小鼠胚胎干细胞饲养层的制备

目的：探讨小鼠胚胎干细胞饲养层细胞的制备。方法：小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞培养胚胎干细胞。另在无饲养层细胞培养液中,含白血病抑制因子条件下培养小鼠胚胎干细胞,观察两种情况下胚胎干细胞的生长情况。结果：小鼠胚胎成纤维细胞呈放射状或旋涡状走行,胚胎干细胞呈克隆状生长。结论：胚胎干细胞能良好生长,且保持未分化状态。     

不同饲养层细胞对胚胎干细胞和内细胞团的影响

目的探讨不同饲养层细胞对小鼠胚胎干细胞（ESC）和兔囊胚内细胞团（ICM）的影响。方法分别用成系小鼠胚胎成纤维细胞（SNL）、兔胚胎成纤维细胞（REF）、兔肾脏成纤维细胞（RRF）作为饲养层饲养小鼠ESC和兔囊胚，观察它们的生长状态，并分别检测其碱性磷酸酶活性。结果生长在REF上的小鼠ESC具有最显著的未分化形态，保持未分化时间最长．碱性磷酸酶活性最强。在REF上呈聚集生长的兔囊胚ICM的比例最高。结论REF能维持小鼠胚胎干细胞的未分化状态及促进兔囊胚ICM聚集生长，可以作为ESC的饲养层细胞。     

探讨保持胚胎干细胞全能性的体外培养条件

目的 探讨保持胚胎干细胞全能性的体外培养条件。方法 将ＥＳ－Ｄ３细胞株培养在ＳＮＬ饲养层细胞和原代小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上以及在无饲养层的条件下，培养基中加入小鼠白血病抑制因子或用Ｂｕｆｆａｌｏ Ｒａｔ Ｌｉｖｅｒ（ＢＲＬ）条件培养Ａ在进行培养，并对培养细胞进行碱性磷酸酶检测和染色分析。结果 ＥＳ－Ｄ３在上述培养体系中能形成正常形态伯克隆，并且经多次传代后碱性磷酸酶检测为阳性，而且核型保持稳定。     

小鼠胚胎干细胞培养条件的探索

目的: 探讨小鼠胚胎干细胞(ES细胞)的培养特点及生物学特性,为ES细胞的应用研究奠定基础.方法: 小鼠胚胎成纤维细胞原代培养,3～5代的细胞作为饲养层细胞培养ES细胞.另在无饲养层细胞、明胶包被培养皿、培养液中含白血病抑制因子条件下培养小鼠ES细胞,观察2种情况下ES细胞的生长情况.结果: 小鼠胚胎成纤维细胞呈放射状或旋涡状走行,ES细胞在2种条件下均能呈克隆状生长,且保持未分化状态,碱性磷酸酶(AKP)染色呈阳性.结论: 2种条件下ES细胞均能良好生长.     

几种培养方法对ES/GFP小鼠胚胎干细胞系增殖和分化能力作用比较

目的　观察采用不同的饲养层和培养基对永久表达绿色荧光蛋白的小鼠胚胎干细胞系ES/GFP的增殖、分化和绿色荧光蛋白表达的影响。方法　分别采用小鼠胚胎成纤维细胞和人胚胎成纤维细胞为饲养层 ,采用含重组人白血病抑制因子的DMEM/FCS培养基和Buffalo条件培养基培养ES/GFP细胞系。N2 无血清培养基诱导ES/GFP小鼠胚胎干细胞为神经前体细胞 ,Nestin免疫组化染色。结果　小鼠胚胎成纤维细胞和人胚胎成纤维细胞为饲养层 ,常规LIF培养液和Buffalo条件培养基均能较好维持ES/GFP细胞的高增殖能力和全能分化能力 ,对绿色荧光蛋白的表达和胚体形成、神经前体细胞的分化无明显差异。结论　人胚胎成纤维细胞可替代小鼠胚胎成纤维细胞作为ES/GFP饲养层 ,减少饲养层制备的工作量和污染的机会。Buffalo条件培养基可完全替代LIF培养基 ,降低细胞培养的成本。     

小鼠胚胎干细胞饲养层的制备及两种不同饲养层的比较

目的探讨建立有效的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层，用于胚胎干细胞的培养。方法取孕10．5～18．5d的昆明小鼠胚胎，用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞，在体外培养体系中，观察细胞在增殖，传代，冻存及复苏等方面的条件；取购买的小鼠胚胎成纤维细胞系制成饲养层，比较两种细胞用于制备饲养层在胚胎干细胞培养方面的优缺点。结果（1）12．5～14．5d的胎鼠最适合于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞，所分离的细胞含杂细胞最少，细胞较多，繁也快；（2）在37℃，0．25％胰酶-0．02％EDTA的混合消化液消化时间最好为3～5min，此时消化下的细胞最多，活力最好；（3）原代细胞平均培养4d即可传代，丝裂霉素-C抑制成纤维细胞增殖的合适浓度为10～20μg／mL（4）原代小鼠胚胎成纤维细胞较小鼠胚胎成纤维细胞系更适合于制备饲养层。结论原代小鼠胚胎成纤维细胞及小鼠胚胎成纤维细胞系均可用于制备饲养层。     

用于胚胎干细胞分离培养的饲养层的制作

饲养层对胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES cell)的培养与建系十分重要。实验选择小鼠原代成纤维细胞(Priimary mouse embmy fibroblasts,PMEF)作为饲养层,这种饲养层能够较好地维持ES细胞未分化状态和二倍体核型。除选用经典的14．5d的孕鼠制做原代成纤维细胞外,我们还选了10d、18d、的孕鼠制成饲养层,通过ES-D3的传代培养结果表明：10-18d的PMEE均可作为饲养层用,10代内的饲养层培养细胞均适宜。     

昆明种小鼠胚胎干细胞的培养及鉴定

目的 从昆明种小鼠的早期胚胎中获取并培养胚胎干细胞.方法 收集小鼠3.5 d的囊胚培养,用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,形成的ES细胞样集落,72 h后分离隆起生长的内细胞团并继续培养,观察集落的生长状态,并通过碱性磷酸酶染色进行鉴定.结果 ES细胞有其典型的形态学特征:集落呈鸟巢状,边缘清楚,表面平滑,结构致密,隆起生长,细胞之间界限不清楚;单个细胞体积小、核大;对ES 细胞碱性磷酸酶进行检测,在AKP底物作用下,未分化的ES 细胞显微镜下为棕褐色,分化的不着色.结论 昆明种小鼠囊胚在小鼠胚胎饲养层细胞上可以发育为胚胎干细胞.     

利用细胞饲养层分离培养大鼠胚胎干细胞

目的 从大鼠的早期胚胎分离和培养胚胎干细胞.方法收集大鼠的囊胚,将其培养在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,5～6d后取隆起生长的内细胞团块分离后再培养,观察集落的生长情况,并在光镜下观察细胞形态、分化过程及细胞核型的检测.结果细胞集落性生长,符合胚胎干细胞的特征.结论大鼠囊胚在胚胎成纤维细胞饲养层上可发育成胚胎干细胞,并能进行传代.     

小鼠胚胎成纤维细胞的分离、扩增和抑制

目的 建立有效的胚胎成纤维细胞饲养层体系，用于分离和克隆胚胎干细胞研究。方法 取胎鼠组织制备小鼠原代成纤维细胞，观察不同分离和培养条件对细胞增殖的影响，以及丝裂霉素C对细胞增殖的抑制作用；细胞增殖的数量用MTT法测定。结果 分离小鼠胚胎原代成纤维细胞的最适胎龄是12．5—14．5d；20℃-25℃时，用0．25％胰蛋白酶消化组织的最佳时间为3min；可在培养3—6d后进行传代。细胞冻存于-80℃3-4个月，复苏后能正常传代。丝裂霉素C抑制胚胎成纤维细胞增殖的合适浓度为每毫升20μg/10^5细胞，作用2-4h，可维持小鼠原代胚胎成纤维细胞9d内不增殖也不死亡。结论 在合适条件下，小鼠原代胚胎成纤维细胞能顺利分离和培养，并能多次传代和冻存；经丝裂霉素C处理后增殖受抑制，可作为饲养层细胞用于胚胎干细胞的研究。     

探讨保持胚胎干细胞全能性的体外培养条件

【目的】探讨保持胚胎干细胞 (EScells)全能性的体外培养条件。【方法】将ES D3细胞株培养在SNL饲养层细胞和原代小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上以及在无饲养层的条件下 ,培养基中加入小鼠白血病抑制因子 (mLIF)或用BuffaloRatLiver(BRL)条件培养基进行培养 ,并对培养细胞进行碱性磷酸酶检测和染色体分析。【结果】ES D3在上述培养体系中能形成正常形态的克隆 ,并且经多次传代后碱性磷酸酶检测为阳性 ,而且核型保持稳定。【结论】说明上述各种培养体系均能保持ES D3的高度未分化状态及正常的二倍体核型。     

分离和克隆小鼠ES细胞集落的主要影响因素

目的　研究不同培养条件分离和克隆小鼠ES细胞集落的效率。方法　以PMEF饲养层、NIH3T3细胞饲养层或培养液中加入LIF为培养条件 ,分离和克隆昆明小鼠ES细胞集落 ,比较其效率。结果　饲养层的培养条件明显优于培养液中加入LIF的培养条件 ;有饲养层的培养条件下 ,桑椹胚的ES细胞集落出现率显著低于囊胚 ;两种饲养层培养囊胚 ,其ES细胞集落的出现率差异无显著性。结论　以PMEF或NIH3T3细胞作饲养层 ,培养昆明小鼠的囊胚 ,适时离散ICM ,是比较理想的分离ES细胞集落的方法。     

ICR小鼠胚胎成纤维细胞的培养及饲养层的制作

目的：建立ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系，用于胚胎干细胞建系及研究。方法：选取不同胎龄的鼠胚原代细胞分离成纤维细胞，制作饲养层，使用不同浓度丝裂霉素C处理，以细胞形态、生长曲线、囊胚种植情况为饲养层评价指标。结果：ICR小鼠胚胎成纤维细胞可在胎龄12．5～14．5d进行原代细胞分离；12．5d为最佳分离时间；13．5和14．5d分离的细胞需在3代以后使用；6代以前细胞可用于饲养层制作；20mg/L丝裂霉素C作用2．5h可达到较好的处理效果。结论：ICR小鼠可用来分离、培养胚胎成纤维细胞，用于胚胎干细胞饲养层的制作。     

SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞。方法以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1。传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能。结果hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长。经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织。结论SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能。     

小鼠胚胎干细胞体外分化为神经前体细胞的研究

目的 探索小鼠胚胎干细胞（Embryonic stem cell,ES cell）体外分化为神经前体细胞（Neural precursor cells,NPC）的无血清培养条件,比较人胚胎成纤维细胞（Human embryonic fibroblasts,HEF）与小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblasts,MEF）对小鼠ES细胞生长的作用。方法 在MEF或HEF饲养层上培养ES细胞,培养液中含白血病抑制因子。采用无血清方法培养NPC,免疫组化方法检测巢蛋白（Nestin）,用硝基四氮啖蓝/5-溴-4-氯-吲哚基磷酸（NBT/BCIP）显色检测碱性磷酸酶。结果 无血清培养可以获得86%的NPC。HEF与MEF-样能维持ES未分化状态。结论 无血清培养方法有利于ES细胞向NPC分化,HEF可用于小鼠ES细胞的培养,而且比MEF优越。     

昆明种系小鼠胚胎干细胞的分离培养及特性鉴定

目的 提高昆明小鼠胚胎干细胞（ES细胞）建株的成功率。方法 收集小鼠3．5d的囊胚培养,用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,形成的ES细胞样集落,经两次亚克隆分离培养ES细胞;进行相差显微镜观察、碱性磷酸酶染色和体内外分化能力鉴定。结果 获得两个稳定ES细胞集落,传至第11代。ES细胞呈集落样生长,碱性磷酸酶染色强阳性,体外分化的细胞沿拟胚体外向性生长,形态多样,在体分化可形成来源于3个胚层的组织。结论 两次亚克地获得的细胞具有ES细胞主要的生物学性状,有助于提高昆明小鼠ES细胞建株的能力。     

Development of neural precursor cells from mouse embryonic stem cells

Embryonicstemcells(EScells)arederivedfromtotipotentcellsofearlyembryoandpossessunlimited,undifferentiatedproliferationinvitro[1].EScellshavetheinherentcapacityofdifferentiatingintoallcelltypesofthenervoussystemasdemonstratedbytheex-perimentthatchimericmicewereformedfromem-bryosinwhichEScellsaretransplantedintotheinnercellmass[2].ThesuccessfulestablishmentofhumanEScelllineindicatedprofoundimplicationthatEScellsmayprovideavirtuallyunlimiteddonorsourcefortransplantation[3]. Threepaperspublish…