保存条件对恒河猴CD8+T细胞活性的影响

目的 通过细胞内细胞因子染色(intracellular cytokine staining,ICS)检测CD8+T细胞反应强度,探究不同保存条件对CD8+T细胞活性影响.方法 采集9只恒河猴外周血,分离外周血单个核细胞(PBMC),一部分新鲜细胞直接用于检测,剩余细胞冻存至-80℃和液氮,冻存1周和1年再用于检测,检...     

哮喘致敏小鼠模型的建立及脾脏CD4+T细胞的分离

目的：建立一种可靠的哮喘致敏小鼠模型及分离脾脏CD4^ T细胞。方法：采用卵蛋白致敏的方法建立模型，运用panning法分离CD4^ T细胞。结果：此模型小鼠肺组织呈现典型的哮喘样病理改变，其外周血、支气管肺泡灌洗液（BALF）中嗜酸性粒细胞百分比（EOS％）显著高于正常对照组（P＜0.01）。CD4^ T细胞纯度经流式细胞术（FCM）检测，纯度达97.3％。结论：此方法建立的模型及分离的CD4^ T细胞可用于哮喘的实验研究。     

免疫磁珠及尼龙毛分离纯化T淋巴细胞的比较研究

目的:探讨免疫磁珠及尼龙毛分离纯化外周血T淋巴细胞的方法及其特点.方法:用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,再分别以尼龙毛和免疫磁珠分离出T细胞,然后使用流式细胞仪鉴定细胞纯度、回收率,以台盼蓝检测细胞活力,MTT法检测细胞增殖性能.结果:免疫磁珠方法分离后T细胞的纯度显著高于尼龙毛分离方法(P＜0.05),而且回收率也大于尼龙毛分离方法(P＜0.001),但二种方法分离的T细胞在细胞活力和增殖性能方面比较差异无显著性(P＞0.05).结论:在细胞生物学研究中,免疫磁珠分离法是有效分纯T细胞的较佳方法.     

α2-肾上腺素受体在T淋巴细胞中的表达

目的：从分子水平揭示T淋巴细胞表达α2-肾上腺素受体（α2-AR）mRNA的现象，为神经内分泌系统调节免疫功能的机制提供更多新的证据。方法：取大鼠肠系膜淋巴结细胞，用尼龙毛柱粘附法分离和纯化T淋巴细胞，应用E花环法检测T细胞的分离纯度，用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测T细胞中α2-AR mRNA的表达。结果：经过对肠系膜淋巴结细胞的分离和纯化，获得的T细胞的纯度明显高于未分离和纯化的淋巴细胞，但分离纯化后的T细胞，其活性仍然保持与分离前T细胞的活性相似；这些纯化的T细胞可表达α2-AR mRNA。结论：淋巴细胞可能像机体的其它组织细胞一样能表达和合成α2-AR。     

尼龙毛分离纯化正常人外周血T淋巴细胞

目的建立尼龙毛分离纯化人外周血T淋巴细胞的方法,并探讨其增殖活性。方法密度梯度离心法分离正常人外周血单个核细胞,以尼龙毛分离出T细胞,使用流式细胞仪鉴定细胞纯度、回收率;MTT法检测细胞增殖活性。结果尼龙毛法分离后T淋巴细胞纯度为(70.70±3.45)%,稍高于分离前(66.71±5.47)%(t=1.746,P0.05)。回收率为(42.4±6.95)%,用植物血凝素(PHA)刺激分离后的T淋巴细胞的刺激指数(SI)为(1.80±0.27)。结论在细胞生物学研究中,尼龙毛分选T淋巴细胞纯度不高,PHA刺激T淋巴细胞的增殖性较强。     

结核菌素纯蛋白衍生物刺激人γδT细胞效应分析

目的 探讨结核菌素纯蛋白衍生物(pure protein derivative,PPD)对人外周血γδT细胞的刺激效应.方法 采用Ficoll密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)后,经尼龙毛柱法分离得T细胞.分别以卡介苗和PPD刺激γδT细...     

分离T淋巴细胞的反选择方法

从前,大多数学者采用E玫瑰花形成的方法分离T淋巴细胞。作者在本文中介绍了一个简便快速高效能分离T淋巴细胞的方法,也就是利用除T细胞外的各种细胞的表面特征来分离T细胞。 用聚蔗糖-泛影葡胺梯度离心法分离人外周血淋巴细胞。将淋巴细胞悬液(内含15％小牛血清)置塑料培养瓶中,37℃温育1小时,除去单核细胞。取该瓶中的细胞悬液0.4毫升加于McCoy’s培养基中,使     

人胎盘源间充质干细胞对T细胞周期及其活化的抑制作用研究

目的 探讨人胎盘源间充质干细胞(hPMSCs)对T细胞增殖抑制作用机制,为其在临床细胞治疗中的应用提供理论依据.方法 应用消化法分离、培养hPMSCs,体外扩增培养3代后用于实验.应用流式细胞术分析hPMSCs对PHA激发下T细胞周期和早期表型CD25、CD69表达的影响,ELISA法检测细胞因子水平.结果 hPMSCs体外可使PHA刺激下的T细胞滞留于细胞周期的G0/G1期,下调活化T细胞早期表型CD25、CD69的表达,抑制IL-2、IFN-r的分泌.结论 hPMSCs体外可通过对T细胞周期的影响抑制其活化和增殖.     

曲古抑菌素A上调CD4T细胞叉头框蛋白3基因表达

目的 探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)干预对正常人CD4+T细胞FOXP3表达的影响.方法 采用密度梯度离心法分离正常人外周血单个核细胞,免疫磁珠分离CD4+T细胞,分别给予TSA 处理培养相应时间后收集细胞,RT-PCR法分析TSA干预对正常CD4+T细胞FOXP3 mRNA表达影响.结果 100 nmol/L TSA干预48h可上调正常CD4+T细胞FOXP3表达.结论 TSA干预能上调CD4+T细胞FOXP3表达.     

磁激活分选法双重分离大鼠外周血单个核细胞CD4~+CD25~+调节性T细胞

目的:应用磁激活细胞分选(MASC)技术从卵白蛋白(OVA)免疫耐受大鼠外周血单个核细胞(PBMCs)中分选出大量高纯度CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+Treg),以研究其在支气管哮喘中的作用。方法:从OVA免疫耐受大鼠外周血中分离出PBMCs,应用MASC技术阴性分选CD4+T细胞,再阳性分选出CD4+CD25+Treg;流式细胞仪检测。结果:分选前的CD4+CD25+Treg细胞占CD4+T细胞数的11.07%,CD4+T细胞占总数的21.88%;CD4阴性分选后,CD4+CD25+Treg细胞占CD4+T细胞数的10.95%,CD4+T细胞占总数的89.28%;CD25阳性分选后,CD4+T细胞超过总数的95%,而CD4+CD25+Treg细胞占总数的90.92%,CD4+CD25+Treg细胞纯度大于90%。结论:应用MASC技术成功从OVA免疫耐受大鼠的PBMCs中分选出了高纯度的CD4+CD25+Treg细胞。     

MICA反应性Vδ1 γδT细胞对上皮肿瘤细胞的细胞毒作用

目的研究人类MHC Ⅰ类链相关基因A(MICA)是否可以在体外诱导Vδ1 γδ T细胞的扩增,并且对MICA反应性Vδ1 γδ T细胞的细胞毒作用进行初步研究.方法采用分子克隆技术原核表达并纯化MICA蛋白,使用重组MICA蛋白在体外诱导肿瘤组织中的Vδ1 γδ肿瘤浸润T淋巴细胞(TILs),3-(4,5-二甲基噻唑-乙-YL)-2,5-二甲基-四唑溴盐(MTT)法检测MICA反应性Vδ1 γδ TILs的细胞毒活性.结果原核表达系统pETT30表达并纯化了MICA;固相化的MICA蛋白可以诱导肿瘤组织中的Vδ1 γδ TILs在体外扩增,同时Vδ1 γδTILs对MICA 的肿瘤细胞具有明显杀伤活性.结论MICA反应性Vδ1 γδ T细胞可能是肿瘤过继免疫治疗的新的候选效应细胞.     

人重组CD137-Fc分子的构建与真核表达

目的构建人CD137-Fc基因的真核表达质粒，并表达有生物学活性的纯化人CD137-Fc融合蛋白。方法从cDNA文库中用PCR扩增cD137全长编码基因，并导入真核表达载体pcDNA3中。测序证实后，继续用PCR扩增其膜外区cDNA，酶切后与hIgGIFc基因一起装入真核表达载体pcDNA3中，转染293T细胞瞬时表达，用夹心ELISA检测其表达情况，经蛋白A亲和纯化，用SDS-PAGE与免疫印迹进行鉴定。结果测序证实构建的CD137与CD137-Fc cDNA阅读框完整，连接部位序列正确；ELISA证实cD137-Fc蛋白的表达；SDS-PAGE与免疫印迹证实其为人cD137-Fc蛋白。结论获得了纯化的hCD137-Fc融合蛋白，为探讨CD137在免疫自稳调节中的地位，以及探索CD137的其它生物学功能奠定了坚实的实验基础     

江西省实验动物科技工作现状及发展对策思考

遵照省科技厅赣科发财字[2003]263号文件的精神，我们组成了3个调查组分别于2004年2月对全省实验动物科技工作进行了一次较全面的现场调查。现就调查了解到的基本情况并根据调查反馈的资料所反映的我省实验动物科技工作现状，提出今后的发展对策报告如下。     

应激免疫抑制蛋白的细胞来源

目的:研究应激免疫抑制蛋白(immunosuppressive protein of stress, ISPS)的细胞来源.方法:免疫荧光染色后,运用流式细胞仪和激光扫描共焦显微镜两种技术对ISPS进行定性和定量研究.结果:流式细胞仪结果发现无论在正常还是应激条件下,ISPS均在T淋巴细胞上表达,且应激后ISPS表达量在T淋巴细胞显著升高至正常时的3倍.在激光扫描共焦显微镜下,直接观察到分离纯化的T淋巴细胞中有ISPS阳性细胞存在,且发现T细胞的两类亚群均具有产生ISPS的功能.结论:T淋巴细胞可以产生ISPS.     

Reversal of apoptotic resistance by Lycium barbarum glycopeptide 3 in aged T cells

Objective To study whether Lycium barbarurn glycopeplide 3 （LBGP3） affects T cell apoptosis in aged mice. Methods LBGP3 was purified with DEAE cellulose and Sephadex columns. Apoptotic ＂sub-G1 peak＂ was detected by flow cytometry and DNA ladder was resolved by agarose gel electrophoresis. Levels of IFN-7 and IL-10 were measured with specific kits and mRNA expression was detected by RT-PCR. Apoptosis-related proteins of FLIP, FasL, and Bcl-2 were determined by Western blotting. Results LBGP3 was purified from Fructus Lycii water extracts and identified as a 41 kD glycopeptide. Treatment with 200 p.g/mL LBGP3 increased the apoptotic rate of T cells from aged mice and showed a similar DNA ladder pattern to that in young T cells. The reversal of apoptotic resistance was involved in down-regulating the expression of Bcl-2 and FLIP, and up-regulating the expression of FasL. Conclusion Lycium barbarum glycopeptide 3 reverses apoptotic resistance of aged T cells by modulating the expression of apoptosis-related molecules.     

抗人T细胞CD3,CD7—PAPs免疫毒素的研制

选用抗人T细胞CD3、CD7两株杂交瘤细胞制备合单克隆抗体（McAb）腹水，经一系列免疫化学方法纯化、鉴定后，分别以SPDP为交联剂将两种McAb与商陆毒蛋白（PAPs）偶联，构建了两种抗人T细胞免疫毒素（IT）。鉴定结果表明，IT抗体活性保持良好，并能特异而高效地杀伤T细胞及T淋巴白血病细胞CEM。本结果为探讨单抗IT联合效应及其在异体／自体骨髓净化移植治疗白血病等方面的应用研究奠定了基础。     

扁桃体巨噬细胞对免疫反应的影响

观察扁桃体巨噬细胞对T细胞的白细胞介素2(IL_2)反应性、干扰素(IFNr)产生、T细胞增殖反应及自然杀伤(NK)细胞活性的响影。结果表明,去除巨噬细胞后,富集的T细胞对IL_2的反应性及IFNr的产生均下降,但对PHA刺激的T细胞增殖反应却增强;此外,富集的T细胞中NK细胞的活性也明显增强。提示扁桃体中的巨噬细胞对T细胞及NK细胞的功能调节,起着重要的作用。     

PTD-Foxp3融合蛋白的表达、纯化及其生物学功能初步研究

目的:构建带HIV-1 TAT转录因子的穿膜序列(Protein transduction domain,PTD)的pET28a-PTD-Foxp3原核表达载体,表达纯化PTD-Foxp3融合蛋白,并研究其生物学作用.方法:利用基因重组技术构建pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中表达融合蛋白,经Ni2 分离柱纯化pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白.流式细胞术检测融合蛋白穿越细胞膜进入小鼠T淋巴细胞瘤株EL-4细胞中的能力,并通过混合淋巴细胞反应初步分析融合蛋白抑制T细胞活化增殖的生物学作用.结果:成功地构建了pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白表达载体,表达并纯化了pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白.通过流式细胞术分析证实pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白能有效地进入细胞内;同时经混合淋巴细胞反应证明该融合蛋白能明显抑制T细胞的活化增殖能力.结论:成功表达具有生物学活性的PTD-Foxp3融合蛋白,为进一步研究PTD-Foxp3融合蛋白免疫抑制功能和构建表达人PTD-Foxp3融合蛋白,最终应用于临床疾病的治疗奠定了基础.     

哮喘大鼠肺CD4＋T细胞Notch1基因启动子甲基化的研究

目的研究支气管哮喘模型大鼠肺CD4＋T细胞中的Notch1基因mRNA表达水平、Notch1基因启动子区DNA甲基化水平及其甲基化改变的位点。方法 20只Wistar大鼠随机分为对照组和哮喘组（每组10只）,哮喘组用卵白蛋白（OVA）致敏并激发的方法建立哮喘大鼠模型。免疫磁珠分离肺CD4＋T细胞并进行纯度鉴定。Real-time PCR检测肺CD4＋T细胞Notch1基因mRNA表达水平,重亚硫酸盐测序检测Notch1基因启动子区DNA甲基化水平。结果哮喘组大鼠肺CD4＋T细胞中Notch1基因mRNA表达水平为对照组的（2.254±0.403）倍（P〈0.01）。哮喘组大鼠肺CD4＋T淋巴细胞Notch1基因启动子区DNA 10个位点整体甲基化水平低于对照组（0.150±0.108比0.300±0.667,P〈0.01）。结论哮喘大鼠肺CD4＋T细胞Notch1基因DNA低甲基化可能参与了Notch1基因的转录调控,增高了Notch1基因的表达量,从而参与了哮喘的发病。