应用蛋白质组技术对维甲酸耐药相关蛋白的初步分析

目的探讨采用蛋白质组学技术研究维甲酸的耐药机制。方法提取维甲酸敏感细胞株NB4及维甲酸耐药细胞株MR2的总蛋白,进行双向凝胶电泳识别差异表达蛋白,经质谱分析、数据库搜索进行蛋白鉴定。结果单张凝胶电泳图上呈现约600多个蛋白点,组间的匹配性较好,初步筛选出三个表达差异蛋白,经鉴定分别为DJ-1蛋白、热休克蛋白70及KIAA1289未知功能蛋白。结论应用双向电泳连接质谱的蛋白质组学方法有助于筛选到耐药相关的表达蛋白,为进一步研究维甲酸耐药机制提供分子基础。     

卵巢癌细胞株COC1、顺铂耐药细胞株COC1/DDP的蛋白质组学比较

目的:应用蛋白质组学技术比较人卵巢癌细胞株COC1及耐药细胞株COC1/DDP之间的蛋白质差异,寻找与顺铂耐药有关的相关蛋白质。方法:提取细胞株COC1、耐药细胞株COC1/DDP的总蛋白,用双向凝胶电泳(2-DE)的方法获得两细胞株的双向电泳图,选择差异倍数在3倍以上、边界清晰的蛋白质点胶内酶切后,用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和超高效纳升液相色谱-电喷雾串联质谱(NanoUPLC-ESI-MS/MS)分析鉴定。结果:双向凝胶电泳图谱上检测到1 878个蛋白质点,匹配率为93.6%,差异倍数3倍以上的蛋白质点67个,其中COC1/DDP细胞株高表达有23个,低表达的有44个。选取差异蛋白斑点6个用两种质谱方法初步鉴定了6种蛋白质:dUTP焦磷酸酶、aarF域含蛋白激酶4(ADCK4)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、角蛋白1、角蛋白9、角蛋白10。结论:双向凝胶电泳结合质谱技术可用于肿瘤蛋白质差异的分析,有助于研究肿瘤耐药的机制。     

卵巢癌紫杉醇耐药的蛋白质组学研究

目的：研究与卵巢癌紫杉醇耐药相关的蛋白质。方法：应用双向凝胶电泳（2-DE）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）寻找紫杉醇耐药细胞和敏感细胞的差异表达蛋白质。使用Western印迹技术对其中2个蛋白质进行验证。结果：通过对2组细胞总蛋白质双向凝胶电脉图谱进行分析,找到差异蛋白质点40个;通过质谱分析,24个蛋白质得到鉴定。这些蛋白质包括增殖细胞核抗原（PCNA）、nm23蛋白、prohibitin（PHB）分子伴侣蛋白、脂皮质素（annexin）、α-烯醇化酶（α-enolase）以及热休克蛋白（HSP）等。结论：通过蛋白质组学技术,发现了卵巢癌紫杉醇耐药细胞系和敏感细胞系之间差异表达蛋白质24个,这些差异蛋白质可能参与卵巢癌细胞紫杉醇耐药过程。     

人耐药肺腺癌A549/DDP细胞株的差异蛋白质组学

目的：建立A549与A549/DDP两组细胞株的双向凝胶电泳图谱,识别并鉴定其差异表达的蛋白质,筛选肺腺癌耐药相关蛋白质。方法：收集A549与A549/DDP两组细胞株的总蛋白质,应用二维凝胶电泳（two-dimensional gel electrophoresis,2-DE）进行分离应用,图像分析识别差异表达的蛋白质点,采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定差异蛋白质点。使用Western免疫印迹对其中4个蛋白质进行验证。结果：建立了A549与A549/DDP细胞蛋白质的2-DE图谱,识别了40个差异表达的蛋白质点,鉴定了23个差异表达蛋白质。Western免疫印迹证实了差异蛋白质热休克蛋白β1,膜联蛋白A4,丝切蛋白l和波形蛋白在A549与A549/DDP细胞中的差异表达水平。结论：23个差异表达蛋白质为研究肺腺癌耐药机制提供了实验依据。     

宫颈永生化细胞和癌细胞胞膜差异蛋白质组学研究

目的建立HPV-16阳性的宫颈上皮永生化细胞（H8细胞株）和宫颈癌细胞（CaSKi细胞株）胞膜蛋白双向电泳图谱,寻找特征性的差异蛋白点。方法提取两种细胞胞膜蛋白质进行双向凝胶电泳（2-dimensronal gel electrophore-sis,2-DE）,建立电泳图谱,然后筛选出差异点进行基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱（matrix-assisted laser desorption/i-onization time-of-flight tandem mass spectrometry,MALDI-TOF-MS/MS）分析,鉴定出蛋白质。结果获得了分辨率和重复性均较好胞膜蛋白2-DE图谱,并分析找出了13个的差异蛋白点,对其中3个显著差异点进行质谱分析和初步鉴定。结论建立了H8和Caski细胞胞膜蛋白2DE图谱,并初步发现LRC8D、EDAR、MTX1蛋白在宫颈癌前病变和宫颈癌细胞胞膜中存在差异表达,为宫颈癌及癌前病变的诊断及癌变机制提供了帮助。     

鼻咽癌低分化细胞系CNE-2双向凝胶电泳图谱的建立

目的：建立人鼻咽癌低分化细胞系CNE-2双向凝胶电泳图谱,初步分析其蛋白质表达情况。方法：采用双向凝胶电泳（2-DE）分离人鼻咽癌低分化细胞系CNE-2总蛋白,银染显色,Image Master图象分析系统分析,从胶中选取分离较好的蛋白质点,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析获取肽质量指纹图谱（PMF）,Mascot软件搜索MSDB和SWISS-PROT数据库鉴定蛋白质。结果：获得重复性和分辨率较好的CNE-2双向凝胶电泳图谱;质谱分析了78个蛋白质点,获取77张肽质量指纹图谱,通过查询数据库鉴定了48个蛋白质。结论：建立了人鼻咽癌低分化细胞系CNE-2双向凝胶电泳图谱,并应用质谱技术鉴定了部分蛋白质点,为人鼻咽癌蛋白质组数据库的建立提供了有意义的数据。     

亚急性红斑狼疮皮损角质形成细胞的蛋白组学初步研究

目的建立亚急性红斑狼疮皮损和正常皮肤角质形成细胞双向电泳图谱,分析二者蛋白质的表达差异及特点。方法运用双向凝胶电泳分离6例亚急性皮肤红斑狼疮患者皮损和正常皮肤角质形成细胞总蛋白,考马斯亮蓝染色,比较分析差异蛋白表达。结果皮损和正常组电泳图谱平均蛋白质点分别为（1586±41）和（1601±49）,匹配率为78.69%和80.89%。差异蛋白质点共26个,16个在皮损高表达,2个在皮损组低表达,有6个点仅在病例组表达,2个点仅在正常对照组表达。结论获得分辨率高且重复性较好的双向电泳蛋白质组图谱,识别重复表达的差异蛋白。     

宫颈永生化细胞和癌细胞的胞质蛋白双向电泳图谱的建立及初步分析

目的:建立HPV-16阳性的宫颈上皮永生化细胞(H8细胞株)和宫颈癌细胞(CaSKi细胞株)胞质蛋白双向电泳图谱,并初步分析找出特征性的差异蛋白点.方法:分别培养H8和CaSki细胞,用亚细胞结构蛋白质提取试剂盒提取胞质蛋白进行双向电泳,用ImageMaster 2D V2002.1图像分析软件分析电泳图谱,筛选差异蛋白点.结果:获得了分辨率和重复性均较好的宫颈永生化细胞和癌细胞胞质蛋白2-DE图谱,并分析找出了显著的差异蛋白点8个,其中3种蛋白质在宫颈癌细胞株表达上调,1种蛋白质表达明显下调,2种蛋白质在宫颈癌细胞株表达缺失,2种蛋白质在永生化细胞株表达缺失.结论:应用亚细胞蛋白双向凝胶电泳技术对HPV-16阳性的宫颈癌前和癌变的胞质蛋白分析,能有效找出蛋白质表达差异点,为进一步确定宫颈癌前病变和癌细胞的关键性差异蛋白质的结构和功能奠定了基础.     

应用蛋白质组学技术研究HL-60细胞及其耐阿霉素细胞株的蛋白表达差异

目的比较人髓系白血病细胞株HL-60细胞和耐阿霉素的细胞（HL-60／ADR）的整体蛋白表达谱,以期获得人髓系白血病细胞的耐药相关蛋白。方法提取HL-60细胞和HL-60／ADR细胞的总蛋白,采用荧光差异显示的双向凝胶电泳技术（DIGE）比较分析差异表达蛋白;经胶内酶解,MALDI-TOF／TOF质谱分析,搜索蛋白质数据库,获得差异蛋白质的信息。结果经过初步筛选和质谱分析共获得16个具有统计学意义的表达差异蛋白点,其中13个在HL-60细胞中表达上调,3个表达下调。主要是代谢酶类、DNA修复、信号转导相关蛋白、细胞周期调节蛋白和细胞增殖与凋亡等相关的蛋白。结论根据人髓系白血病细胞株HL-60细胞和HL-60／ADR细胞的差异蛋白表达谱比较,筛选出耐药相关蛋白。     

联用2-DE和MALDI-TOF-MS技术筛查胃癌组织和血清中的差异蛋白质

目的 分别建立肠型、弥漫型胃癌组织和血清双向凝胶电泳图谱,鉴定差异表达蛋白,从中发现有意义的胃癌肿瘤相关标志物.方法 采用双向凝胶电泳（two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2-DE）分离组织和血清总蛋白,经硝酸银染色,分析选取有表达差异的蛋白质点,通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）鉴定差异蛋白.结果 获得重复性和分辨率较好的胃癌组织和血清双向凝胶电泳图谱,经MALDI-TOF-MS鉴定得到20种蛋白,在7例（58.3%）肠型胃癌组织中均有硒结合蛋白1（SBP1）表达,KIAA基因家族蛋白在弥漫型胃癌组织和血清中均有表达.结论 建立了弥漫型肠型胃癌组织和血清双向凝胶电泳图谱,获得了差异蛋白质点,为寻找胃癌的特异蛋白质作为胃癌肿瘤标志物奠定了基础.     

高脂血症相关性急性胰腺炎大鼠蛋白质组学分析

目的 探讨高脂血症对大鼠急性胰腺炎的损伤机制.方法 对高脂饮食SD大鼠和正常饮食SD大鼠均分别予雨蛙肽腹腔注射和牛磺胆酸钠胰管注射,建立4组动物模型:高脂血症急性水肿性胰腺炎组、高脂血症急性坏死性胰腺炎组、正常血脂急性水肿性胰腺炎组和正常血脂急性坏死性胰腺炎组,每组5只,采用相差双向电泳(2D-DIGE)和MALDI串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)检测差异蛋白质,并采用免疫组化验证差异蛋白质表达.结果 高脂血症急性水肿性胰腺炎和高脂血症坏死性胰腺炎动物模型胰腺组织有典型组织病理学改变.通过DeCyder图像分析软件进行匹配,高脂血症急性坏死性胰腺炎组与正常血脂急性坏死性组分析到59个差异点,39个差异点经质谱成功鉴定,23个点在高脂血症急性坏死性胰腺炎组上调,16个点下调.高脂血症急性水肿性胰腺炎组与正常血脂急性水肿性组分析到12个差异点,7个差异点经质谱成功鉴定,2个点在高脂血症急性水肿性胰腺炎组上调,5个点下调.差异蛋白质主要包括代谢酶类(脂肪酶、淀粉酶、α1抗胰蛋白酶等),内质网应激和钙代谢相关蛋白质[葡萄糖调节蛋白(GRP)78、热休克蛋白(HSP)60、蛋白二硫键异构酶等],以及与DNA损伤修复、细胞凋亡、循环障碍、信号传导通路等相关蛋白质.淀粉酶和GRP78免疫组化验证结果与电泳结果一致.结论 应用相差凝胶电泳和二级质谱的蛋白质组学手段筛选到内质网应激、细胞凋亡等相关蛋白质在高脂血症急性胰腺炎中的差异表达.高脂血症对急性胰腺炎的损伤加重通过多种途径,内质网应激相关蛋白质可能作为高脂血症相关急性重症胰腺炎的早期预警信号和临床治疗新靶点.     

Effects of arsenic trioxide on drug transporting molecules in multidrug resistance malignant neoplasma MR2 cell line

INTRODUCTIONIn recent ye ars, some studies have introducedAs2O3 into the treatment of acute promyelocyticleukemia (APL) with the complete clinical remission(CR) rate of 52.3￣93.7%[1,2]. Studies in vitro haveconfirmed that As2O3 can induce apoptosis of retinoicacid-resistant APL cell line[3]. As2O3 has been also ap-plied in the treatment for refractory primary hepaticcancer [4] with satisfactory result [5]. The drug resis-tance of tumor is correlated with the drug transport-ing molec…     

氧化砷对MR2细胞耐药分子表达的影响

目的:探讨三氧化二砷(As_2O_3)对肿瘤耐药分子的作用。方法:以耐全反式维甲酸(ATRA)早幼粒白血病细胞株MR_2为研究对象,以非耐药急性早幼粒白血病细胞株NB_4为对照组,用免疫组化法观察P-糖蛋白(Pgp)、谷胱甘肽S转移酶(GST)的表达。结果:MR_2细胞Pgp表达(30％～40％)较NB_4细胞(10％～20％)明显增强(P<0.001),MR_2细胞GSTπ表达(60.4±4.0)～(66.5±4.4)较NB_4细胞(28.3±5.6)～(31.2±5.1)明显增强(P<0.05)。0.5～2.0μmol/L As_2O_3能显著降低MR_2细胞Pgp、GSTπ表达,而对GSTα、GSTμ无影响。结论:Pgp、GSTπ表达的下调,可能是As_2O_3克服耐药的敏感性指标,而GSTα、GSTμ则否。全反式维甲酸(ATRA)可能是Pgp转运底物和GSTπ催化作用底物。     

人肺腺癌细胞系A549与正常支气管上皮细胞系HBE的比较蛋白质组学研究

目的利用蛋白质组学技术建立人肺腺癌细胞系A549与正常支气管上皮细胞系HBE的差异蛋白质表达谱,并对部分在A549细胞中表达明显上调的蛋白质点进行鉴定。方法提取A549和HBE细胞的总蛋白,进行双向凝胶电泳(2-DE),经图像分析识别差异表达蛋白质点,再应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定出部份在A549细胞中表达明显上调的蛋白质。结果 (1)分析两种细胞系的2-DE图谱,发现差异表达蛋白质点共256个,仅在A549细胞中表达的蛋白质点15个,仅在HBE细胞中表达的蛋白质点21个;(2)通过肽质量指纹图谱分析鉴定出在A549细胞中表达明显上调的7种蛋白质,分别是表皮生长因子受体(EGFR)、鼠双微粒体2蛋白(MDM2)蛋白、CD44蛋白、细胞骨架蛋白细胞角蛋白8(CK8)、不均一性核糖体蛋白H(hnRNP H)、热休克蛋白60(HSP60)、磷酸甘油酸变位酶1(PGAM1)。结论运用蛋白质组学技术成功获得了A549细胞与HBE细胞的2-DE图谱,并鉴定出部分在A549细胞中表达明显上调的蛋白质,为进一步筛选用于人肺腺癌诊断、治疗及预后评估的分子标志物奠定了一定的基础。     

双向电泳-质谱法寻找类风湿关节炎疾病相关蛋白

目的建立正常人及类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者血浆蛋白质的双向凝胶电泳图谱,并分析其差异表达的蛋白质,寻找RA疾病相关蛋白,以阐明RA的发病机制.方法采用固相pH梯度(immobilized pH gradient,IPG)双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)分离正常人及类风湿关节炎患者血浆总蛋白质,凝胶经银染显色后,PDQuest图像分析软件进行比较分析、识别差异表达的蛋白质,对差异蛋白质点用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱进行鉴定.结果获得正常人及类风湿关节炎患者血浆蛋白双向凝胶电泳图谱,平均蛋白质点数分别为592和563,匹配率分别为89%和87%,通过比较分析,差异表达蛋白质点数为24,选取15个点进行质谱鉴定,成功鉴定7个蛋白质,其中6个蛋白质表达上调.结论两者间存在一些差异表达的蛋白质,为阐明RA的发病机制打下了坚实的基础.     

人参皂甙Rh2对人脑恶性胶质瘤SHG-44细胞抗肿瘤作用的蛋白质组学分析

目的：利用蛋白质组学研究技术分离、鉴定人脑恶性胶质瘤SHG-44细胞经人参皂甙Rh2（G-Rh2）作用后差异表达蛋白,探讨G-Rh2抗胶质瘤作用机制。方法：提取32 μmol?L-1 G-Rh2处理72 h后的SHG-44细胞及空白对照组细胞总蛋白;通过双向凝胶电泳分离蛋白质
,选取2D图谱中差异表达≥1.5倍且P<0.05的蛋白质斑点,使用基质辅助激光解析离子飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）进行肽指纹图谱（PMF）鉴定。结果：与空白对照组比较,SHG
-44细胞经G-Rh2作用后,双向电泳发现了20个差异蛋白质点,其中16个蛋白质点表达下调,4蛋白质点上调。质谱分析了前5个差异显著的下调蛋白质点,分别为丝切蛋白1（cofilin 1）、磷酸甘油酸激酶（phosphoglycerate kinase,PGK）、过氧化物氧化还原酶1（peroxiredoxin 1,Prx 1）、热休克蛋白（heat shock proteins,HSP）和增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen,PCNA）。结论：差异表达的蛋白质可能参与了G-Rh2对人脑恶性胶质瘤的抗肿瘤作用。     

全仅式维甲酸(ATRA)和三氧化二砷(As2O3)对APL细胞组织因子表达的影响

目的　探讨全反式维甲酸 (ATRA)和三氧化二砷 (As2 O3)在体内外对急性早幼粒细胞性白血病 (APL)细胞组织因子 (TF)表达的影响。方法　利用复钙时间测定、ELISA和RT PCR等方法 ,分别检测了ATRA和As2 O3 治疗前后APL患者骨髓单个核细胞的促凝活性、TF抗原及其mRNA的转录水平 ,同时还检测了使用ATRA和As2 O3 处理APL细胞株NB4细胞和NB4 R1细胞以及转染PML RARa融合基因的U937细胞的促凝活性、TF抗原及其mRNA的转录水平。结果　ATRA和As2 O3 在体内和体外均可以时间依赖的方式下调NB4细胞的促凝活性、TF抗原水平以及TFmRNA的转录。转染PML RARa融合基因的U937细胞与仅转染逆病毒载体的U937细胞相比 ,其TF表达水平显著升高 ;使用ATRA或As2 O3 分别处理转染PML RARa和转染逆病毒载体的U937细胞 ,其TF抗原水平均显著降低。结论　ATRA和As2 O3均可下调APL细胞TF的表达并降低其PCA ,As2 O3在诱导APL细胞凋亡的同时有可能通过下调APL细胞TF的表达而改善APL患者与DIC相关的出血症状。结果还提示APL细胞染色体易位产生的融合蛋白PML RARa可能对TF的异常表达有一定的影响 ,而ATRA和As2 O3对TF的下调作用可能不依赖于对融合蛋白PML RARa的降解。     

应用二维电泳和质谱技术筛选食管癌及癌旁组织的差异表达蛋白质

目的 筛选食管癌组织与正常食管组织中的差异表达蛋白质,以发现用于食管癌早期诊断的生物学标志物.方法 收集食管癌组织及其配对的正常食管组织,提取组织蛋白质,进行二维电泳,选取在癌组织中高表达的3个点和在正常食管组织中高表达的3个点进行基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱分析,将获得的肽质量指纹图进行生物信息学分析,鉴定差异蛋白质,利用RT-PCR方法验证蛋白质组筛选结果.结果 建立了分辨率高、重复性较好的食管癌和食管正常组织蛋白质的二维电泳图谱,经鉴定发现了鳞状细胞癌抗原1、细胞角蛋白4和膜联蛋白Ⅰ在食管癌组织中表达下调.磷酸丙糖异构酶1、锰超氧化物歧化酶和热休克蛋白27在食管癌组织中表达上调.RT-PCR的实验结果验证了差异蛋白质的可靠性.结论 食管癌组织和正常食管组织的差异表达蛋白质可做为食管癌早期诊断的候选生物学标志物.     

高分化胃腺癌组织表达缺失蛋白质分析

目的本研究应用蛋白质组学方法,分析胃癌(gastric carcinoma, GC)中表达缺失蛋白质分子.方法提取胃癌及配对正常胃黏膜组织总蛋白,采用双向电泳获得胃癌与配对正常胃黏膜组织蛋白质表达谱并进行分析,鉴定胃癌表达缺失的蛋白质分子.结果通过比较分析5对高分化胃腺癌及配对正常胃黏膜组织的蛋白表达谱,共发现差异表达蛋白点81个,其中7个蛋白点仅正常胃黏膜组织表达,而在胃癌组织中表达缺失,分别为:细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白12(P16)、细胞周期素依赖激酶抑制蛋白1(P21)、抗氧化蛋白2、二硫化蛋白异构酶A2、C-1-四氢叶酸合成酶、Rho-GTPase-激活蛋白4、胰岛素样生长因子结合蛋白2.结论胃癌组织与正常胃黏膜组织之间存在蛋白质表达差异.寻找胃癌组织与正常胃黏膜组织之间表达差异蛋白质,为探讨胃癌发病分子机制提供有用依据.