α1,3 FucT-VII基因转染对人结肠癌LOVO细胞的作用

 目的 观察α1,3 FucT-VII基因转染对人LOVO细胞的生物学行为的改变 方法 采用RT-PCR和Western blot方法检测转染前后LOVO细胞中α1,3 FucT-VII基因的表达,CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞术分析细胞周期,并通过体外迁移、侵袭实验检测转染前后LOVO细胞运动侵袭能力的变化。 结果 LOVO细胞微弱表达α1,3 FucT-VII,RT-PCR和Western blot方法验证转染后的LOVO/FucT-VII高表达α1,3 FucT-VII。转染后细胞生长增快,S期细胞增多而G1期细胞减少,细胞趋化性迁移和侵袭能力增强。结论 α1,3 FucT-VII基因能改变人结肠癌LOVO细胞的生物学行为,增强细胞趋化性迁移和侵袭等转移表型。     

小鼠内皮抑制素真核质粒的构建表达及其体外活性

目的构建小鼠内皮抑制素(endostatin)真核表达质粒,进行分泌性表达,研究其体外生物学活性,以进一步用于肿瘤的基因治疗。方法人工合成小鼠Igκ轻链信号肽序列,RT-PCR获得小鼠内皮抑制素编码序列,一起克隆入真核表达载体pcDNA3.1中,对其进行酶切鉴定和序列分析。重组质粒经脂质体介导转染受体细胞BHK-21,ELISA检测细胞培养上清中内皮抑制素的含量。用此上清作用于经bFGF刺激的ECV304内皮细胞和HepG2肝癌细胞,MTT法检测细胞的增殖。结果经酶切鉴定及DNA测序分析,Igκ信号肽序列及内皮抑制素编码序列成功克隆到目的位点上,其转染细胞上清中可以检测到分泌出的内皮抑制素,含量为(65.5±10.9)ng/106细胞;并且可以抑制ECV304内皮细胞的增殖,抑制率约为29.2%,而对HepG2肝癌细胞增殖没有影响。结论成功构建了小鼠内皮抑制素真核质粒,其分泌性表达产物可以抑制内皮细胞的增殖,具有较好的生物学活性。     

重组人β防御素2在膀胱上皮细胞中的表达及活性检测

目的探讨重组人β防御素2(hBD2)真核表达载体在人膀胱上皮细胞中的表达,并观察重组hBD2的体外抗菌活性。方法采用脂质体转染法将hBD2重组真核表达质粒pCAGG-hBD2导入无血清培养的人膀胱上皮细胞株T24细胞,利用RT-PCR法、Western blotting分别在核酸水平及蛋白质水平检测hBD2的表达。ELISA测定培养上清中hBD2的浓度,菌落计数法检测上清对尿路致病性大肠杆菌(UTI89)和克雷白杆菌(TOP52)的临床分离株的抗菌效果。结果 RT-PCR和Western blotting结果显示,转染后hBD2可在T24细胞中有效地表达。上清中hBD2的含量为(36.5±3.2)ng/106个细胞,菌落计数法显示,hBD2对UTI89和TOP52临床分离株有显著的杀菌作用。结论 hBD2重组真核表达载体脂质体法转染人膀胱上皮细胞后,可高效表达具抗菌活性的基因重组hBD2。     

可溶性HVEM-Ig融合蛋白的真核表达、鉴定、纯化及生物学活性检测

目的:构建含鼠疱疹病毒侵入介质（herpesvirus entry mediator,HVEM）胞外区和IgG2a Fc段重组表达质粒,真核表达HVEM-Ig融合蛋白,鉴定、纯化,并检测其生物学活性。方法:通过RT-PCR从BALB/c小鼠脾细胞总RNA中扩增HVEM胞外区片段,WT-1杂交瘤细胞总RNA中扩增鼠IgG2a Fc片段,克隆入真核分泌型表达载体pSecTag2A,转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO）,表达产物用rProtein A凝胶进行亲和层析纯化,获得目的蛋白,并进行SDS-PAGE和Western印迹分析。在单向混合淋巴细胞反应中加入不同浓度的HVEM-Ig融合蛋白作为处理组,同时以加入IgG蛋白的作为阴性对照和未处理的混合淋巴细胞作为空白对照,分别采用\[3H\]-TdR掺入法和ELISA法观察淋巴细胞增殖程度和细胞因子分泌情况。结果:成功构建重组质粒pSecTag2A-HVEM-Ig,表达及纯化HVEM-Ig融合蛋白,并对蛋白的理化性质进行了鉴定。\[3H\]-TdR掺入法和ELISA法结果显示：与对照组相比,该融合蛋白呈剂量依赖性抑制淋巴细胞增殖和IFN-γ、TNF-α、IL-2等细胞因子的分泌(P<0.05或P<0.01)。结论:成功构建了HVEM-Ig融合蛋白真核表达体系,融合蛋白具有预期的抑制淋巴细胞活性及细胞因子分泌的功能,为后续研究该分子在自身免疫和移植免疫反应中的机制奠定了基础。     

HBD3基因真核表达质粒载体的构建及其体外表达和活性鉴定

目的构建人β防御素3(HBD3)基因真核表达质粒载体,观察其在大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的表达,并检测其活性。方法利用RT-PCR方法从牙龈组织中扩增出HBD3基因片段,通过DNA重组技术将基因片段重组于pVIVO1-mcs真核表达质粒载体上,构建成pVIVO1-HBD3重组质粒载体,分别用酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组质粒载体进行鉴定。运用jetPEI转染试剂将重组质粒转染BMSCs后,RT-PCR、免疫荧光和蛋白质印迹法检测目的基因的表达。取转染重组质粒的BMSCs无血清上清的浓缩液,采用K-B纸片扩散法进行抗菌活性实验。结果 (1)酶切电泳分析得到相应的目的片段,大小与理论计算值一致,DNA测序证实目的基因序列正确无突变,成功构建真核表达质粒载体pVIVO1-HBD3。(2)RT-PCR和免疫荧光、蛋白质印迹法分别从mRNA和蛋白质2个水平证实转染的BMSCs高表达HBD3。(3)转染重组质粒的BMSCs无血清上清的浓缩液对白色念珠菌、大肠埃希菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌产生明显的抑菌环,证实了表达分泌出的HBD3的抗菌活性。结论构建了pVIVO1-HBD3基因真核表达质粒载体,证实其转染BMSCs后基因的表达和活性。     

血管活性肠肽真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建一种具有生物学活性的血管活性肠肽(VIP)的真核表达质粒.方法:利用RT-PCR从小鼠胸腺淋巴细胞中克隆有信号肽序列的VIP cDNA,插入真核表达载体pcDNA3.1,构建含VIP的重组质粒pcDNA3.1-VIP,转染COS-7细胞,用ELISA和Western blot鉴定表达的蛋白,细胞因子释放抑制法测定生物学活性.结果:经酶切和基因测序证实,克隆的基因片段为带有信号肽序列的VIP基因;经转染的COS-7细胞表达VIP蛋白,并能有效地抑制巨噬细胞的TNF-α释放.结论:成功构建了能够表达具有生物学活性的真核表达质粒pcDNA3.1-VIP.     

稳定表达猪α1,3-半乳糖苷基转移酶基因的人肺腺癌细胞系的建立和鉴定

目的 建立稳定表达中国近交系版纳微型猪(BMI)α1,3-半乳糖苷基转移酶基因(α1,3-GT)和α-半乳糖基(Gala1-3Galb1-4GlcNAc-R,α-gal)的人肺癌细胞株,为进一步研究人体血清经补体依赖的细胞毒性作用杀伤表达异种移植抗原的肿瘤细胞提供细胞模型.方法 将含有版纳微型猪α1,3-GT基因的pEGFP-CMV-GT质粒经脂质体法体外转染人肺腺癌细胞A549,G418筛选稳定表达的细胞克隆并扩增,命名为A549-GT.用RT-PCR检测A549-GT中α1,3-GT基因的mRNA表达,荧光显微镜和流式细胞仪检测α1,3-GT在细胞膜表面合成α-gal表位的能力以及A549-GT与人血清中IgM和补体C3结合情况.检测转染细胞形态学、生长增殖能力以及裸鼠成瘤性等生物学特征.结果 经G418反复筛选获得了稳定转染α1,3-GT基因的A549-GT的细胞系,该细胞中检测到α1,3-GT mRNA和α-gal表达.A549-GT传代至今已2年,α-gal表达的阳性细胞达80.1%±3.2%.A549-GT细胞能与人血清中的IgM结合并有补体C3沉积.其生物学特性与亲代A549细胞相比未发生变化.结论 成功获得持续稳定表达猪α1,3-GT和α-gal的细胞系A549-GT,为该基因在后续肿瘤免疫治疗中的研究提供有用的细胞研究模型.     

α1,3 FucT-Ⅶ基因转染对人结肠癌LOVO细胞的作用

目的观察α1,3 FucT-Ⅶ基因转染对人LOVO细胞的生物学行为的改变。方法采用RT-PCR和Western blot方法检测转染前后LOVO细胞中α1,3 FucT-Ⅶ基因的表达,CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞术分析细胞周期,并通过体外迁移、侵袭实验检测转染前后LOVO细胞运动侵袭能力的变化。结果LOVO细胞微弱表达α1,3 FucT-Ⅶ,RT-PCR和Western blot方法验证转染后的LOVO/FucT-Ⅶ高表达α1,3 FucT-Ⅶ。转染后细胞生长增快,S期细胞增多而G1期细胞减少,细胞趋化性迁移和侵袭能力增强。结论α1,3 FucT-Ⅶ基因能改变人结肠癌LOVO细胞的生物学行为,增强细胞趋化性迁移和侵袭等转移表型。     

人alpha防御素1真核表达载体的构建及其对A549细胞增殖的影响

目的:观察重组人alpha防御素1(HNP1)真核表达质粒对体外培养人肺腺癌细胞A549增殖的影响.方法:从人外周血白细胞中提取总RNA,通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)得到人HNP1成熟肽基因片断.构建pSecTag-HNP1重组质粒,转染A549细胞,并设pSecTag转染组、脂质体转染组和未转染组作为对照.RT-PCR验证HNP1的表达,MTT法检测肿瘤细胞的生长情况,流式细胞仪及PI染色检测细胞凋亡情况.结果:构建了重组质粒pSecTag-HNP1,测序正确.转染A549细胞后,RT-PCR成功扩增出HNP1片断.与其他3组相比,HNP1转染A549细胞48 h后细胞的生存率降低,差异有统计学意义(P均<0.05).流式细胞仪及PI染色结果显示pSecTag-HNP1转染后的细胞凋亡增多(P<0.05).结论:转染pSecTag-HNP1后,重组HNP1能够在A549细胞中表达并有效地抑制A549细胞的增殖,促进细胞凋亡.     

人低氧诱导因子-1α重组腺病毒的构建和鉴定

目的 利用AdMax腺病毒载体系统构建人重组低氧诱导因子-1α(rhHIF-1α)基因腺病毒并在293细胞中扩增制备重组病毒. 方法 自先期构建的pcDNA4-rhHIF-1α真核表达载体中用RT-PCR法扩增出rhHIF-1α基因片段,将其克隆入线性化的pEGFP1-C1质粒中,用PCR法扩增EGFP-rhHIF-1α基因片段,将其克隆入PUC18质粒中.酶切构建好的pUC18-rhHIF-1α载体并克隆进入穿梭质粒PDC316中,将构建好的穿梭质粒PDC316-rhHIF-1α载体和骨架病毒pBHGlox△1,3Cre共转染293细胞,包装成重组的病毒颗粒.重组的病毒转染SG-7901细胞,荧光显微镜观察绿色荧光表达. 结果 经限制性内切酶检测和GFP表达证实成功地构建了携带重组人HIF-1α基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒. 结论 成功地构建了携带rhHIF-1α基因片段的重组腺病毒载体.     

人α1微球蛋白质的克隆、表达、纯化及生物学活性鉴定

目的：构建人α1微球蛋白质（α1-microglobulin, α1M）基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达α1M蛋白质,纯化并初步鉴定其生物学活性。方法：PCR扩增α1M基因序列,然后转化入大肠杆菌B834中进行表达,利用镍离子亲和层析、离子交换层析及分子筛纯化,ABTS法鉴定其生物学活性。结果：正确构建了α1M的表达质粒,α1M在大肠杆菌B834中为可溶性上清表达,纯化获得了纯度高达95%的α1M蛋白质,分子筛结果显示其在溶液中呈现单体和二聚体2种聚集状态,ABTS法结果显示了重组获得的α1M具有抗氧化活性。结论：α1M能在大肠杆菌B834菌中大量上清表达,且易于纯化,初步鉴定具有抗氧化活性,为下一步进行α1M蛋白质的晶体结构解析和相关功能研究奠定了基础。     

基因转染3T3细胞的hTGFβ1表达

目的鉴定重组pcDNA3.1-TGFβ1载体在真核细胞中的表达,为其在软骨组织工程中的基因转染创造条件.方法利用脂质体Fugene 6将TGFβ1真核表达载体转染至NIH3T3细胞,RT-PCR、ELISA检测hTGFβ1基因的表达,并利用CCL/64细胞株鉴定重组hTGFβ1的生物学活性. 结果质粒转染3T3细胞后,hTGFβ1mRNA及其蛋白的表达均显著增强,且分泌表达的hTGFβ1能明显抑制CCL/64细胞的生长结论重组载体在3T3细胞中能表达具有一定生物学活性的hTGFβ1。     

结核杆菌cfp10真核载体的构建、表达与基因免疫

目的: 构建以结核分枝杆菌H37Rv cfp10基因为基础的基因疫苗. 方法: 采用BamH I和Xba I双酶切质粒pGEM-Teasy-CFP10中,10 g*L-1琼脂糖凝胶电泳回收约300 bp大小片段,以亚克隆法构建于真核表达载体pcDNA3.1的相应酶切位点. 阳性克隆提取质粒,体外电穿孔转化CHO细胞,RT-PCR法检测cfp10特异的mRNA的表达. 质粒肌注免疫BALB/c小鼠,ELISA检测小鼠血清中相应抗体的滴度. 结果: 用BamH I和XbaⅠ酶切鉴定证实目的基因正确插入载体pcDNA3.1,命名为pcCFP10; pcCFP10转化的CHO细胞RNA提取物中,RT-PCR扩增出300 bp大小的条带. 肌注免疫BALB/c小鼠,ELISA检测小鼠血清中相应抗体平均滴度为1∶ 4,000. 结论: 以CFP10的编码基因为基础的真核表达质粒的构建成功.     

人低氧诱导因子1α真核表达质粒的构建和鉴定

目的:构建人低氧诱导因子1α(HIF-1α)真核表达质粒及其在人肝癌细胞(HepG2)中的表达。方法:从HepG2细胞中提取总RNA,通过RT-PCR逆转录,获得HIF-1α的cDNA,双酶切后构建真核表达载体pcDNA3.1(+),测序验证碱基序列。用脂质体法将质粒pcDNA3.1(+)-HIF-1α转染至HepG2,以免疫荧光和Western Blot法分别对转染细胞进行HIF-1α表达分析。结果:扩增出HIF-1α全长cDNA,构建真核表达质粒,测序结果正确。经检测的质粒转染至HepG2细胞后,HIF-1α蛋白水平高于转染空载细胞。结论:成功构建人HIF-1α基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HIF-1α,并证明其能在HepG2细胞内表达。     

重组人Importin α的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的重组表达人细胞核输入蛋白α（Importin α）,制备多克隆抗体。方法提取人肝癌细胞HepG2中的总RNA,RT-PCR法扩增Importin α基因。构建pGEX-6P-1-Importin α融合表达载体,转化大肠埃希菌BL21,以异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达GST-Importin α重组蛋白,经谷胱甘肽亲和层析纯化,然后免疫小鼠,制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价。结果 RT-PCR扩增出的Importin α基因片段（1300bp）与理论大小一致。SDSPAGE和蛋白质印迹分析纯化GST-Importin α重组蛋白相对分子质量为83kD,与质谱分析的相对分子质量结果相符。重组蛋白免疫小鼠后收获抗血清,ELISA显示抗体效价高。结论在大肠埃希菌中成功表达并纯化Importin α蛋白,获得多克隆抗体,为进一步研究输入系统及其应用打下基础。     

人β防御素2(HBD2)与人乳头瘤病毒 HPV16E6羧基端编码基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的构建人β防御素与人乳头瘤病毒HPV16E6羧基端基因的真核表达质粒,并检测其在真核细胞中的表达情况,探讨其作为DNA疫苗治疗宫颈癌的可行性.方法利用分子克隆技术,将HBD2基因片段与HPV16E6羧基端基因片段连接,插入真核表达质粒pcDNA3.1,经测序鉴定后,用阳离子脂质体法转染真核细胞COS7,RT-PCR及免疫组化法检测其表达.结果重组质粒pcDNA 3.1/HBD2-HPV16E6C转染COS7细胞48小时后,RT-PCR扩增出插入的HBD2-HPV16E6C片段,免疫组化染色呈棕黄色阳性反应.结论人β防御素与人乳头瘤病毒HPV16E6羧基端融合基因能在真核细胞中有效表达,为今后进行整体动物DNA免疫试验奠定了基础.     

sflk1-IFN-γ双功能蛋白基因重组质粒的构建和表达及生物学活性鉴定

目的:构建表达可溶性血管内皮生长因子受体2(sVEGFR2,在小鼠又称sflk1)与IFN-γ双功能蛋白的重组质粒pcDNA3.1(+)/sflk1-IFN-γ,对表达的sflk1-IFN-γ重组蛋白的生物学活性进行鉴定.方法:以RT-PCR法分别扩增出sflk1与小鼠IFN-γ基因片段,克隆入pcDNA3.1(+)载体,将该重组质粒表达于真核细胞,以ELISA和Western blotting分别检测胞外及胞内sflk1-IFN-γ双功能重组蛋白的表达,并对该蛋白的生物学活性进行鉴定.结果:构建的pcDNA3.1(+)/sflk1-IFN-γ重组质粒能够在真核细胞中有效表达,且表达的sflk1-IFN-γ重组蛋白兼有sflk1和IFN-γ两者的生物学活性.结论:成功构建和表达了sflk1-IFN-γ双功能蛋白基因重组质粒,为进一步研究该双功能蛋白的抗肿瘤作用打下了基础.     

人α-防御素5在毕赤酵母中分泌表达的研究

目的 探索人α-防御素5成熟肽(mHD5)在酵母中高效分泌表达的可行性.方法 PCR扩增获得酵母菌偏好的mHD5密码子序列,应用基因重组方法构建表达质粒,电击转化酵母菌株GS115,应用G418浓度梯度、表型和PCR技术筛选高拷贝转化株.经摇瓶发酵和甲醇诱导,Tricine-SDS-PAGE分析重组mHD5(rmHD5)表达量,并采用Western blot鉴定.选用琼脂扩散法检测rmHD5的抑菌活性.结果 构建了pPIC9K-mHD5酵母表达质粒.筛选得到3株His /Mut 表型,且耐受8 mg/ml G418的多拷贝转化酵母菌株,成功获得表达量约120 mg/L的发酵上清.rmHD3对大肠杆菌(EC25922)和金黄色葡萄球菌(SA25923)2种标准菌株均具有明显的抑菌活性.结论 防御素基因可以在毕赤酵母中实现分泌型离表达,此策略可能是抗菌肽工业化开发的有效途径之一.     

pEGFP-NeuroD重组质粒在肝癌细胞中的表达及其功能探讨

目的:利用含绿色荧光蛋白的重组表达质粒pEG-FP-NeuroD做基因转染,观察其在肝癌细胞(HepG2)中的表达,探讨其在体外诱导肝细胞分泌胰岛素的可能性.方法:将酶切验证正确的重组质粒pEGFP-NeuroD,用脂质体法转染3种不同葡萄糖浓度培养的HepG2细胞,荧光显微镜下观测各组绿色荧光蛋白的表达情况;采用RT-PCR方法检测HepG2细胞中NeuroD-1及insulin mRNA的表达;采用Western Blot方法检测EGFP-NeuroD融合蛋白的表达.结果:①重组质粒体外成功转染入HepG2细胞,在荧光显微镜下可见强绿色荧光蛋白的表达,重组质粒转染率在30%～40%之间;②RT-PCR方法及Western Blot在3种不同葡萄糖浓度培养的细胞组中均榆测到NeuroD-EGFP融合蛋白的表达,其中RT-PCR方法扩增出NeuroD-1目的片段大小为634 bp,而融合蛋白Mr大小约为67×103,但是3组间蛋白表达量均无明显差异;③RT-PCR法未检测到肝癌细胞胰岛素的分泌.结论:重组表达质粒pEGFP-NeuroD可体外转染入HepG2细胞,功能探讨提示单一NeumD-1表达质粒的转染可能不足以诱导肝癌细胞分泌胰岛素.     

髓系细胞触发受体-1真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建髓系细胞触发受体-1(TREM-1)的真核表达质粒.方法:利用RT-PCR从人外周血总RNA中扩增TREM-1 基因的全长cDNA,插入克隆载体pUCm-T,BamH I和Pst I,酶切后将目的片段插入真核表达载体pEGFP-C3,构建含有TREM-1的重组质粒pEGFP-TREM-1,转染293细胞,用荧光显微镜观察、Western-blot鉴定蛋白表达.将pEGFP-TREM-1重组质粒转染THP-1细胞,100 ng/ml LPS刺激24 h后,半定量RT-PCR检测TNF-α和IL-1β基因的 mRNA水平.结果:经酶切和基因测序证实,克隆的基因片段为TREM-1基因;经转染的293细胞在荧光显微镜下可见荧光,并能表达TREM-1蛋白;重组TREM-1蛋白具有生物学活性,能增强TNF-α和IL-1β基因的mRNA水平.结论:成功构建了能够表达TREM-1的真核表达质粒pEGFP-C3-TREM-1,为进一步研究该基因的功能奠定了实验基础.