养液TNF-α含量。结果单独槐定碱对NF-κB p65以及TNF-α表达无影响;LPS模型组各时间点NF-κB p65 mRNA与蛋白以及TNF-α表达均显著高于空白对照组（P〈0.01）,且随LPS刺激时间延长而持续升高,至120min未见下降;槐定碱预处理＋LPS组NF-κB p65mRNA与蛋白及其下游TNF-α表达均较同时间点LPS模型组降低,差异有统计学意义（P〈0.01）。结论槐定碱预处理可通过抑制LPS诱导的RAW264.7细胞的NF-κB p65表达及TNF-α分泌发挥抗炎作用。     

PKC在LPS激活大鼠肺巨噬细胞核转录因子-κB中的作用

目的 探讨蛋白激酶C(PKC)在LPS激活肺巨噬细胞核转录因子-κB信号传导通路中的作用。方法 采用夹心ELISA的方法检测巨噬细胞NF-κB的核内浓度；免疫组化染色观察LPS作用前后NF-κB的位置改变。结果 LPS刺激可诱导巨噬细胞NF-κB活化，二者之间存在时效与量效的依赖关系；免疫组化染色显示LPS作用后，NF-κB发生核内移位，由胞浆进入细胞核内；而特异性PKC抑制剂(Cal C)和NF-κB阻断剂(PDTC)均能在不同程度上抑制LPS的作用。结论 PKC作为NF-κB活化的上游信使，参与了LPS激活NF-κB的信号传导通路。     

槐定碱预处理对LPS诱导RAW264.7细胞表达NF-κB的影响

目的观察槐定碱预处理对LPS诱导RAW264.7细胞NF-κB p65、TNF-α表达的影响,探讨槐定碱抗内毒素机制。方法培养RAW264.7细胞,分为空白对照组、槐定碱预处理对照组、LPS模型组、槐定碱预处理+LPS组。各组处理完毕后5、30、60、120min,分别获取细胞与细胞培养液。Western Blot和RT-PCR分别检测细胞NF-κB p65蛋白与mRNA表达,放免法检测细胞培养液TNF-α含量。结果单独槐定碱对NF-κB p65以及TNF-α表达无影响;LPS模型组各时间点NF-κB p65 mRNA与蛋白以及TNF-α表达均显著高于空白对照组(P<0.01),且随LPS刺激时间延长而持续升高,至120min未见下降;槐定碱预处理+LPS组NF-κB p65mRNA与蛋白及其下游TNF-α表达均较同时间点LPS模型组降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论槐定碱预处理可通过抑制LPS诱导的RAW264.7细胞的NF-κB p65表达及TNF-α分泌发挥抗炎作用。     

H2S对氧化型低密度脂蛋白诱导人单核巨噬细胞核转录因子-κB的影响及机制

目的:研究硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)对氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)诱导人单核巨噬细胞NF-κB通路的调节作用及其机制。方法:人单核细胞系THP-1细胞采用12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇(phorbol myristate acetate,PMA)诱导分化为巨噬细胞后,分为4组:对照组、ox-LDL组、ox-LDL+H2S100μmol/L组及ox-LDL+H2S 500μmol/L组。用Western blot检测细胞IκBα蛋白表达及NF-κB磷酸化水平,激光共聚焦法检测细胞胞浆IκBα及NF-κB的核转位改变,免疫共沉淀方法检测细胞核中NF-κB p65与IκBα结合情况。结果:Western blot结果显示,与对照组相比,ox-LDL组人单核巨噬细胞中NF-κB p65磷酸化水平明显升高(0.855±0.116 vs.0.502±0.218,P=0.046),IκBα表达明显减少(0.612±0.216 vs.0.997±0.167,P=0.029);与ox-LDL组相比,ox-LDL+H2S 100μmol/L组及ox-LDL+H2S 500μmol/L组细胞中NF-κB p65磷酸化水平显著降低(0.424±0.225 vs.0.855±0.116,P=0.020;0.378±0.071 vs.0.855±0.116,P=0.011),IκBα表达显著增多(1.037±0.111 vs.0.612±0.216,P=0.015;1.046±0.084 vs.0.612±0.216,P=0.013)。激光共聚焦结果显示:与对照组相比,ox-LDL组THP-1源性巨噬细胞胞浆中IκBα表达明显降低,NF-κB p65核转位明显增加;与ox-LDL组相比,ox-LDL+H2S 100μmol/L组及ox-LDL+H2S 500μmol/L组细胞胞浆IκBα表达显著增多,NF-κBp65核转位明显减少。免疫共沉淀结果显示,对照组人单核巨噬细胞胞核内未检测到NF-κB p65与IκBα的结合,ox-LDL组细胞核内NF-κB p65与IκBα结合较少,ox-LDL+H2S 100μmol/L组及ox-LDL+H2S 500μmol/L组细胞核内NF-κB与IκBα结合明显增多。结论:H2S可抑制ox-LDL诱导人单核巨噬细胞中NF-κB通路激活,其作用机制可能与抑制胞浆中IκBα降解,减少NF-κB p65磷酸化激活及核转位,同时可促进胞核中IκBα与NF-κB的结合,进而抑制NF-κB的活性有关。     

苦参素对脂多糖诱导的海马神经元凋亡的保护作用

目的 探讨苦参素(OMT)对脂多糖(LPS)诱导的海马神经元凋亡的影响及其可能机制。 方法 根据海马神经元乳酸脱氢酶(LDH)释放率选择OMT的浓度进行实验分组。分为7组:正常对照组;脂多糖组;阿司匹林+脂多糖组;苦参素组;苦参素低剂量+脂多糖组;苦参素中剂量+脂多糖组;苦参素高剂量+脂多糖组。流式细胞仪检测细胞凋亡率;免疫荧光观察NF-κB/P65核易位情况;酶联免疫吸附(ELISA)技术测定海马神经元培养上清中炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)的水平。 结果 LPS组海马神经元凋亡率显著高于正常对照组(P<0.01),OMT预处理可以显著减少LPS刺激引起的海马神经元凋亡率(P<0.05)。LPS可以促进海马神经元NF-κB/P65由胞浆转位到胞核,提高海马神经元培养上清中TNF-α和IL-1β水平;而OMT预处理能显著减少LPS对海马神经元NF-κB/P65核易位作用及降低TNF-α和IL-1β的水平(P<0.05)。 结论 LPS诱导海马神经元NF-κB/P65核易位,导致炎症因子TNF-α和IL-1β的含量增加;OMT预处理可以抑制海马神经元NF-κB/P65核易位,减少TNF-α和IL-1β的分泌,从而抑制海马神经元的凋亡。      

脂多糖对大鼠膀胱上皮细胞中Toll样受体4与核因子-κB表达的影响

目的观察体外培养的大鼠膀胱上皮细胞中Toll样受体4(TLR4)与核因子-κB(NF-κB)在脂多糖(LPS)刺激下的表达变化。方法分离幼龄Sprague-Dawley大鼠膀胱黏膜,培养上皮细胞。将分离纯化的上皮细胞分为对照组和LPS刺激1、2、3组;对照组不给予任何干预措施,LPS刺激1、2、3组给予LPS(0.01 g·L-1)分别作用1、5、24 h。采用实时定量荧光酶联免疫反应及Western blot技术检测TLR4与NF-κB p65表达量的变化。结果对照组和LPS刺激1、2、3组的TLR4 mRNA相对表达量分别为1.00±0.10、1.32±0.27、1.81±0.10、1.61±0.35;TLR4蛋白相对表达量分别为1.00±0.18、1.36±0.12、1.95±0.08、1.79±0.21。与对照组比较,LPS刺激1、2、3组TLR4 mRNA和蛋白的相对表达量均增多(P<0.05);LPS刺激2、3组TLR4 mRNA和蛋白相对表达量较LPS刺激1组增多(P<0.05);LPS刺激2、3组TLR4 mRNA和蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。对照组和LPS刺激1、2、3组NF-κB p65 mRNA相对表达量分别为1.00±0.08、1.60±0.05、1.51±0.06、1.39±0.04;NF-κB p65蛋白相对表达量分别为1.00±0.08、1.87±0.11、1.69±0.10、1.94±0.18。与对照组比较,LPS刺激1、2、3组NF-κB p65 mRNA和蛋白相对表达量均增多(P<0.05);LPS刺激1、2、3组间NF-κB p65 mRNA和蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 LPS可上调膀胱上皮细胞中TLR4与NF-κB p65的表达。     

寡聚脱氧核苷酸抑制巨噬细胞NF-κB活性的实验研究

目的观察寡聚脱氧核苷酸（ODN）对THP-1细胞NF-κB核转位及细胞核内结合活性的抑制作用。方法用脂质体将寡聚脱氧核苷酸转入细胞后,以细菌脂多糖（LPS）刺激30min,分别通过免疫细胞化学、电泳迁移率分析（EMSA）和RT-PCR检测细胞NF-κB的核移位和细胞核内NF-κB结合活性。结果免疫细胞化学显示转人ODN后以PS刺激,NF-κB表达仍位于细胞浆内,EMSA显示ODN可明显抑制细胞核内结合活性．RT—PCR显示ODN能够明显抑制NF．KB相关炎性因子TNF-α mRNA的合成。结论ODN能有效抑制THP-1细胞NF-κB的核移位和细胞核内NF-κB结合活性．从而抑制相关炎性基因的启动和转录。     

单核细胞核因子-κB 活性的检测及应用

目的探讨单核细胞(Mo)NF-κB核易位及其检测方法,了解脂多糖(LPS)对NF-κB的活化作用。方法采用免疫组化方法和凝胶电泳迁移率改变分析(EMSA)法。结果Mo免疫组化结果,胞浆组化染色强阳性,其胞核染色弱阳性;LPS刺激Mo后,胞核组化染色显强阳性。EMSA示LPS刺激组的自显影密度远高于正常对照组（P<0.01)。结论Mo受LPS刺激后,免疫组化方法证实在完整细胞中NF-κB核易位并活化;EMSA证明LPS刺激后,NF-κB核易位大量增加,与κB序列结合活力大为增强。     

LPS刺激对RAW264.7细胞p38蛋白激酶的细胞内定位的影响

目的 探讨p38蛋白激酶信号传导的过程及其在细胞中的特异性作用机制。方法 应用间接荧光标记免疫探针技术及共聚焦激光扫描技术观察单核细胞中p38蛋白激酶的分布及LPS对其分布的影响。结果p38在未受刺激的静息单核细胞及内皮生长因子（EGF）刺激的单核细胞胞浆和胞核中荧光强度均呈弥散性分布;脂多糖（LPS）刺激使细胞核区的荧光强度明显增强,而胞浆区域的荧光强度降低。激酶动力学的研究显示,p38激活先于p38移位。LPS刺激后30 min,p38激酶活性即达到高峰,随后2 h内逐步下降,p38激酶活性呈一过性增高;LPS刺激45 min后,核区荧光强度达到峰值,且在2 h内维持在高水平。结论 单核细胞由LPS激活后,其p38蛋白激酶由胞浆转位到胞核,反应具有一定的特异性;p38移位入核依赖于p38磷酸化活化及由细胞浆移位到细胞核是一系列连续发生的事件。     

星形细胞肿瘤组织中核因子κB的表达与肿瘤增殖

目的：探讨核因子κB(NF—κB)在星形细胞肿瘤中的表达及其与肿瘤增殖之间的关系．方法：应用免疫组织化学方法检测NF—κB p65，cyclin D1和PCNA在64例星形细胞肿瘤组织及10例正常大脑组织中的表达情况．结果：星形细胞肿瘤中NF—κB p65蛋白阳性表达率为54．7％(35／64)，cyclin DI阳性率为42．2％(27／64)，PCNA LI(Labelling index)为2．2％-80．5％，10例正常脑组织中NF—κB p65，cyclin DI均无1例阳性表达，PCNA低表达或无表达．NF—κBp65，cyclin DI及PCNA的表达与星形细胞肿瘤的恶性程度有天．NF-κBp65表达与cyclin DI，PCNA的表达呈显正相关．结论：NF-κB p65是与星形细胞肿瘤相关的癌蛋白，NF-κB p65上调cyclill DI，PCNA的表达，致使肿瘤细胞过度增殖，从而导致肿瘤的发生．     

三七皂苷FC通过MAPK/NF-κB途径抑制RAW264.7细胞炎症及凋亡的机制研究

目的:基于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/核转录因子-κB(NF-κB)途径探讨三七皂苷FC对RAW264.7巨噬细胞炎症及凋亡的作用机制。方法:(1)采用不同浓度的三七皂苷FC(0、1、10、20、50、100μmol/L)分别干预RAW264.7细胞和脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞,CCK8法检测细胞活力,筛选合适的药物浓度。(2)将RAW264.7细胞分为对照组、LPS组、LPS+三七皂苷FC低剂量(20μmol/L)组和LPS+三七皂苷FC高剂量(50μmol/L)组。先给予相应剂量的三七皂苷FC预处理6 h,再加入1μg/ml LPS。干预24 h后,PCR检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、白介素-1β(IL-1β)mRNA表达;Western blot检测TNF-α、iNOS、p38MAPK、磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)蛋白表达;流式细胞术检测细胞凋亡;免疫荧光检测NF-κB核转位;Transwell实验检测细胞迁移。结果:(1)20、50μmol/L三七皂苷FC干预24 h后,LPS诱导的RAW264.7细胞活力较对照组无显著差异(P0.05),用于后续实验。(2)与LPS组相比,低、高剂量的三七皂苷FC作用后,TNF-α、IL-6、iNOS、IL-1β的mRNA表达显著降低(P0.05,P0.01);TNF-α、iNOS蛋白表达明显降低(P0.05),p-NF-κB p65/NF-κB p65和p-p38MAPK/p38MAPK蛋白表达比值显著下调(P0.05,P0.01);细胞凋亡率显著降低(P0.05,P0.01);细胞核内NF-κB p65蛋白表达减少,阳性表达细胞数占比显著降低(P0.05);细胞迁移数显著减少(P0.01)。结论:三七皂苷FC能够显著改善LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应,减少炎症因子的释放,抑制巨噬细胞凋亡和迁移,其作用机制可能与下调MAPK/NF-κB通路磷酸化水平及抑制NF-κB核转位有关。     

NF-κB/IκB信号通路介导血管紧张素Ⅱ诱导的系膜细胞促炎性细胞因子表达

目的：探讨核因子—κB(NF—κB)／IκB信号通路在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的肾小球系膜细胞促炎性细胞因子表达中的作用。方法：应用核酸酶保护法检测系膜细胞肿瘤坏死因子α(TNF—α)、IL-1α和IL-1β mRNA表达；应用凝胶电泳迁移率和Western blot检测肾小球系膜细胞中NF—κB活化、p65亚基核转位以及IκBα和IκBβ的降解。结果：正常培养状态下，系膜细胞可组成型表达TNF—α和IL—1β，而不表达IL-1αmRNA，AngⅡ刺激后促炎性细胞因子表达显著上调，NF—κB特异性抑制剂2-硫代氨基甲酸吡咯烷显著抑制AngⅡ诱导的促炎性细胞因子基因表达；AngⅡ诱导系膜细胞NF—κB活化，p65核转位及胞质内IκBα和IκBα的降解。结论：AngⅡ诱导肾小球系膜细胞中促炎性细胞因子表达可能通过NF—κB／IκB信号转导通路来实现。