结核杆菌HSP65 DNA疫苗的初步研究

目的 构建以结核分枝杆菌热休克蛋白65000u基因为基础的核酸疫苗。方法 采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因中，扩增出HSP65的编码基因，经限制性核酸内切酶消化后，插入真核表达载体pcDNA3.1(－）的相应酶切位点，并将此重组质粒免疫动物。结果 重组质粒的插入基因经序列测定证实为结核分枝杆菌HSP65。DNA免疫小鼠体内产生特异性抗体。结论 以HSP65编码基因为基础的真核表达载体构建成功，并能引起特异性动物免疫反应，为进一步研究其在结核病防治中的作用奠定了基础。     

电转染技术结合初免后加强免疫策略增强结核杆菌核酸疫苗免疫原性的研究

目的研究电转染技术结合初免后加强免疫策略能否增强结核杆菌核酸疫苗的免疫原性。方法将编码结核杆菌的Ag85A和ESAT-6蛋白抗原的基因分别插入到质粒pVAX1载体中，构建成HG85和HG6两种核酸疫苗。每只BALB／c小鼠肌肉注射10μg核酸疫苗，同时于注射部位施加方型波电脉冲促进质粒DNA体内转染；进行3次初免，再用相应蛋白质抗原或卡介苗加强免疫。结果肌肉注射10μg核酸疫苗加电转染能诱导出与不用电转染接种100μg核酸疫苗相似或更强的抗体免疫应答。初免后采用相应蛋白加强后小鼠产生的免疫应答偏向于TH2型，血清特异性抗体的几何平均滴度比加强前提高5—76倍。而用卡介苗加强免疫，产生的免疫应答偏向TH1型。结论采用电转染技术结合蛋白质或卡介苗加强免疫策略，能显著增强结核杆菌核酸疫苗在动物体内的免疫原性。     

重组BCG疫苗和结核杆菌HSP65 DNA疫苗免疫原性的比较研究

目的　研究重组BCG(recombinantBCG ,rBCG)疫苗和人结核杆菌热休克蛋白 (heatshockprotein ,HSP) 6 5DNA疫苗对小鼠免疫应答的影响 ,评价两种疫苗的免疫原性。方法　用rBCG疫苗和HSP6 5DNA疫苗免疫BALB/c小鼠 ,免疫 8周时 ,采血、取腹腔巨噬细胞和脾脏进行实验。以NO释放量检测巨噬细胞吞噬活性 ,以淋巴细胞刺激指数 (SI)反映细胞增殖能力 ,以ELISA试剂盒检测血清及脾淋巴细胞培养上清的IL 2和IFN γ的含量。结果　rBCG疫苗以 10 6CFU/鼠的剂量经皮下免疫小鼠后 ,其脾淋巴细胞的增殖能力明显高于对照组 ,BCG组和HSP6 5DNA疫苗组 (P <0 .0 5 ) ;腹腔巨噬细胞一氧化氮 (NO)的含量和血清IL 2的含量明显高于对照组 (P <0 .0 1) ;血清IFN γ的含量明显高于HSP6 5DNA疫苗组 (P <0 .0 5 ) ;其余测定参数均有升高趋势 ,但差异无显著性 (P >0 .0 5 )。而HSP6 5DNA疫苗以 5 0 μg/鼠的剂量经肌注免疫小鼠后 ,其血清IL 2的含量明显高于对照组 (P <0 .0 1) ;血清IFN γ的含量明显低于rBCG组 (P <0 .0 5 ) ;其余测定参数与其他各组相比差异均无显著性(P >0 .0 5 )。结论　本实验结果显示 ,rBCG疫苗具有良好的免疫原性 ,能明显增强BALB/c小鼠的免疫应答反应。HSP6 5DNA疫苗亦能刺激机体的免疫应答 ,但其反应强度似乎不     

重组BCG疫苗和结构杆菌HSP65 DNA疫苗免疫原性的 …

目的 研究重组ＢＣＧ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＢＣＧ，ｒＢＣＧ）疫苗和人结核杆菌热休克蛋白（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＨＳＰ）６５ ＤＮＡ疫苗对小鼠免疫应答的影响，评价两种疫苗；的免疫原性。方法 用ｒＢＣＧ疫苗和ＨＳＰ６５ ＤＮＡ疫苗免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，免疫８周时，采血、取腹腔巨噬细胞和脾脏进行０实验，以释放量检测巨噬细胞吞噬活性，以淋巴细胞刺激指数（ＳＩ）反应细胞增殖能力，以ＥＬＩ     

抗旋毛虫病Ts87 DNA疫苗滴鼻初免—蛋白疫苗加强免疫策略增强免疫保护应答

为优化抗旋毛虫病核酸疫苗免疫策略,本文探讨了Ts87 DNA疫苗滴鼻初免与蛋白疫苗皮下注射加强免疫诱导产生的保护效果及免疫应答特征.分别在第0d以旋毛虫Ts87 DNA疫苗SL7207/pVAX1-Ts87滴鼻初免,第14/28 d以蛋白疫苗rTs87皮下注射加强免疫小鼠,在第35 d攻击感染旋毛虫肌幼虫,第84 d剖杀小鼠,计算减虫率观察免疫保护效果;进行小鼠血清中特异性IgG抗体效价、抗体亚型分析及肠道盥洗液sIgA水平分析,检测脾淋巴细胞增殖反应、脾及颈部淋巴结细胞分泌细胞因子水平.结果显示,DNA疫苗滴鼻初免—重组蛋白加强的联合免疫组的保护作用优于单独DNA疫苗滴鼻及单独重组蛋白免疫组,显著提高了减虫率(46.1％);DNA疫苗滴鼻初免和蛋白疫苗加强免疫方式不仅诱导小鼠产生了粘膜免疫应答,同时也诱导了有效的细胞和体液免疫应答,其免疫应答类型是以Th2型为主的混合型Th1/Th2免疫反应.该研究为新型抗旋毛虫病疫苗接种策略的优化提供了实验依据.     

pIHsp65GM的构建及其对结核杆菌感染小鼠的保护

目的构建pIHsp65GM双顺反子真核表达质粒,并在真核细胞中表达,研究该基因疫苗的免疫原性及其对小鼠感染结核杆菌后的免疫保护效果。方法制备基因疫苗,将C57BL/6小鼠于胫前肌注射质粒DNA免疫,末次免疫后用h37rv强毒株经尾静脉攻击小鼠,计数肺和脾组织中结核杆菌的菌落数,对小鼠的部分肺和脾组织作病理切片,经HE染色观察组织病变的程度,测血清特异性IgG,MTT测定脾淋巴细胞特异性增殖指数,测小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ的水平,乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定免疫小鼠特异性细胞毒性T细胞(CTL)活性。结果 pIHsp65GM基因疫苗构建成功并且诱导小鼠特异性IgG的产生、脾淋巴细胞增殖以及IFN-γ的分泌(平均含量显著高于2个阴性对照组(P<0.001))。pIHsp65GM免疫组小鼠的脾和肺的平均结核菌载量分别低于两个阴性对照组的相应器官的结核菌载量(P<0.001),同时也显著高于BCG免疫对照组。结论成功构建和表达pIHsp65GM质粒,该基因疫苗对小鼠结核杆菌感染有一定的免疫保护效果,能够诱导较强的抗原特异性Th1型细胞     

基因佐剂结核杆菌HSP70增强HCA661基因疫苗免疫应答

目的：评价结核分枝杆菌HSP70（Mycobacterium tuberculosis heat shock protein 70,mtHSP70）羧基端作为基因佐剂对HCA661（Hepatocellular carcinoma associated antigens 661）基因疫苗免疫效果的影响。方法：将HCA661及与mtHSP70羧基端的串联体分别克隆到pCI-neo中构建基因疫苗;将eGFP及与mtHSP70羧基端的串联体分别克隆到pCI-neo,体外转染φA细胞,根据eGFP的表达评价重组质粒中靶基因的转录表达效率。基因疫苗免疫BALB/c小鼠,SABC、Western blot检测免疫血清中特异性HCA661抗体;流式细胞术、ELISA法检测免疫血清中特异性HCA661抗体水平。结果：重组质粒构建成功;80%φA细胞转染eGFP后呈现绿色荧光;单基因和融合基因疫苗组动物均产生了针对HCA661的特异性抗体,融合疫苗组诱导的抗体水平较单基因疫苗组显著增高,融合基因疫苗组未产生针对mtHSP70的抗体。结论：mtHSP70羧基端作为基因佐剂增强机体对HCA661融合基因疫苗的特异性免疫应答。     

rAd/MDC-VP1初免pcDNA3/MDC-VP1加强策略抗CVB3的免疫效果研究

目的:应用柯萨奇病毒B3(CVB3)腺病毒载体疫苗rAd/MDC-VP1初免,核酸疫苗pcDNA3/MDC-VP1加强免疫的策略免疫小鼠,观察其免疫效果。方法:BALB/c小鼠随机分为A～D 4组,分别肌肉注射PBS、rAd/MDC-VP1、pcD-NA3/MDC-VP1、rAd/MDC-VP1+pcDNA3/MDC-VP1,用ELISA和微量中和试验法分别检测CVB3 VP1特异性IgG和中和抗体滴度,CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖活性和特异性CTL杀伤活性;用致死量的CVB3攻击小鼠后,检测小鼠血中病毒滴度并观察动物的存活情况。结果:D组CVB3 IgG、非特异性淋巴细胞增殖活性及特异性CTL杀伤活性明显高于其他各组(P<0.05);CVB3攻击后,D组小鼠血中病毒滴度较其他各组显著降低,生存率为41.67%,明显高于其他各组(P<0.05)。结论:rAd/MDC-VP1初免pcDNA3/MDC-VP1加强的免疫策略能显著提高小鼠细胞和体液免疫水平,提高致死量病毒攻击后的保护率。     

HIV感染者中结核杆菌ESAT-6蛋白特异性T细胞反应的检测

目的 检测结核杆菌抗原早期分泌抗原靶分子(ESAT-6)融合蛋白其在人类免疫缺陷病毒感染患者中特异性T细胞反应,从而为艾滋病合并结核杆菌感染的诊断方法的建立提供理论依据.方法利用重组表达结核杆菌ESAT-6蛋白做为抗原,通过酶联免疫斑点技术(ELISPOT)检测HIV感染者中特异性T细胞反应,并以正常健康者、无HIV感染的结核患者作为对照.结果 ESAT-6重组蛋白对结核患者外周血单核细胞ELISPOT方法检测证实其具有良好的抗原性,斑点形成单位数(SFU/106 PBMC)在结核组和HIV合并结核感染组中显著升高,并与无合并结核感染临床表现的HIV组以及健康对照组间均存在明显的差别.结论重组结核杆菌ESAT-6蛋白可以作为抗原通过ELISPOT方法检测HIV感染者中结核杆菌合并感染.     

Ag85A DNA疫苗加强免疫显著提高卡介苗初免小鼠的抗结核T细胞免疫应答

目的 构建表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)免疫优势抗原Ag85A的DNA疫苗,分析其加强免疫后提高卡介苗(BCG)初免小鼠的抗结核T细胞免疫应答.方法 以Mtb毒株H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增Ag85A抗原编码的结构基因并克隆至真核表达载体pVAX1中构建其DNA疫苗;接着,将纯化后的该DNA疫苗加强免疫BCG初免小鼠2针,以BCG和DNA单独免疫小鼠为对照,免疫8周后无菌分离脾淋巴细胞,分别应用IFN-γ ELISPOT和多因子胞内流式细胞术(intracellular staining)分析免疫小鼠的Mtb抗原特异性效应细胞免疫水平与分泌IFN-γ/TNF-α/IL-2的多功能CD4+T细胞频率及其强度以及CD8+T细胞免疫应答.结果 与BCG免疫及DNA单独免疫组相比,Ag85A DNA加强免疫不仅能显著提高小鼠IFN-γ+TNF-α+IL-2+多功能T细胞,IFN-γ+IL-2+、IL-2+TNF-α+双功能T细胞与IL-2+单功能T细胞的频率以及IL-2的分泌能力,还能显著诱导小鼠产生更多分泌IFN-γ和IL-2的CD8+T细胞.结论 本研究成功构建了表达Mtb免疫优势抗原Ag85A的DNA疫苗并分析了其免疫原性,证实了BCG初免-DNA加强的免疫策略可同时显著增强实验小鼠的Mtb抗原特异性CD4+T和CD8+T细胞应答水平,有利于提高BCG的免疫原性,为增强BCG逐渐下降的抗结核保护效果提供新思路.     

Immunogenicity and protective efficacy of a DNA vaccine encoding the fusion protein of mycobacterium heat shock protein 65(Hsp65) with human interleukin‐2 against Mycobacterium tuberculosis in BALB/c mice

Developing a new generation of vaccines is important for preventing tuberculosis (TB). DNA vaccine is one promising candidate. In this study we evaluated the immunogenicity and protective efficacy of the DNA vaccine encoding the fusion protein of Mycobacterium tuberculosis heat shock protein 65 (Hsp65) with human interleukin‐2 (hIL‐2) in BALB/c mice. We showed that the DNA vaccine pcDNA‐Hsp65‐hIL‐2 could induce high levels of antigen‐specific antibody, IFN‐γ, CD4⁺ and CD8⁺ T cell production. When the immunized mice were infected with M. tuberculosis H37Rv, the organ bacterial loads in the DNA immunized group were significantly reduced compared to those of the saline control group, but the ability to reduce bacteria was not better than for BCG. The histopathology in lungs of the DNA vaccine immunized mice was similar to that of BCG immunized mice, which was obviously ameliorated compared to that of the saline control group. Overall, the DNA vaccine could afford protection against M. tuberculosis infection, though the protection efficacy was not as great as that of conventional BCG.     

人巨细胞病毒pp65核酸疫苗的构建、表达与动物免疫效应

构建真核重组表达质粒PVAX1-pp65,通过对其表达产物的鉴定和免疫小鼠实验,探讨PVAX1-pp65载体对诱导免疫应答的效果及方式。用已构建的原核表达载体pp65-pet32a,经酶切后与DNA疫苗载体PVAX1连接,构建HCMVpp65核酸疫苗(PVAX1-pp65)。用脂质体法将其转染293细胞,经间接免疫荧光、免疫印迹试验来验证其表达的产物。同时,免疫小鼠后取其脾脏细胞,经流式细胞仪检测其CD4+和CD8+T细胞;并利用MTT法测定免疫小鼠的T细胞对ConA和重组pp65蛋白刺激后的增殖活性。结果显示构建的真核表达载体PVAX1-pp65,经测序验证其序列正确。体外转染实验结果表明转染重组质粒的细胞胞浆内呈现与特异性pp65单克隆抗体反应的颗粒状荧光产物,免疫印迹试验也显示重组质粒转染的细胞裂解物中有pp65蛋白条带。另外,免疫小鼠脾CD8+T细胞的含量明显高于对照组;免疫鼠脾细胞对重组pp65抗原蛋白的刺激后增殖反应明显。综上结果证实,成功地构建了HCMVpp65核酸疫苗,并能有效地表达,表达的蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。HCMVpp65DNA疫苗可诱导小鼠产生针对HCMV的特异性细胞免疫应答,可作为一种有应用前景的核酸疫苗进一步深入研究。     

结核杆菌热休克蛋白65"自杀性"DNA疫苗的构建及其免疫效应研究

目的 构建表达结核杆菌热休克蛋白65(HSP65)的"自杀性"DNA疫苗.方法 用聚合酶链反应,从我室构建的表达结核杆菌HSP65真核表达质粒中(pCHSP65),扩增出编码HSP65的基因,与"自杀性"DNA载体pSFV重组.经酶切、测序鉴定,间接免疫荧光(IF)证实其能表达HSP65后,将此"自杀性"DNA疫苗(pAHSP65)免疫小鼠.用ELISA、MTT法研究其免疫效应,并观察其对结核菌感染小鼠的保护作用.结果 酶切、测序鉴定结果证实为结核杆菌HSP65基因,在BHK21细胞中经IF证实有HSP65表达.该疫苗接种能诱导小鼠产生特异性抗体,刺激淋巴细胞增殖,并能抵抗结核杆菌的感染.结论 我们成功地构建了表达结核杆菌HSP65的"自杀性"DNA疫苗,该疫苗能诱导特异性免疫应答,并对结核菌感染的小鼠有保护作用.其免疫效应优于常规的HSP65 DNA疫苗.     

结核杆菌pcHSP65真核表达载体的构建及其DNA免疫实验

目的：构建以结核分枝杆菌热休克蛋白65kD基因为基础的核酸疫苗。方法：采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因中，扩增出HSP65的编码基因，经限制性核酸内切酶消化后，插入真核表达载体pcDNA3.1(-)的相应酶切位点，并将此重组质粒免疫动物。结果：重组质粒的插入基因经序列测定证实为结核分枝杆菌HSP65。DNA免疫小鼠体内产生特异性抗体，能抵抗结核杆菌的感染。结论：以HSP65编码基因为基础的真核表达载体构建成功，并能引起特异性动物免疫反应，为进一步研究其在结核病防治的作用奠定了基础。     

结核分枝杆菌联合DNA疫苗初免-BCG加强的免疫效果观察

目的:研究并比较结核分枝杆菌免疫保护性抗原DNA(Ag85A和ESAT-6)疫苗联合免疫,BCG免疫以及联合DNA疫苗初免-BCG加强免疫等不同的免疫策略,诱导免疫应答效果观察.方法:健康雌性BALB/c小鼠24只,随机分成PBS 阴性对照组,DNA初免-BCG异源加强组,DNA(Ag85A和ESAT-6)初免DNA同源加强组和BCG阳性对照组,共进行3次免疫,初免2次,最后1次加强,间隔2周1次.PBS组3次均注射PBS 溶液;DNA/BCG组以质粒DNA免疫2次,最后1次以BCG加强免疫;DNA/DNA组3次均以质粒DNA进行免疫;BCG组则注射PBS溶液2次后以BCG免疫.末次免疫后4、6、8周分别分离血清测定总IgG水平,同时分离小鼠脾细胞,体外经TB-PPD刺激后进行淋巴细胞增殖实验(XTT法)并测定脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4水平.结果:DNA/BCG、DNA/DNA、BCG组体外经TB-PPD刺激后均检测到特异性IgG抗体产生,3组平均效价为1:120、1:160、1:80,DNA/DNA组的抗体效价高于另外2组;小鼠脾细胞体外经TB-PPD刺激后,均能产生特异性淋巴细胞增殖并诱生较强的IFN-γ反应,其中DNA/BCG组IFN-γ的分泌水平高于DNA/DNA组和BCG组(P<0.05).结论:联合DNA疫苗初免-BCG加强的免疫策略能在小鼠体内诱导较强的特异性细胞免疫反应,产生高水平的IFN-γ.     

结核杆菌热休克蛋白—65重组质粒的构建及其在真核细胞中的初步表达

目的：构建结核杆菌热休克蛋白－65（HSP65）真核表达质粒,并探讨其在人肺癌细胞系A549中的表达,方法：用PCR的方法从结核杆菌H37Rv基因组中扩增出HSP65基因,并定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1( ）,构建成重组质粒pcDNA3.1-HSP65;然后用电穿孔的方法将质粒pcDNA3.1－65转染到A549细胞,经G418筛选后获得抗性细胞克隆;用RT－PCR的方法检抗性细胞中HSP65mRNA的表达,结果：经酶切鉴定和DNA序列测定证实重组质粒pcDNA3.1－HSP65构建正确;RT－PCR检测结果发现,重组质粒pcDNA3.1－HSP65转染的A549细胞总RNA中结核杆菌HSP65mRNA为阳性,结论：真核表达质粒pcDNA3.1－HSP65构建成功,并可在真核细胞A549细胞中稳定表达。     

Cellular and humoral immune responses to mycobacterial heat shock protein-65 and its human homologue in Takayasu's arteritis

Expression of heat shock protein (HSP)-65 as well as infiltration of T-cells in arterial lesions and raised levels of circulating antibodies against mycobacterial HSP65 (mHSP65) led us to the concept that mHSP65 or its human homologue (hHSP60) might be involved in the etiopathogenesis of Takayasu's arteritis (TA). Therefore, we investigated mHSP65 and hHSP60 reactive peripheral blood T-cell subsets by BrdU incorporation assay and flow cytometry as well as investigating the different isotypes of anti-mHSP65 and hHSP60 antibodies by ELISA. Eighty-four percent (22/26) of the TA patients were observed to show T-cell proliferation to mHSP65 and hHSP60 whereas only 16% (3/18) healthy controls showed such proliferation (P <0.001). Both HSPs induced proliferation of exclusively CD4+ T-cells and not CD8+ T-cells. We also observed a significantly higher prevalence of only the IgG isotype reactive to mHSP65 and hHSP60 in TA as compared to HC (mHSP65: 92% TA versus 11% HC, P <0.0001 and hHSP60: 84% versus 22%, P <0.001). Our data show a significant correlation between mHSP65 and hHSP60 reactive T-cells (CD3+: r=0.901; CD4+: r=0.968) as well as anti-mHSP65 and anti-hHSP60 IgG antibodies (r=0.814) suggesting an infection induced autoimmunity in TA, possibly induced by molecular mimicry between mHSP65 and hHSP60 or other tissue specific antigens.