CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的体外扩增

【目的】探讨有效的体外培养扩增CD4^＋CD25^＋Treg的方法。【方法】收集健康志愿者外周血5例,免疫磁珠法分选出CD4^＋CD25^＋Treg。将实验分为3组,第1组在CD4^＋CD25^＋Treg中加入100nmol／L rapamycin（1μg／mL）和包被了CD3／CD28单抗的磁珠培养3周,第8天开始加入1000U／mL的IL．2,第2组培养条件除不加rapamycin外其余与第1组相同,第3组培养细胞为CD4^＋CD25^＋细胞,培养条件同第1组。培养第7、14、21天收集细胞计数,第21天收集细胞行流式细胞术三标法检测CD4、CD25、FOXP3的表达。MTY法检测体外扩增的CD4^＋CD25^＋Treg对自体和异体的CD4^＋T细胞增殖的抑制作用。【结果】三组细胞均有明显的扩增。加rapamycin培养的CD4^＋CD25^＋Treg细胞的扩增率比不加rapamycin扩增倍数低,但细胞的纯度明显增加。CD4^＋CD25^＋T细胞组在培养第1周扩增迅速,从第2周开始增殖减慢,其中CD4^＋CD25^＋Treg细胞的比例较培养前无明显的差别。三组至第3周时扩增倍数分别为89±21、338±78、216±55（F=484．655,P〈0．0001）,细胞的纯度分别为84．32％±4．62％、34．04％±5．78％、0．68％±0．39％（F=24．660,P〈0．0001）。体外抑制实验显示体外扩增的CD4^＋CD25^＋T细胞对自体和异体的CD4^＋T细胞增殖均有明显的抑制作用,并且随着效靶比浓度的降低而降低。在CD4^＋T／Treg比例为8：1、4：1、2：1、1：1时对自体CD4^＋F细胞的抑制率分别为9．65％、16．43％、28．75％、55．34％,对异体CD4^＋T细胞的抑制率分别为6．43％、14．72％、26．47％、50．25％,而且在各浓度梯度其抑制作用在自体和异体之间均无明显的差异。【结论】我们采用rapamycin＋CD3／CD28单抗标记的磁珠＋IL-2在体外成功扩增了CD4^＋CD25^＋Treg,其扩增的倍数为89．4±20．53,具有免疫抑制功能,有望进一步应用于临床。     

多发性抽动症外周血中T淋巴细胞亚群CD45RA^＋、CD45RO^＋的表达及临床意义

目的观察多发性抽动症（Tourette’s syndrome，TS）患儿外周血中T淋巴细胞亚群CD4^＋CD45RA^＋、CD4^＋CD45RA^＋细胞的表达及临床意义。方法利用流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）检测34例TS患儿外周血中T淋巴细胞亚群CD4^＋CD45RA^＋、CD4^＋CD45RA^＋细胞的表达，同期检测35名年龄、性别无差异的健康儿童为对照。结果TS组外周血中CD4^＋CD45RA^＋细胞百分率（63．70±5．57）较正常对照组（45．39±7．70）高，t=10．29，P〈0．01；TS组外周血中CD4^＋CD45RO^＋细胞百分率（17．09±4．46）较正常对照组（41．99±8．47）低，t=11．11，P〈0．01；TS组CD4^＋CD45RA^＋／CD4^＋CD45RO^＋比值（4．32±1．51）较正常对照组（1．21±0．37）高，t=7．78，P〈0．01；TS组CD4^＋CD45RA^＋、CD4^＋CD45RO^＋双阳性率（14．63±7．56）较正常对照组（9．37±3．20）高，t=2．89，P〈0．05；均有显著统计学意义。结论TS患儿存在免疫功能紊乱，主要表现为外周血中CD4^＋CD45RA^＋细胞百分率明显增高，CD4^＋CD45RO^＋细胞百分率明显降低，TS患儿CD4^＋CD45RA^＋／CD4^＋CD45RO^＋失衡，TS患儿CD4^＋CD45RA^＋、CD4^＋CD45RO^＋双阳性率较高，这可能在TS发病机制中起着重要作用。     

SLE患者外周血调节性T细胞与IL-10,TGF—β1的检测

目的：研究SLE患者外周血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞（regulation T cells，Tr细胞）及相关细胞因子的变化，分析它们在SLE发病机制中的作用。方法：收集SLE患者及健康对照组外周抗凝静脉血，分离纯化T淋巴细胞。PE标记的抗CD4单抗，FITC标记的抗CD25单抗，作双色流式细胞术，分析SLE患者外周血CD4＋CD25^＋调节性T细胞百分率，ELISA法检测调节性T细胞相关细胞因子的表达。结果：SLE患者外周血Tr细胞的数量明显低于正常对照组[（2．83±1．05）％vs（5．07±0．59）％，P〈0．05]；患者血清中IL-10、TGF—β1的含量均低于正常对照组，差异有显著性[IL-10：（29．48±13．69）pg／mlvs（43．10±14．95）pg／ml；TGF—β1：（170．04±91．58）pg／mlvs（254．75±130．41）pg／ml，P〈0．05]。患者外周血Tr细胞的比例与血清中IL-10、TGF—β1的含量呈正相关（r1=0．53，r2=0．64，P〈0．05）。结论：SLE患者外周血存在细胞免疫功能失调，CD4^＋CD25^＋调节性T细胞数量与功能状态发生改变，T淋巴细胞耐受机制的破坏可能与SLE的免疫学发病机制有关。     

CD+4CD+25调节性T细胞在干燥综合征患者外周血和唇腺组织的表达

目的探讨CD4^＋CD25^＋调节性T细胞在干燥综合征（SS）患者外周血和唇腺组织的表达。方法用流式细胞术检测57例SS患者和46例健康对照组外周血和唇腺组织单细胞悬液CCD4^＋CD25^＋调节T细胞的表达;用免疫组化的方法,对唇腺石蜡组织的连续切片进行CD4、CD25、CD68和CD8染色。结果SS组CD4^＋CD25^＋调节性T细胞水平中位数为6．9％（2．84％-13．50％）,对照组为5．77％～15．30％,两者比较P〈0．001。SS组CD4^＋CD25^high T细胞水平为0．001％～1．83％,对照组为0．13％～2．45％,两者比较P〈0．001。唇腺组织免疫组化染色显示ss组患者唇腺中浸润的淋巴细胞中,CD4^＋T细胞占大多数,两组均无CD25的表达。结论SS患者唇腺中缺乏CD4^＋CD25^＋调节性T细胞,外周血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞降低,提示调节性T细胞在SS的发病机制中起重要作用。     

CD4^＋CD25^＋调节性T细胞对HCV感染者疾病进程影响的研究

目的：探讨HCV感染者外周血中CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的表达状况以及与疾病进程的相关性。方法：选取HCV感染者69例及健康对照23例,应用流式细胞术检测外周血中CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的表达。结果：HCV感染组外周血中CD4^＋CD25^＋调节性T细胞占CD4^＋T细胞比例明显高于对照组（P〈0.01）;慢性感染组外周血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞比例高于HCV无症状携带组（P〈0.05）;肝硬化组外周血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞比例高于慢性感染组（P〈0.05）。结论：HCV感染者外周血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞水平与疾病进程具有相关性。     

HCV感染者外周血T淋巴细胞亚群的变化

目的研究HCV感染者在病程各阶段外周血T淋巴细胞亚群的变化。方法流式细胞仪检测丙型肝炎患者CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞,并将其分为急性期组,慢性期组检测CD4^＋CD25^＋、CD4^＋CD28^-T淋巴细胞。结果丙型肝炎患者CD4^＋T细胞降低,CD8^＋T细胞升高,CD4^＋／CD8^＋降低,与对照组差异有统计学意义（P〈0．05）。急性期组CD4^＋CD25^＋与正常对照组差异无统计学意义（P〉0．05）,但CD4^＋／CD28^-T细胞显著高于对照组（P〈0．05）、慢性期组CD4^＋CD25^＋T细胞显著增高,而CD4^＋CD28^-T细胞显著低于对照组（P〈0．05）。结论丙型肝炎患者CD4^＋／CD8^＋明显降低,机体免疫状态紊乱,在各病程阶段CD4^＋CD25^＋、CD4^＋CD28^-T细胞比率明显变化,说明此淋巴细胞亚群与丙型肝炎的发病及发展有密切关系。     

黄芪对哮喘小鼠CD4^＋CD25^＋调节性T细胞及IL-4IFN-γIL-10的影响

目的探讨黄芪对哮喘小鼠CD4^＋CD25^＋调节性T细胞及IL-4、IFN-γI、L-10的影响。方法将BALB/c小鼠30只随机分为对照组、哮喘组和黄芪组。以卵蛋白（OVA）致敏激发法制备小鼠哮喘模型。酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中IL-4、IFN-γ、IL-10及血清中IL-10的含量;流式细胞术（FCM）、反转录聚合酶链反应（RT-PCR）分别检测小鼠脾脏中CD4＋CD25＋调节性T细胞数量及FoxP3 mRNA表达情况。结果哮喘组小鼠BALF中IL-4含量明显高于对照组（P〈0.01）而低于黄芪组（P〈0.01）。与对照组相比,哮喘组小鼠BALF中IFN-γI、L-10、血清中IL-10含量及脾脏中CD4＋CD25＋调节性T细胞数量、FoxP3 mRNA表达水平明显降低（P〈0.01）;而黄芪组的上述改变较哮喘组显著增加（P〈0.05）。结论 CD4^＋CD25^＋调节性T细胞参与了支气管哮喘的发病过程,黄芪可通过上调CD4^＋CD25^＋调节性T细胞、FoxP3 mRNA的表达及增加IL-10含量减轻哮喘炎症。     

CD4+CD25+调节性T细胞在肺癌患者外周血中的表达

目的探讨肺癌患者外周血中CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的变化及其与临床病理因素的关系。方法用流式细胞术检测60例肺癌患者和60例健康对照者的CD4^＋CD25^＋调节性T细胞数量变化。结果肺癌患者外周血中CD4^＋CD25^＋调节性T细胞水平明显高于正常组（P〈0．05），其变化与病理分期和是否有转移有关（P〈0．05），而和性别、家族史、病理类型和肿瘤体积等无关。结论CD4^＋CD25^＋调节性T细胞可能在肿瘤免疫中发挥重要作用，导致和促进肺癌的发生和转移。     

外周血CD4^＋CD25^＋CD127^-调节性T细胞在过敏性紫癜中的表达及意义

目的 探讨外周血CD4^＋CD25^＋CD127^＋调节性T细胞在HSP患儿治疗前和治疗后的表达及其临床意义。方法选取HSP患儿4l例作为观察组,选取健康儿童41例作为对照组,检测对照组儿童及观察组患儿治疗前后的CD4^＋CD25^＋CD127^＋值。结果（1）治疗前与对照组比较,CD4^＋CD25^＋CD127^＋明显降低（P〈0．05）;（2）与治疗前比较,观察组患儿的CD4^＋CD25^＋CD127^＋值在治疗后明显升高（P〈0．05）;（3）与对照组比较,观察组患儿治疗后CD4^＋CD25^＋CD127^＋值差异无显著性（P〉0．05）。结论外周血CD4^＋CD25^＋CD127^＋值在HSP患儿治疗前显著降低,给予有效的治疗后其值显著升高,可能在HSP的发生发展过程中调节性T细胞进行了参与。而对于HSP患儿对疾病的有效预测．可以对其CD4^＋CD25^＋CD127^＋值进行测定。     

中国HCV/HIV合并感染者或HIV单一感染者T淋巴细胞表面CD25和CXCR3表达的研究

目的探讨T淋巴细胞表面CD25分子和趋化因子受体CXCR3，在丙肝病毒（HCV）单一感染，艾滋病病毒（HIV）单一感染和HCV／HIV合并感染过程中的表达及意义。方法分离HCV感染组（n=21），HIV感染组（n=14），HCV／HIV感染组（n=28）及正常对照组（n=30）人外周血单个核细胞。采用流式细胞术。计数CD4^＋和CD8^＋t淋巴细胞数，检测外周血CD4^＋CD25^＋细胞百分含量和CD4^＋和CD8^＋淋巴细胞表面CXCR3的表达水平。结果CD4^＋T细胞表面CD25的表达在HCV感染组轻度升高，而在HIV感染组及HCVIHIV合并感染组CD25的表达显著降低（P〈0．001）。HIV感染组及HCV／HIV合并感染组CD4^＋T细胞表面CXCR3表达显著降低（P〈0．001）。CD8^＋T细胞表面CXCR3表达显著升高（P〈0．001）；HCV感染组CD4^＋及CD8^＋T细胞表面CXCR3表达轻度升高，但差异不显著。结论结果提示中国病毒感染者外周血T淋巴细胞表面CD25和CXCR3分子表达水平和机体免疫调节功能受到HIV感染的影响。     

供体抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞对肾移植大鼠免疫状态的影响

目的 研究供体抗原特异性CD4 CD25 调节性T细胞(Treg)对肾移植后大鼠免疫状态的影响.方法 常规分离Lewis和F344大鼠脾脏淋巴细胞,然后将Lewis大鼠淋巴细胞负载F344大鼠抗原,然后从负载抗原后的Lewis大鼠淋巴细胞悬液中用MACS磁珠分选法分离纯化供体抗原特异性CD4 CD25 Treg细胞,并用流式检测分选Treg细胞纯度以及RT-PCR检测分选细胞的Foxp3基因表达.以F344、Lewis大鼠分别为供、受体建立同种异体肾移植动物模型,将供体抗原特异性Treg细胞经尾静脉注射入受者体内(治疗组,n=8),选取未注射组为对照组(n=8).于术前1d,术后15d检测移植后4组大鼠血清IL-10、IgG,并于术后15d MTT法检测受体脾细胞对供体抗原刺激的反应.结果 所分选之CD4 CD25 Treg细胞成功获得供体抗原特异性,对供体抗原的抑制率(IR)为85.4%,并检测到Foxp3表达.移植前治疗组和对照组大鼠血清中均无法检测到IL-10浓度.术后15d治疗组血清IL-10与对照组比较,明显增高(P＜0.01).对照组在术后15d血清IgG浓度已经显著升高,较术前差异有统计学意义(P＜0.05).而治疗组术后15d血清IgG浓度与术前相比有所降低,与术前相比差异无统计学意义(P》0.05),但与对照组相比较均差异有统计学意义(P＜0.05).治疗组对供体脾细胞的刺激反应也明显低于Ⅰ组(P＜0.01).结论 供体抗原特异性CD4 CD25 Treg细胞能显著促进体内IL-10的产生以及抑制免疫球蛋白IgG的产生,并且可特异性抑制受体对供体抗原的免疫反应.     

CD4+CD25+Treg细胞调节T细胞作用机制的实验研究

目的 :通过检测Treg细胞表达介导抑制性共刺激分子CTLA4和分泌抑制性细胞因子 ,并设置Treg细胞与效应性T细胞共培养和分隔培养实验模型 ,分析Treg细胞对效应性T细胞形成抑制作用的可能机制及各机制的主次要关系。方法 :对比分析Treg细胞与效应性T细胞膜分子CTLA4、CD2 8表达和细胞因子IL 10、TGF β1 分泌水平 ;以TransWellMillicell PCF分隔培养槽分隔培养Treg细胞与不同淋巴细胞组成的反应体系 ,采用向共培养及分隔培养体系加入与不加入IL 10、TGF β1 抗体的阻断方法 ,检测Treg细胞对不同组混合淋巴细胞反应的抑制效率。结果 :Treg细胞分泌IL 10和TGF β1 的浓度水平明显高于效应性T细胞 ,Treg细胞培养上清中IL 10和TGF β1 水平分别达到(380 0± 36 3)pg ml和 (790 0± 5 6 8)pg ml,Treg细胞分泌IL 10和TGF β1 的浓度水平与效应性T细胞比较 ,均有显著性差异 (P <0 0 1)。共刺激分子CTLA4、CD2 8在Treg细胞和效应性T细胞膜表面的表达水平存在明显差异 ,Treg细胞以表达CTLA4为主。Treg细胞对共培养体系混合淋巴细胞反应的抑制效率明显高于分隔培养 ,通过分泌IL 10对效应性T细胞的抑制作用亦明显强于通过TGF β1 。结论 :细胞接触机制是Treg细胞抑制效应性T细胞的主要作用机制 ,而细胞因子机制中     

FasL嵌合蛋白修饰的供者脾脏细胞输注诱导免疫耐受的机制

 目的 探讨FasL嵌合蛋白修饰的供者脾脏细胞输注诱导移植免疫耐受的内在机制。方法 采用ProtExTM外源蛋白修饰技术,以FasL嵌合蛋白修饰供者WF大鼠的脾脏细胞,于心脏移植围手术期多次输注给受者ACI大鼠,按注射细胞的不同随机将实验动物分为3组：(1)SA-FasL修饰的供者脾脏细胞组（SA-FasL组,n=23）;(2)链霉亲和素蛋白（streptavidine,SA）修饰的供者脾脏细胞组（SA组,n=20）;(3)未修饰的供者脾脏细胞对照组（Spl组,n=8）。围手术期未作任何治疗为空白对照组（Control组,n=10）。进行体外混合淋巴细胞反应,将第三方F344大鼠心脏移植给耐受大鼠,观察排斥反应。检测受者体内CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺调节性T（Treg）细胞,并将其选出用于进行过继免疫研究。结果 SA-FasL组移植心脏长期存活率为70%,显著高于其他组（P<0.05）。混合淋巴细胞反应与对第三方心脏的排斥反应表明已建立供者特异性免疫耐受。耐受大鼠体内Treg细胞明显增多（P<0.05）,输注这群细胞能够过继免疫耐受。结论 FasL嵌合蛋白修饰的供者脾脏细胞输注能够诱导供者特异的免疫耐受,Treg细胞在免疫耐受状态的建立与维持中发挥重要作用。     

人天然CD4+CD25+调节性T细胞的体外扩增培养及鉴定

目的：建立有效的体外培养扩增人天然CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)的体系,并检测扩 增细胞的表型及体外免疫抑制功能,为Treg应用于临床免疫治疗提供实验基础。方法：免疫磁珠分离(MACS)方法从 人外周血单个核细胞中分离CD4+CD25+Treg,加入抗CD3/CD28包被磁珠刺激扩增;用台盼蓝染色法测定新鲜分选 的和扩增的Treg的数量和活性,用流式细胞法检测新鲜的和扩增的Treg主要表型标志和纯度,用混合淋巴细胞反应 (mixed lymphocyte reaction,MLR)法检测扩增的Treg对羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酶(CFSE)标记的自体和异体的 CD4+CD25–T细胞增殖的抑制作用。结果：扩增3周后Treg数目约为新鲜分选细胞数的2 000倍(由5.23×105±1.52×105扩增 至1.02×109±0.20×109),活性>97%。扩增3周后的Treg与新鲜分选细胞保持了相似的表型特征：CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺三阳细 胞约占(94.22±2.12)%,与新鲜分选细胞相似。扩增3周后的Treg对自体和异体的CD4+CD25–T细胞的增殖均有明显的抑 制作用,抑制率随着效靶比浓度的增高而增高(P<0.01),而且其各浓度梯度对自体和异体CD4⁺CD25^–T细胞的抑制率 无明显差异(P>0.05)。结论：创建的分离和体外扩增人CD4⁺CD25⁺Treg的方法,可以大量扩增出高纯度且保留其免疫 抑制功能的Treg,解决了Treg数目少的问题,有利于进一步的免疫研究和治疗。     

大鼠肝移植自发免疫耐受模型CD4+CD25+和CD8+CD28-调节性T细胞的变化

目的:比较CD8 CD28-,CD4 CD25 调节性T细胞(T regulatory cells,Treg)及其亚群表型在大鼠自发免疫耐受形成中的变化,并探讨其在肝移植免疫耐受形成中的作用.方法:(1)建立雄性Brown Norway近交系大鼠(简称BN)到Lewis近交系大鼠(简称LEW)原位肝移植免疫耐受模型(存活＞120 d),取同周龄LEW大鼠作为对照组,应用梯度离心法分离外周血及脾单个核细胞,应用流式细胞仪检测CD8 CD28-,CD4 CD25 T细胞亚群比例;(2)应用免疫磁珠分离方法,通过间接法阴性分选和直接法阳性分选两步分离纯化CD8 CD28-,CD4 CD25 T细胞,并对其亚型表型进行检测,比较它们在移植耐受前后的差别.结果:(1)耐受组大鼠外周血及脾单个核细胞中CD8 CD28-,CD4 CD25 调节性T细胞的比例同对照组比较:CD8 CD28-T细胞增高,外周血为(30.2±5.8)%比(16.4±6.1)%,脾为(23.7±7.2)%比(13.4±5.5)%,P＜0.01;CD4 CD25 T细胞无明显差别,外周血为(9.9±3.5)%比(10.4±4.2)%,脾为(15.1±3.7)%比(14.7±4.6)%,P＞0.05.(2)CD8 CD28-,CD4 CD25 T细胞的亚型表型检测,①CD8 CD28-T细胞:耐受组为CD152(CTL-4)-,CD11b ,CD25-,CD45RO ;对照组为CD152(CTL-4)-,CD11b ,CD25-,CD45RO部分表达(76%);②CD4 CD25 T细胞:耐受组为CD152(CTL-4) ,CD11b ,CD28 ,CD45 RO ;对照组为CD152(CTL-4) ,CD11b ,CD28 ,CD45 RO .结论:CD8 CD28-Treg细胞在耐受组大鼠外周血及脾单个核细胞中的比例明显增高,而CD4 CD25 Treg细胞则无明显改变,提示CD8 CD28-Treg细胞在大鼠肝移植自发耐受的形成中的作用可能更为重要;CD152(CTL-4)在两种Treg细胞表达差别可能是引起它们作用及表现不同的重要原因;黏附分子CD11b可能同两种Treg细胞的功能均密切相关;CD8 CD28-Treg细胞包含着不同亚群,而CD45RO表达的增加可能同CD8 CD28-Treg细胞发挥抑制功能密切相关.     

益气养阴方影响Lewis肺癌移植小鼠肿瘤生长的实验研究

目的 通过对Lewis肺癌移植鼠肿瘤生长及肿瘤组织中Notch信号表达、CD4+CD25+ Treg细胞变化的观察,探讨益气养阴方干预肺癌的量效关系及机制。 方法 将肺癌移植小鼠随机分为4组,模型组只行造模;中药组按小鼠体重按不同剂量灌胃给药分为等效剂量组、大剂量组;化疗组以CTX腹腔注射化疗。记录各组小鼠瘤体大小,观察期满后留取标本行Notch信号表达检测。 结果 ①肿瘤相对体积(RTV)及肿瘤相对抑制率:大剂量组RTV低于其他3组(P＜0.01),化疗组RTV低于等效剂量组(P＜0.05);大剂量组肿瘤抑制率较其他3组高(P＜0.05)。②肿瘤组织中Notch信号通路表达及CD4+CD25+ Treg细胞:等效剂量组Notch1 mRNA表达及CD4+CD25+ Treg细胞高于化疗组(P＜0.05);高剂量组较等效剂量组及化疗组低(P＜0.05);等效剂量组Notch3 mRNA表达与化疗组比较差异无统计学意义(P＞0.05);高剂量组较等效剂量组及化疗组Notch3 mRNA表达量降低(P＜0.05);等效剂量组、高剂量组、化疗组Jagged1 mRNA及Hesl mRNA表达均较模型组降低(P＜0.05),等效剂量组与化疗组Jagged1 mRNA及Hesl mRNA表达量降低(P＞0.05);高剂量组较等效剂量组及化疗组Jagged1 mRNA及Hesl mRNA表达量降低(P＜0.05)。 结论 益气养阴方剂有抑制Lewis肺癌移植小鼠肿瘤生长的作用,此种作用与益气养阴方剂的药物用量之间存在量效关系,且此种关系提示较大剂量的益气养阴方用量可能更有利于抑制Lewis肺癌细胞生长,而这种抑制作用与益气养阴方剂调控肿瘤组织中Notch1信号通路及CD4+CD25+ Treg细胞有关。      

CD4+Foxp3+ regulatory T cells converted by rapamycin from peripheral CD4+CD25− naive T cells display more potent regulatory ability in vitro

Background Rapamycin （RAPA） is a relatively new immunosuppressant drug that functions as a serine/threonine kinase inhibitor to prevent rejection in organ transplantation. RAPA blocks activation of T-effector （Teff） cells by inhibiting the response to interleukin-2. Recently, RAPA was also shown to selectively expand the T-regulator （Treg） cell population. To date, no studies have examined the mechanism by which RAPA converts Teff cells to Treg cells. Methods Peripheral CD4＋CD25- naive T cells were cultivated with RAPA and B cells as antigen-presenting cells （APCs） in vitro. CD4＋CD25- T cells were harvested after 6 days and analyzed for expression of forkhead box protein 3 （Foxp3） using flow cytometry. CD4＋CD25＋CD127- subsets as the converted Tregs were isolated from the mixed lymphocyte reactions （MLR） with CD127 negative selection, followed by CD4 and CD25 positive selection using microbeads and magnetic separation column （MSC）. Moreover, mRNA was extracted from converted Tregs and C57BL/6 naive CD4＋CD25＋ T cells and Foxp3 levels were examined by quantitative real-time polymerase chain reaction （rt-PCR）. A total of 1×105 carboxyfluorescein succinimidyl ester （CFSE）-labeled naive CD4＋CD25- T cells/well from C57BL/6 mice were cocultured with DBA/2 or C3H maturation of dendritic cells （mDCs） （0.25×105/well） in 96-well round-bottom plates for 6 days. Then 1×105 or 0.25×105 converted Treg cells were added to every well as regulatory cells. Cells were harvested after 6 days of culture and analyzed for proliferation of CFSE-labeled naive CD4＋CD25- T cells using flow cytometry. Data were analyzed using CellQuest software.Results We found that RAPA can convert peripheral CD4＋CD25- naive T Cells to CD4＋Foxp3＋ Treg cells using B cells as APCs, and this subtype of Treg can potently suppress Teff proliferation and maintain antigenic specificity. Conclusion Our findings provide evidence that RAPA induces Treg cell conversion from Teff cells and uncovers an additional mechanism for tolerance induction by RAPA.     

低剂量环磷酰胺对Lewis肺癌小鼠CD4+CD25+Treg细胞功能的影响

目的：研究低剂量环磷酰胺（CTX）单次注射对Lewis肺癌小鼠CD4⁺CD25⁺Treg细胞功能的影响,探讨CD4⁺CD25⁺Treg 细胞与肿瘤发生、发展的关系。方法：将传代培养的Lewis肺癌细胞接种于C57BL/6小鼠右腋皮下,建立Lewis肺癌模型,随机分成3组：CTX组、肿瘤组、单纯对照组。采用CTX单次注射,观测各组肿瘤体积动态变化;采用流式细胞术检测各组小鼠脾脏CD4⁺CD25⁺Treg细胞数量变化;采用半定量RT-PCR方法检测各组小鼠脾脏Foxp3 mRNA表达水平;采用MTT法检测脾脏T淋巴细胞增殖功能;采用LDH释放法检测脾脏特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)细胞的杀伤活性。结果：与未治疗肿瘤组相比,CTX治疗可延缓荷19 d Lewis肺癌小鼠的肿瘤生长;CTX组小鼠脾脏CD4⁺CD25⁺Treg细胞数量低于肿瘤组（P< 0.05）;CTX组小鼠脾脏Foxp3 mRNA表达水平明显低于肿瘤组（P< 0.05）;CTX组小鼠脾脏T淋巴细胞功能明显高于肿瘤组（P<0. 05）;CTX组小鼠脾脏T淋巴细胞杀伤活性比肿瘤组略高,但变化不显著（P>0.05）。结论：CTX单次注射可降低Lewis肺癌小鼠脾脏CD4⁺CD25⁺Treg细胞的数量及Foxp3 mRNA表达,使T淋巴细胞增殖功能及脾细胞中CTLs杀伤功能增强。     

肿瘤细胞对CD4~+CD25~+Treg细胞数量和功能的影响

目的：探讨肿瘤细胞与免疫细胞相互作用对CD4+CD25+Treg细胞数量和功能的影响。方法：建立Lewis肺癌细胞与小鼠脾淋巴细胞共培养体系。Lewis肺癌细胞与不同浓度小鼠脾淋巴细胞共培养,分为4组：实验组Ⅰ（5×105个Lewis肺癌细胞与1×106个淋巴细胞共培养）、对照组Ⅰ（1×106个淋巴细胞单独培养）、实验组Ⅱ（5×105个Lewis肺癌细胞
与2×106个淋巴细胞共培养）、对照组Ⅱ（2×106个淋巴细胞单独培养）;Lewis肺癌细胞与
淋巴细胞共培养不同时间,采用3个时间点：24、48和72 h;Lewis肺癌细胞培养上清与淋巴细
胞共培养,选择培养上清浓度为20%和50%。采用流式细胞术检测了Lewis肺癌细胞与脾淋巴
细胞共培养系统中CD4+CD25+Treg细胞数量变化,通过RT-PCR方法检测了共培养对Foxp
3 mRNA表达的影响。结果：与对照组比较,实验组Ⅰ 中CD4+CD25+Treg细胞数量和Foxp3 mRN
A表达明显增强（P<0.05）,实验组Ⅱ中CD4+CD25+Treg细胞数量和Foxp3 mRNA表达无明
显变化（P>0.05）;Lewis肺癌细胞与淋巴细胞培养24及48 h可见CD4+CD25+Treg细胞数量及Foxp3
mRNA表达明显升高（P<0.05）,而72 h后变化不明显;20%和50% Lewis肺癌细胞培养上清
均可明显提高CD4+CD25+Treg数量及Foxp3 mRNA表达（P<0.05）。结论：肿瘤细胞及其培养
上清可诱导CD4+CD25+Treg细胞数量增加、功能增强,由肿瘤细胞所引起的CD4+CD25+Treg细
胞产生及功能增强可能是肿瘤逃避免疫监视机制之一。     

CD137信号下调乳腺癌患者外周血Treg细胞的免疫抑制功能

目的探讨CD137信号对CD4^＋CD25^＋调节性T细胞（Treg）的生物学效应及机制。方法采用激发型抗人CD137单抗加入PHA刺激的乳腺癌患者外周血T细胞培养体系及Treg细胞培养体系中,利用细胞计数及^3H-TdR掺入法分析T细胞的增殖,流式细胞术分析细胞膜分子和Foxp3表达,ELISA分析细胞因子的分泌。结果CD137分子表达于乳腺癌患者外周血CD4^＋CD25^＋Treg细胞膜;抗人CD137单抗加入PHA活化的乳腺癌患者T细胞培养体系后,T细胞增殖明显增加,Foxp3^＋Treg细胞比例明显下降;激发CD137信号可下调CD4^＋CD25^＋Treg细胞的Foxp3表达,抑制Treg细胞产生TGF-β1和IL-10,以及下调Treg细胞对PHA刺激的CD4^＋CD25^-T细胞增殖的抑制效应。结论CD137信号可抑制Treg细胞的免疫抑制功能,CD137可能是对Treg细胞进行免疫干预的重要靶点。