Lipofectamine 2000介导重组siRNA质粒载体转染SGC7901的条件优化

目的寻求Lipofectamine 2000介导外源基因体外转染胃癌细胞SCG7901的最佳条件,建立有效的转染体系。方法以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,统计分析在不同质粒与脂质体的用量比、培养基选择、转染作用时间等条件下脂质体介导外源基因导入胃癌细胞的效率。结果用24孔板培养细胞时,在细胞融合度约90%,质粒用量为0.6μg,脂质体用量1.2μl(两者质量/体积比为1:2),转染作用时间为8 h时,转染效率为465%%,细胞存活率约78%。结论按以上转染体系,可获得较为满意的结果。     

阳离子脂质体转染Hela细胞的实验

背景：基因载体是基因治疗中重要的影响因素,阳离子脂质体细胞毒性低,转染效率高,是一种很有前景的基因转染载体。目的：评价两种阳离子脂质体介导基因转染宫颈癌细胞的转染效果,优化它们对宫颈癌细胞的转染条件。设计、时间及地点：以Hela细胞为观察对象,分组设计。实验于2008-03/06在大连民族学院生命科学学院国家民委-教育部重点实验室完成。材料：质粒pGFP-N2购自Clontech公司,Hela细胞由大连民族学院的实验室保存。方法：首先采用DNA延滞实验考察阳离子脂质体与DNA的结合能力,然后用进行细胞转染实验研究脂质体的转染效率,最后通过四甲基偶氮唑盐法考察脂质体对细胞的毒性。主要观察指标：采用DNA延滞实验观察阳离子脂质体Lipofectamine2000和DOTAP与DNA的结合能力,以报告基因（绿色荧光蛋白基因pGFP-N2）,分析阳离子脂质体Lipofectamine2000和DOTAP转染Hela细胞转染效率和细胞毒性。结果：Lipofectamine2000和DOTAP与DNA均有很强的结合力;以绿色荧光蛋白基因为报告基因,Lipofectamine2000转染率较高;当Lipofectamine2000与DNA质量比为3∶1时,转染效率最高,约72%,是DOTAP转染细胞最高活性的2.5倍;在最佳转染剂量时,2种试剂的细胞存活率均在75%以上,Lipofectamine2000的毒性相对较小。结论：对Hela细胞而言,Lipofectamine2000较DOTAP具有更高的转染效率和较低的细胞毒性。     

两种转染人宫颈癌HeLa细胞的方法学比较

目的比较两种不同的转染方法,即Lipofectamine2000和Nucleofector Kit转染人宫颈癌Hela细胞的转染效率。方法分别选取Lipofectamine2000转染和Amax核电转(Amax Nucleofector Kit)两种转染方法。HeLa细胞培养贴壁达到85%~90%后传代获取HeLa单细胞悬液,细胞分成2管,其中1管直接采用核电转法转染红色荧光蛋白(DsRed)后种植于1.5 ml的细胞培养皿;另一管先种植于细胞培养皿,待贴壁24 h后采用Lipofectamine2000转染DsRed。细胞的存活率采用台盼兰进行检测。分别比较两者转染效率及转染前后细胞的存活率,进一步探讨Nucleofector Kit核电转法的高效性。结果 Lipofectamine2000的基因转染率仅为20.23%,而核电转法的转染率为90.14%,后者为前者的4.46倍。Lipofectamine2000转染细胞前后的存活率分别为96.34%和90.76%,而核电转组分别为95.98%和78.35%。结论细胞核电转法能高效稳定地转染人宫颈癌细胞株HeLa细胞。     

超声辐照联合PEI介导基因转染的实验研究

目的 探讨超声联合聚乙烯亚胺(PEI)在促进肝癌细胞(HepG2)的基因转染中有无协同作用.方法 选用工业用和实验用PEI为研究对象.用锥虫蓝拒染法检测细胞成活率,选取合适的PEI浓度与绿色荧光蛋白基因(EGFP)质粒DNA共孵育,制备阳离子复合物(PEI/DNA)导入HepG2细胞中和/或辐照超声.24 h后荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达,流式细胞仪定量分析转染率.结果 超声可促进质粒DNA在HepG2细胞的基因转染.PEI对细胞有毒性,当PEI浓度为0.001%时细胞成活率约为70%,选此浓度用于基因转染实验.2种PEI复合物均能显著促进质粒DNA基因转染,其转染率高于单纯辐照超声介导的基因转染,差异有统计学意义(P＜0.01),2种PEI的转染率工业用组(15.42士4.71)%、实验用组(12.27±3.58)%之间的差异无统计学意义(P＞0.05),加入PEI联合辐照超声后转染率下降(P＜0.01).结论PEI和超声均能促进HepG2细胞基因转染,但PEI联合辐照超声后转染率明显下降,二者没有协同作用.工业用与实验用PEI一样具有促进基因转染的作用.     

促血小板生成素基因转染小鼠骨髓基质细胞的实验研究

目的探讨促血小板生成素（TPO）基因修饰的小鼠骨髓基质细胞（BMSCs）对TPO基因的表达的影响。方法用脂质体lipofectamine^TM2000将TPO cDNA真核表达质粒转染至骨髓基质细胞（BMSCs），RT—PCR方法检测TPO mRNA的表达，免疫组化法测定TPO的表达。结果转染TPO基因的BMSCs TPO mRNA及TPO表达量明显高于空载体组（P〈0．01）及未转染组（P〈0．01）。结论阳离子脂质体能有效介导TPO cDNA真核表达质粒转染BMSCs，且转染后BMSCs中TPO mRNA及TPO的表达显著上调。     

胡椒碱对人肝癌HepG2细胞抗肿瘤活性的体外实验研究

目的 探讨胡椒碱(piperine)对人HpeG2肝癌细胞株的增殖、杀伤和细胞凋亡的影响,为肝癌的治疗提供理论依据.方法 体外培养的HpeG2细胞,采用MTT比色法检测不同浓度胡椒碱对体外培养的HepG2细胞和新分离的外周血白细胞的增殖抑制作用.Hoechst 33258染色观察细胞凋亡形态,采用流式细胞术测定胡椒碱对HepG2细胞的凋亡.结果 胡椒碱对HepG2细胞增殖的抑制率随着浓度的升高而增加,半量抑制浓度(IC50)为15.13±3.21 μmol/L,低于其对外周血白细胞的抑制率(64.52±5.32 μmol/L).Hoechst 33258染色后,胡椒碱处理癌细胞组表现出典型的细胞凋亡特征,流式细胞仪检测20 μmol/L的胡椒碱处理HepG2细胞24 h后,细胞凋亡率由对照组的2.89%上升到了21.76%.结论 胡椒碱具有抑制HepG2细胞增殖和诱导凋亡的抗肿瘤活性,有应用于肝癌治疗的潜在价值.     

乙型肝炎病毒感染HepG2细胞模型的构建

目的:构建乙型肝炎病毒(HBV)感染的细胞模型.方法:将携带1.2拷贝HBV基因的重组腺病毒感染HEK293细胞进行包装、扩增并分离纯化.将扩增得到的HBV感染HepG2细胞,用ELISA法检测感染后第4天培养上清中的HBsAg,Real-time RT-PCR检测HBV mRNA.结果:ELISA检测结果显示,HepG2细胞感染HBV后上清液中HBsAg呈阳性.Real-time RT-PCR可以检测到HBV mRNA.结论:HBV能在HepG2细胞中表达复制和表达.HBV感染的HepG2细胞模型构建成功.     

超声和共聚物P85介导HepG2细胞基因转染的实验研究

目的 探讨超声和共聚物Pluronic P85能否介导HepG2细胞基因转染,并摸索超声辐照条件.方法 质粒DNA用EGFP,超声辐照加或未加P85的HepG2细胞,48 h后荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,流式细胞仪定量分析转染率,锥虫蓝染色评价细胞活性.结果 0.8 W/cm2、30 s时达到较理想的转染效率.超声 P85组转染率为单独超声组的3倍左右,超声 P85组细胞成活率80%左右,单独超声组细胞成活率60%左右.结论 超声和共聚物能介导HepG2细胞基因转染,在0.8 W/cm2、30 s时达较理想的转染效率,P85使超声介导的细胞损伤有一定程度的增加.     

丙型肝炎病毒体外感染HepG2细胞模型的建立

目的：建立近似自然感染的丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV)体外感染细胞模型。方法：将含10%HCV RNA阳性血清的接种液和HepG2细胞在37℃，5%CO2条件下共同孵育24h，再加含新生牛血清，地塞米松，胰岛素及硫酸亚铁的维持培养液，置32℃，5%CO2条件下培养，以后每3-4d传代一次，定期收集培养上清液和细胞。应用RT-nested-PCR，免疫组化及Western blot进行病毒核酸和蛋白质的检测。结果：RT-nested-PCR法检测发现在接种病毒后第4-16天的细胞标本中可检测到HCV RNA正链，接种病毒后第4-24天的细胞标本则可检测到HCV RNA副链，通过免疫组化和Western blot检测，病毒蛋白（NS3）能在第4天检出。结论：HCV体外感染HepG2细胞模型的建立，可望用于HCV吸附肝细胞机制研究及疫苗中和试验。     

小白菊内酯增强肝癌HepG2细胞对顺铂敏感性的实验研究

目的:评价小白菊内酯联合顺铂对肝癌HepG2细胞的协同作用.方法:HepG2细胞经小白菊内酯和(或)顺铂处理后,以CCK-8法检测细胞的增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blotting检测Caspase-3,8,9和PARP的变化.结果:小白菊内酯联合顺铂能够明显抑制HepG2细胞的增殖,与单独用药组相比有明显的协同作用.小白菊内酯可以增强顺铂诱导的HepG2细胞凋亡.小白菊内酯和顺铂联合能够活化Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9,引起PARP的切割.结论:小白菊内酯和顺铂联用具有协同作用,能抑制HepG2细胞增殖并且诱导细胞凋亡,其作用机制可能与caspase系统活化有关.     

自制阳离子纳米泡介导HepG2细胞基因转染的实验研究

目的 观察自制阳离子纳米泡作为基因转染载体体外转染肝癌细胞系HepG2细胞的可行性.方法 将脂质体、聚乙烯亚胺(PEI)和全氟丙烷声振后制得微囊带有PEI的阳离子脂质体纳米泡(PNB),评价其基本特性,用其转染HepG2细胞,并辐照超声,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况,流式细胞仪检测细胞转染率,CCK-8法评估其细胞活性.结果 制备的PNB表面带有正电荷,能阻碍质粒DNA在电场作用下发生迁移,且能有效地转染HepG2细胞,转染效率达30％～45％,辐照超声后转染效率明显提高(P＜0.05).结论 新型阳离子纳米泡在体外可作为基因转染载体,有效地携带质粒DNA并促进转染,辐照超声可使转染效率显著提高.     

超声联合脂氟显微泡转染HepG2细胞的参数优化

目的 探索治疗性超声联合脂氟显微泡对人肝癌细胞HepG2基因转染的可行性及其实现高效率转染的优化参数.方法 HepG2细胞交叉间隔接种于24孔板,用治疗性超声辐照含脂氟显微泡和EGFP质粒的各组细胞.分组:超声强度梯度组(A组),A1～A5亚组,分别为0.4 W/cm2、0.8 W/cm2、1.2 W/cm2、1.6 W/cm2和2.0 W/cm2;占空比梯度组(B组),B1～B3亚组,分别为10％、20％和50％;时间组(C组),C1～C3亚组,分别为30 s、90s、180 s.24 h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况,流式细胞仪检测基因转染率,台盼蓝染色检测细胞死亡率.结果 不同超声强度、占空比和时间下,质粒转染效率各不相同.在一定范围内,分别增加超声强度、占空比和时间均可以提高转染效率.对于超声强度和占空比,当设置过高(声强＞1.6 W/cm2或占空比＞50％)时,由于细胞死亡率增加导致实际转染效率下降.超声强度为1.2 W/cm2时,转染率和死亡率优于A组其余各亚组;占空比为20％时,转染率和死亡率优于B组其余各亚组.当超过90s后继续增加时间,对于转染率和细胞死亡率的影响无明显统计学意义(P＞0.05).结论 超声辐照微泡是一种介导基因体外转染的有效方法,不同参数下转染率差别较大,优化参数有利于促进基因转染.     

不同超声辐照时间和微泡剂量介导HepG2细胞基因转染的实验研究

Objective To investigate the relationship of gene transfection efficiency with different ultrasound exposure time and different dose of microhuhble,and to find the appropriate ultrasound parameters for gene transfection. Methods Plasmid encoding enhanced green fluorescent protein(pEGFP) was chosen as a report gene and HepG2 cells were chosen as research object. The HepG2 cells plus pEGFP and different dose of microbubble were exposed to ultrasound(1 MHz,0.5 W/cm2) with varying time. Twenty-four hours later, the expression of EGFP in the cells was observed by fluorescence microscope,the transfection efficiency was assessed by FACS and the cell viability was observed by trypan blue exclusion. Results The expression of EGFP in all experimental groups was different,and the approving transfection efficiency was got by ultrasound exposed for 20 s when the dose of microbubble was 60 μl. Conclusions With fixed ultrasound frequency and power, different transfection efficiency was got when the exposure time and dose of microbubble were different. The appropriate parameter was 20 s,60 μl, which can supply information for further study.     

不同超声辐照时间和微泡剂量介导HepG2细胞基因转染的实验研究

目的 探讨不同超声辐照时间和微泡剂量与基因转染效率之间的关系,初步摸索适宜转染的参数条件.方法 质粒DNA用增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP),以人肝癌细胞(HepG2)为研究对象.超声频率1 MHz.声强0.5 W/cm2,对加入pEGFP和不同剂量微泡的HepG2细胞辐照不同的时间,24 h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况,流式细胞仪检测基因转染率,台盼蓝染色检测细胞存活率.结果 各实验组均可见不同程度荧光蛋白表达,辐照时间为20 5和微泡剂量为60μl时可达到较理想的转染效率.结论 在超声频率和声强一定的条件下,不同超声辐照时间和微泡剂量有不同的基因转染效率,20 s、60 μl是一个较理想的参数,为基因治疗进一步研究提供了参考.     

阳离子脂质体转染Hela细胞的实验冰

背景;基因载体是基因治疗中重要的影响因素,阳离子脂质体细胞毒性低,转染效率高,是一种很有前景的基因转染载体.目的:评价两种阳离子脂质体介导基因转染宫颈癌细胞的转染效果,优化它们对宫颈癌细胞的转染条件.设计、时间及地点:以Hela细胞为观察对象,分组设计.实验于2008-03/06在大连民族学院生命科学学院国家民委一教育部重点实验室完成.材料:质粒pGFP.N2购自Clontech公司,Hela细胞由大连民族学院的实验室保存.方法;.首先采用DNA延滞实验考察阳离子脂质体与DNA的结合能力,然后用进行细胞转染实验研究脂质体的转染效率,最后通过四甲基偶氮唑盐法考察脂质体对细胞的毒性.主要观察指标:采用DNA延滞实验观察阳离子脂质体Lipofectamine 2000和DOTAP与DNA的结合能力,以报告基因(绿色荧光蛋白基因pGFP-N2),分析阳离子脂质体Lipofectamine 2000和DOTAP转染Hela细胞转染效率和细胞毒性.结果:Lipofectamine 2000和DOTAP与DNA均有很强的结合力:以绿色荧光蛋白基因为报告基因,Lipofectamine 200C转染率较高;当Lipofectamine 2000与DNA质量比为3:1时,转染效率最高,约72%,是DOTAP转染细胞最高活性的2.5倍;在最佳转染剂量时,2种试剂的细胞存活率均在75%以上,Lipofectamine 2000的毒性相对较小.结论:对Hela细胞而言,Lipofectamine 2000较DOTAP具有更高的转染效率和较低的细胞毒性.     

转染乙肝病毒基因的HepG2细胞Tooll样受体2的表达上调

目的:前期研究发现先天免疫分子TOU样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)与乙型病毒性肝炎的免疫损伤有一定的关系,现进一步观察瞬时和稳定转染乙肝病毒(HBV)基因的HepG2细胞TLR2表达的变化.方法:采用免疫荧光流式细胞术检测TLR2在肝癌细胞株HepG2和HepG2.2.15上表达的平均荧光强度(MFI)及阳性细胞率,将前期试验获得的HBV全基因组.采用脂质体瞬时转染肝癌细胞株HepG2,采用免疫荧光流式细胞术检测TLR2在细胞上表达的MFI及阳性细胞率.结果:HepG2.2.15细胞上TLR2表达的MFI及阳性细胞率均明显高于HepG2(均P＜0.001),HepG2细胞于转染48 h后TLR2表达的MFI和阳性细胞率与空白对照组(转染HBVDNA剂量为O)相比均显著升高(均P＜0.05),并且MFI和阳性细胞率与转染剂量均呈显著正相关(均r=0.950,P＜0.001).结论:不管在瞬时和稳定转染HBV基因的HepG2细胞,都存在细胞TLR2的上调,提示HBV感染细胞后存在TLR2信号途径的激活.     

不同浓度超声微泡结合共聚物P85对人肝癌细胞HepG2基因转染的影响

目的 不同浓度超声微泡造影剂(MB)结合共聚物P85后联合一定强度超声(US)辐照,初步摸索最适人肝癌细胞HepG2质粒转染及表达的MB浓度。 方法 以人肝癌细胞HepG2为研究对象,以绿色荧光蛋白(EGFP)质粒为报告基因,添加共聚物P85和不同浓度的MB后进行脉冲多普勒US辐照。24 h后台盼蓝染色评价细胞存活率,荧光显微镜和流式细胞仪评价细胞的基因转染率。 结果 MB浓度在30%时达到较理想的转染率(22.14±3.06)%,且细胞存活率无明显下降(55.73±3.32)%。添加MB后基因转染率均较pEGFP+P85+US转染率高。 结论 MB与共聚物P85结合同时给予US辐照可增强基因转染率,且在MB浓度为30%时达到较理想的转染率。     

小干扰RNA对人肝癌细胞株HepG2 Survivin基因表达的影响

目的构建Survivin基因特异性小干扰RNA(siRNA),检测siRNA-Survivin对Survivin基因表达的抑制,在人肝癌细胞株HepG2中研究survivin和survivin siRNA对细胞凋亡的影响。方法设计survivin siRNA序列,构建靶向Survivin siRNA真核载体。利用脂质体转染人肝癌HepG2细胞,通过相差显微镜下观察、四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)及反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)观察转染后survivin的表达,以及HepG2细胞的凋亡。结果成功构建了survivin siRNA表达载体,并且si-survivin对survivin有明显抑制效应,可显著抑制HepG2细胞的发生凋亡。转染Survivin-siRNA细胞活性受到显著抑制(P<0.05),光镜下出现明显的凋亡形态,DNA电泳出现典型的凋亡"梯状"带。RT-PCR结果显示细胞转染24 h、48 h和72 h后HepG2 Survivin mRNA分别减少了56%、78%和50%,而siR-NA阴性对照与未转染细胞相比差异不显著。结论转染的Survivin-siRNA可特异性抑制肝癌细胞株HepG2凋亡抑制基因的表达,从而为肿瘤的基因治疗提供新的实验基础。     

间充质干细胞介导"酶-前药基因"CYP1A2靶向抗肿瘤效应研究

目的 将人细胞色素P450 1A2(CYP1A2)基因转染骨髓间充质干细胞(BMSC),检测转基因BMSC协同化疗前药达卡巴嗪(DTIC)对人恶性淋巴瘤细胞株Raji细胞的靶向促凋亡作用,为以间充质干细胞为载体的"基因介导的酶-前药双靶向抗肿瘤策略"提供体外实验依据.方法 从人肝细胞中克隆CYP1A2基因,构建真核表达载体,分离、鉴定并培养BMSC,脂质体法将CYP1A2基因导入BMSC和Raji细胞中,RT-PCR和Westem blot法检测CYP1A2基因的表达,Transwell法检测BMSC的肿瘤靶向性,MTT法检测转基因Raji细胞对DTIC敏感性的改变,Annexin V/PI染色标记法检测转基因BMSC联合DTIC诱导Raji细胞凋亡的作用.结果 成功克隆CYP1A2基因并将构建的真核表达载体转染BMSC和Raji细胞,流式细胞术检测体外诱导分化结果符合BMSC特性,RT-PCR和Westernblot检测到转基因细胞中CYP1A2表达,Transwell迁移实验证实BMSC有肿瘤趋向性,MTT法检测显示DTIC呈剂量依赖性抑制转CYP1A2基因的Raji细胞生长,而转CYP1A2基因的BMSC细胞对DTIC相对耐受(IC50值分别为1.67 mmol/L和7.53 mmol/L,P＜0.01).Armexin V/PI染色法显示CYP1A2能够使细胞在体外代谢DTIC,产生细胞毒效应使肿瘤细胞凋亡,而且具有旁观者效应.结论 CYP1A2可使细胞在体外代谢DTIC产生细胞毒效应.以BMSC为载体的CYP1A2-DTIC酶-前药系统可发挥双靶向抗肿瘤作用,在体外诱导人恶性淋巴瘤细胞凋亡.     

间充质干细胞介导"酶-前药基因"CYP1A2靶向抗肿瘤效应研究

目的 将人细胞色素P450 1A2(CYP1A2)基因转染骨髓间充质干细胞(BMSC),检测转基因BMSC协同化疗前药达卡巴嗪(DTIC)对人恶性淋巴瘤细胞株Raji细胞的靶向促凋亡作用,为以间充质干细胞为载体的"基因介导的酶-前药双靶向抗肿瘤策略"提供体外实验依据.方法 从人肝细胞中克隆CYP1A2基因,构建真核表达载体,分离、鉴定并培养BMSC,脂质体法将CYP1A2基因导入BMSC和Raji细胞中,RT-PCR和Westem blot法检测CYP1A2基因的表达,Transwell法检测BMSC的肿瘤靶向性,MTT法检测转基因Raji细胞对DTIC敏感性的改变,Annexin V/PI染色标记法检测转基因BMSC联合DTIC诱导Raji细胞凋亡的作用.结果 成功克隆CYP1A2基因并将构建的真核表达载体转染BMSC和Raji细胞,流式细胞术检测体外诱导分化结果符合BMSC特性,RT-PCR和Westernblot检测到转基因细胞中CYP1A2表达,Transwell迁移实验证实BMSC有肿瘤趋向性,MTT法检测显示DTIC呈剂量依赖性抑制转CYP1A2基因的Raji细胞生长,而转CYP1A2基因的BMSC细胞对DTIC相对耐受(IC50值分别为1.67 mmol/L和7.53 mmol/L,P＜0.01).Armexin V/PI染色法显示CYP1A2能够使细胞在体外代谢DTIC,产生细胞毒效应使肿瘤细胞凋亡,而且具有旁观者效应.结论 CYP1A2可使细胞在体外代谢DTIC产生细胞毒效应.以BMSC为载体的CYP1A2-DTIC酶-前药系统可发挥双靶向抗肿瘤作用,在体外诱导人恶性淋巴瘤细胞凋亡.