轴突导向因子Netrin-1对视网膜脉络膜内皮细胞RF/6A的作用研究

目的 研究轴突导向因子Netrin-1对视网膜脉络膜内皮细胞RF/6A的作用.方法 用免疫组化,CCK-8,Transwell及Martrigel方法检测不同浓度Netrin-1对RF/6A细胞增殖,迁移和管腔形成的作用及与血管内皮生长因子(VEGF)的相互作用.结果 体外实验发现Netrin-1对新生血管形成具有双重作用,浓度0～500ng/ml,对细胞迁移,增殖及管腔形成表现为促进作用,而在Netrin-1浓度＞500ng/ml时表现为抑制作用.Netrin-1浓度为50ng/ml时增殖和迁移能力最强.VEGF同时作用时,增殖及迁移作用增强.结论 Netrin-1对RF/6A细胞系的作用依浓度改变表现为对细胞增殖、迁移及管腔形成的促进及抑制作用.VEGF存在的条件下,促进作用表现为进一步增强,抑制作用无明显差异.由此可以推测Netrin-1在新生血管形成中具有双重调控作用,调控作用取决于Netrin-1的浓度及与VEGF的相互作用.在以新生血管发生为主要特点的增殖性糖尿病性视网膜病变中可能起到一定作用.     

香菇多糖体外抗血管生成作用实验研究

目的:研究香菇多糖对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)增殖、迁移、黏附以及体外血管生成作用的影响。方法:香菇多糖设31.25 mg·L-1、62.5 mg·L-1、125 mg·L-1、250 mg·L-1、500 mg·L-1等5个质量浓度,以沙利度胺(200 mg·L-1)为阳性对照。采用MTT法检测香菇多糖对HUVEC细胞增殖的影响,Transwell小室迁移实验检测其对细胞迁移的影响,纤维连接蛋白(Fn)黏附实验检测其对细胞黏附的影响,Tuber formation assay法检测其对体外血管生成的影响。结果:经香菇多糖干预后,HUVEC细胞增殖、迁移、黏附及血管生成均受到明显抑制。当质量浓度大于62.5 mg·L-1时与对照组比较,差异有统计学意义。随着浓度的增加,抑制作用逐渐增强,质量浓度为250 mg·L-1时对细胞增殖的抑制率最高,为43.8%。香菇多糖抑制细胞迁移、黏附和血管生成的作用呈剂量依赖性,质量浓度为500mg·L-1时抑制作用最显著。结论:香菇多糖可显著抑制HUVEC的增殖、迁移、黏附以及体外血管生成,提示香菇多糖抗肿瘤作用可能与抑制血管生成有关。     

磷脂酶A2抑制剂对血管新生抑制作用的研究

目的：研究磷脂酶A2(sPLA2)抑制剂(HyPE)对人骨髓来源内皮细胞系(HBME-1)的血管新生过程的影响。方法：为研究HyPE对HBME-1的增殖、迁移和毛细血管样管状结构形成的抑制作用。首先在培养液中，加入促血管新生因子，如碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和抑瘤素(OSM)(终浓度分别为25ng／ml、20ng／ml年2．5ng／ml，不同)和不同浓度的HyPE，研究其对HBME-1的增殖作用的影响：其二，研究不同浓度的HyPE对HBME-1的迁移的影响：最后，在纤维蛋白胶中，研究不同的血管新生因子和HyPE对微血管形成的影响。以上实验均以透明质酸(HyAc)为对照。结果：促血管新生因子可有效的促进HBME-1的增殖，此作用可被HyPE以剂量依赖方式抑制；同时HyPE以剂量依赖方式抑制HBME-1的迁移。在纤维蛋白胶中，不论是在血管新生因子与HyPE同时作用于HBME-1，或是在血管新生因子先活化HBME-1后，再加入HyPE，此两种情况下，HyPE均可抑制毛细血管样结构的形成。结论：sPLA2参与内皮细胞的增殖、迁移和血管新生过程：sPLA2抑制剂(如HyPE)可抑制此过程，其抑制作用并不是通过干扰扰血管新生因子与内皮细胞的结合，而可能是通过干扰血管新生因子的信号途径而起作用。sPLA2抑制剂可用作为新的药物用于抗血管新生治疗。     

重组人血管内皮抑素对多发性骨髓瘤血管新生的影响

目的观察重组人血管内皮抑素注射液对人脐静脉内皮细胞株（HUVEC）和多发性骨髓瘤细胞株KM3增殖、凋亡及共培养体系中血管生成的影响。方法观察不同浓度的内皮抑素对HUVEC和KM3细胞株的增殖抑制作用;检测有效浓度的内皮抑素对HUVEC和KM3细胞株的凋亡作用;建立HUVEC和KM3的隔离共培养和混合共培养体系,检测共培养体系中不同浓度的内皮抑素作用后对于HUVEC血管生成的影响;检测经内皮抑素作用后对混合共培养、隔离共培养上清中VEGF浓度的影响。结果不同浓度的内皮抑素持续作用72 h,对HUVEC具有抑制增殖作用,且在50-200 ng/ml的剂量范围内呈现浓度依赖关系,而对KM3细胞未见明显作用;有效浓度的内皮抑素（100、200 ng/ml）可诱导HUVEC凋亡,而对KM3未见明显作用;共培养体系中,内皮抑素可抑制HUVEC的管状结构形成;经不同浓度内皮抑素作用后,细胞培养上清中VEGF的分泌量减少。结论内皮抑素能抑制HU-VEC的增殖;诱导HUVEC的凋亡;通过血管内皮抑制骨髓瘤细胞的促血管新生作用;抑制VEGF的分泌可能是其作用机制之一。     

苦参碱联合热疗抗血管生成作用的实验研究

目的：探讨苦参碱联合应用热疗对体内外血管生成的抑制作用。方法：采用MTT法观察苦参碱联合热疗对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、人结肠癌LOVO细胞增殖的影响;采用transwell板,观察苦参碱对HUVEC迁移的影响;采用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型,观察苦参碱对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管的抑制作用。结果：苦参碱在6.25～200μg/ml浓度时,具有抑制HU-VEC增殖的作用（细胞存活率在86.4%～56.1%）,与浓度呈负相关（（相关系数r为-0.955）,此浓度范围内苦参碱对人肠癌细胞株细胞的抑制低于对内皮细胞的抑制,具有明显的差异细胞毒作用;在12.5～25μg/ml浓度时苦参碱对鸡胚尿囊膜血管形成具有显著的抑制作用;在6.25～25μg/ml浓度时对内皮细胞迁移具有显著抑制作用;6.25、12.5、25μg/ml苦参碱联合热疗在体外具有抗血管生成的次加效应。50、100、200μg/ml苦参碱联合热疗在体外具有抗血管生成的协同效应。结论：小剂量苦参碱（6.25～200μg/ml）在体内外具有抑制血管生成作用,联合热疗具有协同或次加效应。     

黄蜀葵花总黄酮对人脐静脉血管内皮细胞形成新生血管的影响

目的观察黄蜀葵花总黄酮（TFA）对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）形成新生血管的影响。方法以体外培养HUVEC为模型,MTT法检测不同浓度TFA对细胞增殖的影响;Transwell小室细胞进行迁移实验检测药物对细胞迁移能力的影响;管形形成实验观察药物对细胞分化的影响。结果5.0~20.0 mg/L TFA作用72 h,不仅对HUVEC增殖有明显促进作用;而且能促进HUVEC迁移;10.0~20.0 mg/L TFA能够促进HUVEC管样结构形成。结论一定浓度的TFA具有明显促进HUVEC形成新生血管的作用。     

黄蜀葵花总黄酮对人脐静脉血管内皮细胞形成新生血管的影响

目的观察黄蜀葵花总黄酮（TFA）对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）形成新生血管的影响。方法以体外培养HUVEC为模型,MTT法检测不同浓度TFA对细胞增殖的影响;Transwell小室细胞进行迁移实验检测药物对细胞迁移能力的影响;管形形成实验观察药物对细胞分化的影响。结果5.0~20.0 mg/L TFA作用72 h,不仅对HUVEC增殖有明显促进作用;而且能促进HUVEC迁移;10.0~20.0 mg/L TFA能够促进HUVEC管样结构形成。结论一定浓度的TFA具有明显促进HUVEC形成新生血管的作用。     

基质细胞衍生因子-1对人脐静脉血管内皮细胞迁移的影响

目的:利用Boyden chamber体外迁移体系初步探索基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)在人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)迁移中的作用及其信号转导机制。方法:以HUVEC为实验材料,首先利用免疫荧光技术及蛋白印迹方法检测HUVEC表达SDF-1α受体CXCR4,其次利用Boyden chamber体外迁移体系,先观察不同浓度的SDF-1α对HUVEC迁移的影响,最后以磷脂酰肌醇-3激酶(PI-3K)阻断剂wortmannin(50 M)或LY294002(10μM)、丝裂酶原活化蛋白激酶(MAPK)阻断剂PD98059(50μM)、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)阻断剂U73122(10μM)、CXCR4特异性阻断剂AMD3100(0.1 mg/ml)等不同预处理HUVEC 30 min,观察分析SDF-1α对HUVEC迁移影响的信号转导通路。结果:培养的HUVEC表达SDF-1α受体CXCR4,HUVEC体外迁移能力随着SDF-1α浓度的递增而逐渐增强,并且SDF-1α浓度在100 ng/ml时,HUVEC迁移到滤膜上的细胞数最多;Wort-mannin、LY294002、PD98059、U73122、AMD3100对HUVEC迁移均有影响,其中U73122、AMD3100对HUVEC迁移阻断的效应最显著。结论:SDF-1α/CXCR4所介导的HUVEC迁移与MAPK)、PI-PLC和蛋白激酶C(PKC)等信号途径有关,且PKC途径可能处于中心环节。     

雷帕霉素抑制人脐静脉内皮细胞增殖与迁移

目的探讨雷帕霉素(Rapamycin)对脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖、迁移的抑制作用。方法应用噻唑蓝(MTT)实验、流式细胞仪、迁移实验研究不同浓度雷帕霉素对血管内皮细胞生长因子(VEGF)诱导的HUVECs增殖、迁移的影响。结果雷帕霉素浓度大于10ng/ml、作用48h以上可以明显抑制VEGF诱导的HUVECs的增殖(P<0.05),呈时间、剂量依赖性;流式细胞仪检测细胞被阻滞在G0/G1期,并诱发了细胞凋亡;利用Transwell装置证实雷帕霉素浓度大于10ng/ml时抑制了HUVECs的迁移。结论雷帕霉素可通过抑制血管内皮细胞的增殖与迁移抑制血管生成。     

2-脱氧葡萄糖通过激活AMPK通路抑制类风湿关节炎血管新生

通过观察2-脱氧葡萄糖（2-DG）对佐剂关节炎（AA）大鼠滑膜组织血管翳形成的抑制及对人脐静脉内皮细胞 （HUVEC）增殖、迁移和体外成管的作用,探讨2-DG抑制类风湿关节炎血管新生的机制。方法采用滑膜病理组织HE染色观察 滑膜组织血管翳形成;CCK-8法检测HUVEC的细胞增殖活性;Transwell小室法检测HUVEC的迁移;体外基质胶成管实验检 测HUVEC 的成管数;Western blot 检测p-AMPK 以及抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达;使用AMPK 阻断剂Compound C 阻断 HUVEC细胞的AMPK信号通路。结果2-DG（200 mg/kg）明显减轻AA大鼠滑膜组织血管翳生成（P<0.01）;体外实验结果显 示,2-DG（0.5 mmol/L和/或5 mmol/L）可明显抑制HUVEC的增殖、迁移和体外成管（P<0.01或P<0.001）,加入AMPK受体阻断 剂Compound C（5 μmol/L）,2-DG对HUVEC的活化的抑制作用被明显阻断（P<0.01）;Western blot结果显示2-DG（5 mmol/L） 可以增加P-AMPK的蛋白表达,减少Bcl-2的蛋白表达,差异有统计学意义（P<0.05）。结论2-DG可能通过激活AMPK通路减 少Bcl-2的表达抑制内皮细胞增殖、迁移和体外成管,从而抑制类风湿关节炎血管新生。     

miR-185 通过靶向调控MRTF-A抑制VEGF引起的HUVECs迁移和血管形成

Objective: To investigate whether the migration and angiogenesis of HUVECs treated by VEGF could be inhibited by overexpression miR-185. Methods: HUVECs were transfected with miR-185 mimics and treated with 50 ng/mL of VEGF. HUVECs migration ability was tested by wound heal assay and transwell assay; Angiogenesis was tested by Matrigel assay. Results: Wound heal assay and transwell assay confirmed that miR-185 mimics inhibited VEGF-induced HUVECs migration and reduced the expression of migration marker genes MYL9 and CYR61. Meanwhile, Matrigel assay showed that miR-185 mimics inhibited VEGF-induced HUVECs angiogenesis. Conclusion: Overexpression miR-185 could inhibit the migration and angiogenesis of HUVECs induced by VEGF.     

高迁移率族蛋白1诱导内皮细胞释放细胞因子的作用及其与脂多糖对白细胞介素6释放的协同效应

目的观察高迁移率族蛋白1(HMGB1)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)释放细胞因子的影响及其对脂多糖(LPS)诱导细胞因子白细胞介素6(IL-6)表达的作用。方法用LiquiChip液相蛋白芯片系统检测重组HMGB1蛋白(15ng/ml)诱导HUVEC11种细胞因子/趋化因子的水平变化;检测不同浓度HMGB1(0~75ng/ml)刺激后不同时间点(0、1、3、6、12和24h)HUVEC分泌IL-6的水平以及HMGB1(15ng/ml)与LPS(10ng/ml)共同刺激对HUVEC分泌IL-6的影响。结果HMGB1刺激后HUVEC分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素γ(IFN-γ)、IL-6、IL-8和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的水平明显升高(均P<0.01),分别是对照(未加刺激)的5.7、4.2、27.8、12.8和5.4倍;HMGB1蛋白以时间和剂量依赖方式诱导IL-6的分泌,在刺激后3~6h,IL-6水平开始增加,在6h时IL-6由对照的32pg/ml±21pg/ml增加到75pg/ml±22pg/ml(P<0.01),12h(453pg/ml±78pg/ml)~24h(901pg/ml±184pg/ml)持续升高(P<0.01);随着HMGB1浓度的增加,IL-6的水平也明显增加,当HMGB1浓度为3、15、75ng/ml时,IL-6分别是155pg/ml±33pg/ml、901pg/ml±184pg/ml、1508pg/ml±378pg/ml,与基础值32pg/ml±21pg/ml相比,差异有统计学意义(P<0.01)。分别用LPS(10ng/ml)和HMGB1(15ng/ml)单独刺激HUVEC时,IL-6的含量从基础的32pg/ml±22pg/ml分别增加至289pg/ml±42pg/ml和901pg/ml±184pg/ml(均P<0.01);如果用二者共同刺激HUVEC,IL-6的生成量大大增加(2361pg/ml±299pg/ml),二者存在协同作用(F=69.405,P<0.01)。结论HMGB1蛋白可诱导HUVEC释放多种炎性细胞因子;HMGB1诱导IL-6的上调具有时效性和量效性关系,并可协同LPS刺激HUVEC释放IL-6,在脓毒症的发生和发展中起重要作用。     

不同浓度Netrin-1对人滋养细胞株TEV-1增殖凋亡的影响研究

目的 探讨不同浓度Netrin-1对滋养细胞株TEV-1增殖凋亡的影响。 方法 行经0、10、100及1 000 ng/ml Netrin-1干预TEV-1 24 h后,采用噻唑兰MTT比色法检测细胞增殖指数、流式细胞法检测细胞凋亡率,采用免疫荧光组织化学方法鉴定TEV-1表达Netrin-1情况,采用实时定量PCR及western印迹分别检测各组细胞Netrin-1mRNA及蛋白变化情况。 结果 以递增浓度的Netrin-1预处理TEV-1细胞24 h后,TEV-1细胞增殖行为无影响,但TEV-1细胞凋亡率随Netrin-1浓度增加而降低,当Netrin-1刺激浓度达1 000 ng/ml时,TEV-1细胞总凋亡率下降至(6.63±0.07)%,较空白组(0 ng/ml)凋亡率(14.44±0.85)%下降明显(P<0.01)。Netrin-1表达于滋养细胞细胞质。在培养的滋养细胞株TEV-1中加入不同剂量的Netrin-1干预24 h后,TEV-1 Netrin-1蛋白表达水平无明显变化。 结论 Netrin-1能明显降低滋养细胞的凋亡程度,期间涉及机制与滋养细胞Netrin-1表达水平无关。      

甜橙黄酮对斑马鱼及人脐静脉内皮细胞抗血管新生活性的作用

目的:观察甜橙黄酮在斑马鱼及人脐静脉内皮细胞(HUVECs)上的抗血管新生能力,并探讨其相关作用机制。方法:以150 nmol/L内皮细胞生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(VRI)为阳性对照组、以相应浓度DMSO为空白对照组,观察不同浓度(3,10,30μmol/L)甜橙黄酮对转基因斑马鱼血管系统的影响,并通过实时荧光定量PCR检测相关血管新生基因表达的影响;分别采用XTT与流式细胞术检测3～100μmol/L甜橙黄酮对20 ng/ml内皮细胞生长因子(VEGF)诱导的HUVECs增殖和细胞周期的影响。结果:甜橙黄酮可以剂量依赖性地抑制斑马鱼节间血管(ISV)的形成,下调血管新生相关基因hras、kdrl和vegfaa的表达;可剂量依赖性抑制VEGF诱导的HUVECs增殖,并诱导HUVECs停滞于细胞周期G0/G1期。结论:甜橙黄酮可能通过阻滞细胞周期和影响相关基因的表达达到在斑马鱼体内模型和HUVECs体外模型的抗血管新生作用。     

诺帝对人恶性胶质瘤细胞甲酰化肽受体表达及其活化后促增殖和血管生成因子产生的影响

目的观测自行研制的脂氧化酶抑制剂诺帝（Nordy）对人恶性胶质瘤细胞系U87中甲酰化肽受体（FPR）的表达和激活后功能活性的影响。方法采用间接免疫荧光标记、激光共聚焦扫描显微术观测诺帝对U87系人恶性胶质瘤细胞FPR表达的影响;FPR激动剂N-甲酰化的甲硫酰-亮氨酸-苯丙氨酰胺（fMLF）激活FPR后加入诺帝,实验分为以下3组：①对照组,②fMLF刺激组,③诺帝处理组,分别采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法、逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）和双抗夹心酶联免疫吸附法（ELISA）检测诺帝对FPR活化后引起的细胞增殖及细胞分泌血管内皮生长因子（VEGF）和白细胞介素8（IL-8）的作用。结果诺帝（100μmol／L）明显抑制U87细胞FPR受体的表达,同时对FPR激动剂fMLF（100nmol／L）诱导的U87细胞增殖和血管生成因子VEGF、IL-8 mRNA表达和蛋白的分泌具有明显的抑制作用。对照组U87细胞分泌一定量的VEGF和IL-8,分别为（4．14±0．28）ng／ml和（4．03±0．59）ng／ml;fMLF作用于U87细胞36h后,VEGF和IL-8蛋白水平均显著高于对照组（P〈0．05）,分别为（6．46±0．33）ng／ml和（7．54±0．73）ng／ml;诺帝作用于U87细胞12h后加入fMLF共同处理36h后,VEGF和IL-8蛋白水平分别为（3．59±0．33）ng／ml和（3．13±0．48）ng／ml,均显著低于对照组（P〈0．05）。结论诺帝对人恶性胶质瘤细胞的FPR表达和该受体活化后的促瘤细胞增殖及促血管生成因子VEGF、IL-8 mRNA表达和蛋白的分泌具有抑制作用,提示诺帝具有抑制肿瘤生长和抗血管生成的作用。     

可注射型富血小板纤维蛋白促进人脐静脉内皮细胞成血管能力的体外实验研究

目的 探究可注射型富血小板纤维蛋白(injectable platelet-rich fibrin, iPRF)对体外培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)成血管分化能力的影响。方法 CCK-8实验检测HUVECs增殖能力并筛选最佳浓度的可注射型富血小板纤维蛋白提取液(injectable platelet-rich fibrin extract, iPRFe);划痕实验和小管形成实验分别检测HUVECs迁移能力和成血管分化能力;实时定量PCR检测成血管相关基因的mRNA表达。结果 0.4 mg/mL浓度的iPRFe促进HUVECs增殖效果最佳;iPRFe对HUVECs迁移和小管形成有显著的促进作用,还能明显提高血管生成素(angiogenin, ANG)、C-X-C基序趋化因子受体4(C-X-C motif chemokine receptor 4, CXCR4)、血小板衍生生长因子受体A(platelet-derived growth factor receptor A, PDGFRA)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的表达水平。结论 iPRF可以促进HUVECs增殖、迁移和成血管能力,有望成为用于牙髓再生的新材料。     

PEDF对人脐静脉内皮细胞和肺癌SK-MES-1细胞增殖的影响及作用机制

目的 探讨色素上皮衍生因子(PEDF)对SK-MES-1细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖的影响及可能的机制.方法 CCK-8法检测不同浓度PEDF在不同作用时间条件下对HUVECs和SK-MES-1细胞增殖的影响;流式细胞仪检测不同浓度PEDF对此两种细胞凋亡的影响;qRT-PCR检测PEDF对此两种细胞中血管内皮生长因子(VEGF)基因表达水平的影响.结果 CCK-8结果显示,PEDF对HUVECs和SK-MES-1细胞具有增殖抑制作用,呈一定浓度和时间依赖性(P<0.05);流式细胞术结果表明,实验组细胞的凋亡率高于对照组(P<0.05),高浓度用药组凋亡率高于低浓度用药组(P<0.05);qRT-PCR结果表明,与对照组相比,PEDF能抑制HUVECs和SK-MES-1细胞中VEGF mRNA水平的表达(P<0.05).结论 PEDF的抗肿瘤作用主要包括抑制肿瘤血管生成和直接作用于肿瘤细胞两方面,PEDF对HUVECs和SK-MES-1细胞增殖的影响可能与降低VEGF表达水平有关.