siRNA抑制HPV18 E6基因及其对HeLa细胞凋亡的影响

目的研究特异小干扰RNA(sm all interfering RNA,siRNA)对宫颈癌HeLa细胞中人乳头瘤病毒(hum an pap-illom avirus,HPV)18型E6基因的抑制及其对细胞凋亡的影响。方法针对HPV18E6基因设计siRNA序列,经PCR方法体外扩增,得到含有U6启动子以及siRNA序列的PCR产物,利用L ipofectam ineTM2000脂质体转染HeLa细胞,在U6启动子的作用下于细胞内转录siRNA。针对转染后不同时间点采用四唑盐(MTT)比色法测定细胞活力,流式细胞仪PI染色法检测细胞凋亡率,RT-PCR测定HPV18E6 mRNA变化。结果转染siRNA后细胞活力受到显著抑制(P<0.05),光镜下出现明显的凋亡形态,72 h的凋亡率达到55.8%。RT-PCR结果显示,细胞转染24、48和72 h后HPV18E6 mRNA分别减少了57%、78%和40%,而siRNA阴性对照与未转染细胞相比差异不显著。结论siRNA可特异有效的干扰宫颈癌HeLa细胞内HPV18E6基因的表达,从而可诱导肿瘤细胞凋亡。     

HPV18 E6 siRNA对宫颈癌细胞增殖及化疗药物敏感性的影响

目的探讨HPV18 E6siRNA联合紫杉醇应用对宫颈癌细胞生长的影响。方法用RNAi抑制HeLa细胞中HPV18 E6蛋白的表达。Western blot检测E6、P53和P21的蛋白表达量,MTT法检测细胞的增殖活性及细胞对紫杉醇的敏感性。结果抑制HPV18 E6的表达后,P53和P21的表达量均显著升高,HeLa细胞的生长受到抑制(P<0.01)。加入紫杉醇后,细胞增殖速度较对照组明显降低(P<0.01)。结论HPV18 E6siRNA可有效沉默HeLa细胞中E6基因的表达,抑制细胞增殖,并提高细胞对化疗药物的敏感性。     

特异性siRNA体外抑制HDGF基因对人大肠癌细胞凋亡的影响

目的：了解HDGF基因在体外是否对大肠癌细胞凋亡具有调控作用。方法设计特异性小干扰RNA抑制HDGF基因表达,本试验分为3组：空白对照组、非特异性siRNA转染的阴性对照组及HDGF特异性siRNA干扰组。通过AnnexinV?FITC流式双染, Hoechst 33258荧光染色等方法检测转染前后细胞凋亡变化,运用免疫印迹法检测转染HDGF?siRNA前后相关凋亡蛋白的变化情况。结果与2个对照组相比, HDGF?siRNA处理组细胞早期凋亡率明显上升至（14．1±1．24）％,差异具有统计学意义（P＜0．05）,在形态学上有20％的细胞出现染色质浓染的凋亡小体,而对照组基本未见;此外与2个对照组相比, HDGF?siRNA处理组细胞中bcl?2及Survivin蛋白含量均有明显下调,而Bax明显上调、 Cyt?c从线粒体释放到胞浆、 caspase?9及caspase?3被激活。结论 HDGF?siRNA能在体外有效诱导大肠癌胞发生凋亡,线粒体凋亡途径在HDGF基因介导的凋亡调控中起重要作用,这暗示HDGF将可能成为大肠癌基因治疗的一个极佳的分子靶点。     

siRNA抑制SARS冠状病毒感染Vero E6细胞

目的　用RNA干扰技术特异性抑制SARS冠状病毒在非洲绿猴肾细胞VeroE6中的增殖。方法　体外转录合成针对SARS CoVRNA的siRNA ,使用脂质体转染的方法导入细胞 ,观察并估算病毒感染细胞病变值 ,MTT法检测细胞存活率 ,RT PCR确定胞内病毒RNA水平。结果　成功筛选出 4组siRNA能够显著降低SARS CoV感染细胞中病毒RNA水平 ,提高感染细胞存活率。结论　应用RNAi技术可以有效阻止病毒在细胞中增殖 ,为治疗病毒性疾病提供了新思路。     

siRNA介导的IBP表达抑制对 T细胞凋亡的影响

目的 研究IBP表达抑制后对T细胞凋亡产生的影响.方法 构建IBP siRNA稳定表达及阴性对照载体,脂质体法转染Jurkat T细胞,G418筛选稳定转染细胞株,用anti-CD3和CD28 mAb刺激介导的TCR信号方式作用于稳定转染细胞后,以3H-TdR掺入实验检测细胞增殖,Annexin-v/PI双参数法经流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 TCR信号刺激下,阴性对照组细胞的3H-TdR掺入量在24h时下降为未刺激对照组的67%,随时间延长其下降更显著,且24h发生明显凋亡,凋亡率为21.96%;IBP siRNA表达载体转染细胞在不同时相点的增殖均不受影响,24h凋亡率仅为2.12%,比阴性对照组细胞显著降低.结论 IBP缺失能使TCR信号刺激下的细胞激活后凋亡受到抑制,提示IBP可能参与T细胞免疫自稳状态的调节.     

HPV16,HPV18E6单抗SP法染色体会

ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８Ｅ６单抗ＳＰ法染色体会任占平作者单位：广西柳州市第一人民医院病理科５４５００１近年来，人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）１６、１８感染已被证实与人宫颈癌、肺癌、食管癌、大肠癌等恶性肿瘤病因学密切相关〔１，２〕。但目前国内对ＨＰＶ１６、ＨＰＶ...     

siRNA抑制ErbB2基因的表达及对乳腺癌细胞生长的影响

目的:设计并构建ErbB2的小干扰RNA,检测其对ErbB2蛋白表达的干扰效果,并检测其对乳腺癌细胞ZR75-1生长的影响。方法:设计2条针对ErbB2的siRNA,并克隆到siRNA表达载体pSliencer 2.1-U6 neo上。经酶切和测序证明构建成功后,将其与pcDNA3-FLAG-ErbB2共转染于293T细胞,以及单转siRNA于乳腺癌SKBR3和ZR75-1细胞,通过Western blot分别检测siRNA对外源和内源ErbB2的干扰效果。通过结晶紫实验研究siRNA对ZR75-1生长的影响。结果:Western blot证明构建的两条ErbB2 siRNA均能有效抑制外源和内源ErbB2蛋白的表达,并抑制乳腺癌ZR75-1细胞的生长。结论:构建的siRNA能有效地抑制ErbB2蛋白的表达并抑制ZR75-1细胞的生长。     

肿瘤抑制基因与细胞凋亡

肿瘤抑制基因ｐ５３，Ｒｂ，ｐ１６，ｎｍ２３等参与调控肿瘤细胞等多种细胞的凋亡。它们既具有单一的调节作用，又具有复杂的协同效应。研究这些基因在细胞凋亡中的调控机制，对利用基因治疗技术治疗恶性肿瘤具有重要意义     

HPV18型E2蛋白高表达对巨噬细胞凋亡及其分泌功能的影响

目的:研究HPV18 E2及其N端(TAD)、C端(DBD)与GFP融合蛋白瞬时高表达对巨噬细胞(MΦ)凋亡及分泌活性的影响,为进一步研究E2蛋白在HPV18致癌机制中的作用奠定实验基础.方法:通过PCR从现有真核表达载体pEGFP-C1/E2上分别扩增出TAD、DBD基因片段,并构建真核表达载体pEGFP-C1/TAD、pEGFP-C1/DBD.将3种真核表达载体及pEGFP-C1分别转染MΦ,用倒置荧光显微镜观察它们的表达与定位,并以抗GFP抗体为一抗作Western blot检测它们的表达.通过3种融合蛋白在MФ内的瞬时高表达,在转染48 h后分别检测各组细胞培养基中TNF-α和IL-1β的含量,并收集MΦ经染色以及流式细胞术(FCM)观察检测其凋亡.结果:GFP-E2融合蛋白主要表达于细胞核,细胞质内也有表达,而GFP-DBD融合蛋白仅表达于细胞核内,GFP-TAD仅表达于细胞质.GFP-E2、GFP-TAD融合蛋白在MΦ内高表达后MΦ凋亡率上升,细胞因子TNF-α和IL-1β分泌量增加,且GFP-TAD作用强于GFP-E2.而EGFP-DBD无此作用.结论:HPV18 E2及其TAD与EGFP融合蛋白瞬时高表达可诱导MΦ凋亡并上调其分泌细胞因子TNF-α和IL-1β.     

HPV 16 E6E7基因修饰树突状细胞疫苗诱导CTL致CaSki细胞凋亡体外实验研究

目的:采用人乳头状瘤-16(HPV-16)E6E7重组腺病毒(pAd-E6E7)转染树突状细胞(Dendritic cell,DC),观察基因修饰的DC疫苗诱导细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic Tlymphocyte,CTL)致使CaSki细胞凋亡的效果。方法:将pAd-E6E7转染体外培养的小鼠未成熟树突状细胞制备DC疫苗,激光共聚焦显微镜观察转染的小鼠未成熟树突状细胞绿色荧光蛋白表达,流式细胞术检测转染前后小鼠树突状细胞表面标志物(CD40、CD86、MHCⅡ和CD11C)。DC疫苗诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞,与CaSki细胞共培养后,采用DAPI、TUNEL及流式细胞术检测CaSki细胞凋亡情况。结果:pAd-E6E7成功转染体外培养的小鼠未成熟树突状细胞,体外转染效率约为40%～50%,成功制备了HPV16 E6E7基因修饰树突状细胞疫苗,诱导产生细胞毒性T淋巴细胞,经DAPI、TUNEL及流式细胞术检测证明CaSki出现凋亡。结论:以带有HPV16 E6E7基因的重组腺病毒载体转染DC制备基因修饰的DC疫苗,诱导CTL致使CaSki细胞出现凋亡。     

siRNA抑制nm23-H1基因表达对鼻咽癌6-10B细胞生物学行为的影响

目的：采用RNA干扰技术下调nm23-H1基因在鼻咽癌6-10B细胞中的表达,探讨nm23-H1表达下调对6-10B细胞生物学行为的影响。方法：采用脂质体法将nm23-H1基因siRNA(nm23-H1 siRNA)瞬间转染6-10B细胞,Western 印迹检测转染细胞中nm23-H1蛋白的表达水平,然后利用MTT法、流式细胞术和Transwell小室实验分别检测转染6-10B细胞的增殖、细胞周期和体外迁移侵袭等生物学行为的变化;测序检测6-10B细胞nm23-H1基因有无S120G 点突变。结果： nm23-H1 siRNA有效地下调nm23-H1基因的表达, nm23-H1 siRNA转染6-10B细胞的增殖能力增强,S期细胞增多,体外迁移和侵袭能力增强（P<0.05）。6-10B细胞nm23-H1 基因无S120G 点突变。结论：nm23-H1基因具有抑制人鼻咽癌细胞6-10B增殖和体外迁移侵袭的作用。     

siRNA干扰沉默HOXA9基因对急性白血病K562细胞凋亡的影响

白血病是一种发生于造血组织的恶性疾病,其特点是某一类型白血病细胞在骨髓组织或其他造血组织中呈肿瘤性增生.白血病发病率占儿童恶性肿瘤的第一位.在我国白血病的患者30％是儿童.急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)约占儿童急性白血病的20％,过去20年,5年生存率已上升至60％[1].     

siRNA沉默p110β基因对子宫内膜癌lshikawa细胞凋亡与侵袭的影响

目的利用siRNA沉默子宫内膜癌lshikawa细胞中p110β的表达,探讨其对子宫内膜癌细胞凋亡与侵袭的影响。方法构建p110βsiRNA的表达载体,并转染Ishikawa细胞。RT-PCR方法检测转染前后Ishikawa细胞中p110β的表达情况;流式细胞技术分析转染前后Ishikawa细胞的凋亡变化,Transwell实验检测转染前后Ishikawa细胞侵袭能力的变化。结果 siRNA重组质粒pGCsi-p110β对Ishikawa细胞中p110βmRNA的表达抑制率为88.90%,明显高于对照组(P0.05)。转染pGCsi-p110β的Ishikawa细胞凋亡率为18.3%,显著高于对照组的11.0%,而Ishikawa细胞穿膜数目显著低于对照组(P0.05)。结论沉默p110β的表达诱导子宫内膜癌lshikawa细胞凋亡并抑制侵袭。     

HPV16/18和HPV16E6/E7DNA在宫颈癌组织中的表达

目的检测HPV16/18和HPV16E6/E7 DNA在宫颈癌组织中的表达,探讨其在宫颈癌发病中的作用.方法应用PCR和琼脂糖凝胶电泳方法检测46例宫颈癌组织中HPV16/18和HPV16E6/E7DNA.结果 46例宫颈癌中56.5%(26/46)扩增HPV16/18 DNA,其中宫颈鳞癌25例,宫颈腺癌1例.正常对照组20例HPV16/18DNA均为阴性,与宫颈癌组相比差异有显著性(P<0.01).HPV16/18 DNA阳性拷贝对数值为4.32±2.45.HPV16E6,E7DNA分别有53.8%(14/26)、46.2%(12/26)扩增.结论 HPV16/18和HPV16E6/E7 DNA与宫颈癌的发生密切相关,是宫颈癌恶性转化的关键之一,预示着宫颈癌有较强的增殖能力和转移能力.     

转染HPV16E6基因人树突状细胞疫苗的制备及生物学特性

目的：制备来源于人外周血并转染HPV16E6基因的树突状细胞（DC）疫苗，检测其细胞形态、分子表型及诱导的免疫效应。方法：细胞因子扩增人外周血DC，Lipofectamine转染HPV16E6制备DC疫苗。动态形态学观察，免疫细胞化学及流式细胞术检测分子表达．体外诱导并测定CTL活性。结果：转染DC呈形态迥异的多突起状，其E6蛋白、CD80、CD86和CD83分子的表达率依次为47．3％、82．5％、79．8％和85．7％，诱导杀伤Caski细胞的活性明显高于对照组（P〈0．01）。结论：转染DC疫苗保持了功能成熟DC的形态特征，且内源性表达E6蛋白，能诱导高效的特异性抗肿瘤免疫应答。     

携带端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体对星形胶质细胞凋亡的影响

背景：端粒酶反转录酶对端粒酶的激活和活化有重要的作用,利用端粒酶反转录酶的慢病毒载体抑制星形胶质细胞表达对脊髓损伤修复的影响鲜见报道。目的：利用靶向大鼠脊髓源星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的慢病毒载体转染大鼠星形胶质细胞,并观察端粒酶反转录酶基因的慢病毒载体对星形胶质细胞凋亡的影响。方法：原代及传代培养大鼠星形胶质细胞。实验分为端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体转染组、单纯慢病毒转染组和空白组,转染后并测其转染率,且在转染后的不同时间段测量大鼠星形胶质细胞的凋亡情况。结果与结论：端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体转染组及单纯慢病毒转染组对星形胶质细胞的转染率达85%-90%。免疫荧光染色及流式细胞仪检测显示,端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体转染组在转染后24-48 h细胞凋亡率达50%-60%。在单纯慢病毒转染组及空白组细胞凋亡率并无显著改变。结果说明,携带端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体可促进大鼠脊髓星形胶质细胞凋亡。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

特异siRNA抑制宫颈癌细胞中人乳头状瘤病毒16型E6表达的研究

目的 优化HPV-16 E6癌基因特异的U6质粒表达的siRNA，抑制HPV癌基因表达及其对子宫颈癌细胞生长繁殖的影响。方法 选择4个分别针对HPV-16 E6 mRNA外显子和内含子序列为靶序列，合成DNA链，构建表达HPV-16 E6短发卡样dsRNA的重组pSilencer1．0-U6载体，导入HPV-16DNA阳性的宫颈癌细胞株CaSki中，观察该细胞中HPV-16 E6、E7基因表达水平及其蛋白含量的变化，并观察细胞生长被抑制的情况。结果 4种HPV-16 E6 siRNA均能降低宫颈癌细胞CaSki的生长速率。通过细胞生长曲线观察到HPV-16 E6 shRNA表达质粒导入细胞0-96h内，可降低细胞生长速度。荧光定量RT-PCR检测HPV-16 E6 siRNA可使宫颈癌细胞株CaSki中HPV-16 E6、E7基因转录的mRNA水平降低，其中针对E6 mRNA内含子的重组shRNA只抑制E6基因的表达水平。Western blot分析表明，4个HPV-16 E6 siRNA作用72h后，未能检测到宫颈癌细胞中HPV-16 E6蛋白。结论 HPV-16 E6 siRNA能使宫颈癌细胞CaSki生长缓慢；选择针对E6内含子的siRNA作用位点，特异性抑制E6表达；而针对E6外显子的siRNA作用位点，可抑制E6和E7基因的表达，是用于治疗HPV阳性宫颈癌细胞的理想靶位。     

应用siRNA抑制K562细胞中c-Myc基因的表达

目的利用小分子干扰RNA(siRNA)技术抑制白血病细胞系K562细胞中c鄄Myc基因的表达,为研究c鄄Myc基因在K562细胞中的作用提供一个新的方法。方法设计c鄄Myc基因特异性小分子干扰RNA,用体外转录方法合成c鄄Myc基因的小分子干扰RNA并转染K562细胞,培养48h后,收集细胞,应用实时荧光定量RT鄄PCR和westernblot方法检测转染细胞中c鄄Myc基因mRNA水平和蛋白表达量的变化,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性。结果转染siRNA后,与对照组相比,实验组c鄄MycmRNA水平和蛋白表达量明显降低,抑制率分别为82.16%和74.0%,MTT法表明实验组的增殖速率明显低于对照组的增殖速率。结论在K562细胞中存在RNA干扰的机制,特异性siRNA能够有效的抑制c鄄Myc基因的表达,为研究c鄄Myc基因在肿瘤细胞中的调节途径提供了一个新的方法。     

宫颈癌细胞HPV16 E6,E7蛋白表达的初步研究

ＳｉＨａ细胞为含有ＨＰＶ16(ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｔｙｐｅ16)的人宫颈癌细胞株,是研究ＨＰＶ16对宫颈癌细胞诱导分化作用的理想模型。流式细胞术(ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒ,ＦＣＭ)是近年发展起来的一种对单细胞进行快速定量分析的新技术,检测速度?..     

ST6Gal Ⅰ基因特异性siRNA对SW480细胞黏附和侵袭力的影响

目的：探讨人α-2,6-唾液酸转移酶（ST6GalⅠ）小分子干扰RNA（siRNA）对ST6GalⅠ高表达的结肠癌SW480细胞株的黏附和侵袭力的影响。方法：设计并合成ST6GalⅠ靶向的siRNA,用脂质体Lipofectamine2000包裹后转染SW480细胞。实验设空白对照组、脂质体对照组、非特异性siRNA组和ST6GalⅠsiRNA组,采用RT-PCR测定细胞中ST6GalⅠmRNA表达水平,流式细胞术检测细胞表面α-2,6-唾液酸含量,并分别用CytoMatrix^TM细胞黏附试剂盒及细胞侵袭分析试剂盒,检测细胞对细胞外基质（ECM）黏附与侵袭力。结果：与空白对照组、脂质体对照组、非特异性siRNA组相比,转染48h后,ST6GalⅠ siRNA组细胞中ST6GalⅠ mRNA表达明显下调;转染72h后,ST6GalⅠ siRNA组细胞表面α-2,6-唾液酸的含量及细胞对ECM的黏附和侵袭力均明显低于其他3个对照组（P〈0.05）。结论：化学合成的靶向ST6GalⅠ的siRNA能够下调SW480细胞中ST6GalⅠ基因的表达,降低细胞对ECM的黏附和侵袭力。本实验为进一步研究应用RNA干扰技术抗肿瘤治疗奠定基础。