Survivin在NF-κB圈套寡核苷酸促进肝癌细胞HepG2凋亡中的作用

目的观察核转录因子-κB(NF-κB)圈套寡核苷酸对NF-κB活性的影响,研究Survivin在其诱导肝癌细胞HepG2凋亡中的作用。方法将异硫氰酸荧光素(FITC)标记的NF-κB圈套寡核苷酸转染至HepG2细胞中,荧光倒置显微镜和共聚焦显微镜进行核内定位观察,凝胶迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)检测转染前后NF-κB活性变化;流式细胞仪和TUNEL检测细胞凋亡率;Western blot检测凋亡抑制蛋白Survivin的改变。结果NF-κB圈套寡核苷酸转染后定位于细胞核内,EMSA显示转染后NF-κB活性明显下降。与未处理组、转染错义组相比,转染NF-κB圈套寡核苷酸组的HepG2细胞凋亡率增加,Survivin蛋白表达下调[(39.8±1.9)、(42.7±2.5)vs(20.1±3.1)]。结论NF-κB圈套寡核苷酸具有促进肝癌细胞HepG2凋亡的作用,其机制可能与下调Survivin的表达有关。     

小檗胺对慢性粒细胞白血病细胞抑制作用的机制研究

目的:探讨小檗胺诱导慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞凋亡的机制.方法:体外培养K562细胞株细胞,经8 μg/ml小檗胺处理不同时间后用Western blot检测细胞内总NF-κB、核内NF-κB和IκBα、pIκBα、IKKα、A20蛋白表达.结果:随着小檗胺处理时间的延长,细胞内总NF-κB无变化,但核内的NF-κB表达下降,半定量比值从处理前的59.2%,随着作用时间的延长,逐步下降为31.4%,19.7%,4.1%,0%.同时出现pIκBα、IKKα表达下调,A20表达增高.结论:小檗胺通过NF-κB途径诱导慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞凋亡的机制,可能涉及抑制NF-κB的核转位和转激活,推测其作用与小檗胺降低K562细胞bcr-abl基因的表达有关.     

小豆蔻明诱导K562细胞凋亡及其相关凋亡蛋白的表达

目的：探讨小豆蔻明诱导K562细胞凋亡与PTEN、p-Akt、NF-κB、Bcl-2等抑凋亡蛋白及促凋亡蛋白表达量的关系。方法①普通光镜观察小豆蔻明作用K562细胞48h后的细胞形态学变化。②采用MTT法检测小豆蔻明作用K562细胞48h后的凋亡情况,计算IC50。③应用流式细胞仪检测小豆蔻明作用K562细胞48h后的细胞凋亡率。④采用RT-PCR技术检测小豆蔻明作用K562细胞48h后Bcl-2、Bax的mRNA表达量。⑤采用Westernblot技术检测小豆蔻明作用K562细胞48h后PTEN、p-Akt、NF-κB、Bcl-2的蛋白表达量。结果小豆蔻明作用K562细胞48h后,形态学出现明显凋亡现象。MTT提示K562细胞增殖抑制明显且呈量效和时效关系。早期凋亡率与空白组比有显著增加（P＜0.05）,呈剂量依赖关系。Bcl-2mRNA的表达较空白组明显下降（P＜0.05）,BaxmRNA的表达较空白组明显升高（P＜0.05）,呈现浓度依赖性。PTEN蛋白表达量随小豆蔻明的浓度增加明显增加,而p-Akt、NF-κB、Bcl-2蛋白表达量则减少。结论小豆蔻明通过增加PTEN蛋白的表达量,同时下调p-Akt、NF-κB、Bcl-2蛋白的表达量促进K562细胞的凋亡,且呈剂量依赖性。     

四嗪二甲酰胺对K562和K562/Adr的作用及其与NF-κB信号分子的关系

目的探讨四嗪二甲酰胺(ZGDHu-1)对慢性粒细胞白血病细胞株K562(K562-S)和耐药细胞株K562/Adr(K562-R)的抑制作用及其对p210 BCR/Ab l融合蛋白和转录核因子κB(NF-κB)表达的影响。方法 MTT比色法观察其对K562-S细胞增殖的抑制作用,采用Hoechst 33258荧光染色检测细胞凋亡,流式细胞仪及细胞克隆形成初步分析其对白血病干细胞的影响,通过Western印迹分析PARP-1、p210 BCR/Abl、c-Abl、NF-κB的表达。结果不同浓度的ZGDHu-1对K562-S细胞均有增殖抑制作用,呈现剂量-时间依赖关系,ZGDHu-1作用48h时的IC50值为0.25μg/ml。在ZGDHu-1作用7天后,K562-S及K562-R细胞克隆形成被完全抑制。ZGDHu-1作用48h后,出现PARP-1裂解,诱发细胞凋亡,下调K562-R细胞p210 BCR/Abl及c-Abl的表达,抑制K562-S及K562-R细胞质内NF-κB/p65的表达。结论 ZGDHu-1能够抑制K562-S及耐药细胞株K562/Adr(K562-R)细胞的增殖,促进细胞凋亡。通过抑制p210 BCR/Abl的表达,降低NF-κB的活性,阻断NF-κB信号传导通路,尤其对于耐药型白血病细胞具有广泛的应用价值。     

Ad5F35-IκBαΔN重组腺病毒对K562/DNR细胞耐药性逆转的研究

目的:研究Ad5F35-IκBαΔN重组腺病毒对K562/DNR细胞耐药性的逆转作用及相关机制。方法:采用流式细胞仪分析细胞凋亡;NF-κB p65活性分析试剂盒检测K562/DNR细胞NF-κB活性。结果:感染Ad5F35-IκBα△N腺病毒后,K562/DNR细胞NF-κB活性受到明显抑制,从0.224±0.021活性单位/μg核蛋白降至0.132±0.015;凋亡率明显增高,从(10.4±1.5)%升至(43.2±4.8)%。结论:感染Ad5F35-IκBα△N腺病毒后,可通过抑制NF-κB的活性,增加K562/DNR细胞凋亡率,从而逆转K562/DNR细胞的耐药性。     

辛伐他汀诱导裸鼠体内K562细胞凋亡过程中NF-κB通路的分子变化

目的:探讨辛伐他汀在裸鼠体内引起的K562细胞NF-κB信号通路的分子变化,以说明辛伐他汀是否依赖NF-κB信号通路参与K562细胞凋亡发生.方法:体外培养慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞,接种于18只BALB/c-nu/nu裸小鼠皮下,构建移植瘤模型.随机分为3组,每组6只.对照组腹腔注射生理盐水0.2 ml,两个处理组分别注射0.2 g/L的辛伐他汀0.25 ml(0.05 mg)和0.4 ml(0.08 mg).均隔日注射,连续6次.采用TUNEL法检测K562细胞早期凋亡的变化,RT-PCR检测K562细胞中NF-κB信号通路IKK-β、IκB-α、NF-κB1 mRNA的差异表达.结果:不同剂量的辛伐他汀能够诱导裸鼠体内K562细胞发生明显的凋亡,且高剂量组凋亡率高于低剂量组(P＜0.01);不同剂量的辛伐他汀能够引起 IKK-β、IκB-α、NF-κB1 mRNA的表达下调(P＜0.01).结论:辛伐他汀可诱导K562细胞凋亡,可能与NF-κB通路基因的表达下调有关.     

MG132和顺铂的联合用药对Caov-3细胞中NF-κB和cyclinD1表达的影响

目的 研究蛋白酶体抑制剂MG132和顺铂的联合用药前后卵巢癌细胞株Caov-3细胞内NF-κB和cyclinD1的表达变化情况.方法 免疫组织化学SP法测定用药前后Caov-3细胞中NF-κB和cyclinD1的表达情况.MTT法检测细胞的生长抑制情况.结果 免疫组织化学结果显示MG 132和顺铂联合用药作用24h后Caov-3细胞中NF-κB和cyclinD1的表达下调,与对照组和顺铂组比较差异有显著性(P＜0.01),联合用药组中不同MG132浓度的各组间两两比较差异有显著性(P＜0.01),联合用药能显著增加细胞的生长抑制率(P＜0.01).结论 MG132能诱导卵巢癌细胞Caov-3的凋亡,其重要的作用机制可能是通过抑制NF-κ B和cyclinD1的表达来抑制肿瘤细胞的生长和诱导肿瘤细胞的凋亡.     

蛋白酶体抑制剂对大肠癌细胞增殖和凋亡的影响

目的研究蛋白酶体抑制剂MG132对大肠癌细胞系HCT-8增殖和凋亡的影响及其机制。方法将不同浓度MG132分别作用于HCT-8细胞,MTT法测其对HCT-8细胞增殖的抑制作用,流式细胞术检测细胞凋亡率,免疫细胞化学检测NF—κB、caspase3蛋白表达。结果随着MG132剂量、作用时间的增加,细胞增值抑制率增加（P〈0．01）;MG132作用细胞48h后,随着药物浓度的增加,细胞凋亡率增加（P〈0．01）;细胞内NF—kBp65的表达减少而caspase3的表达增加（P〈0．01）。结论MG132能显著抑制大肠癌细胞增殖并诱导其凋亡,可能与下调NF—κB表达、促进caspase3表达有关。     

不同浓度硼替佐米对K562／DNR细胞株NF—κB，IκB及P-gp表达的影响

目的：观察不同浓度硼替佐米（商品名万珂,PS-341）对柔红霉素（DNR）诱导的K562耐药细胞株（K562／DNR）核因子-κB（NF—κB）、抑制蛋白κB（IκB）及P-糖蛋白（P—gp）表达的影响,探讨PS-341逆转耐药的分子机制．方法：四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）进行耐药细胞株和PS-341细胞毒性的判定．以100mg／LDNR单用或联合应用0．4,4,40μg／LPS-341作用于K562／DNR36h,检测各组NF-κB,IκB及P—gp表达情况,并测定NF—κB活性,检测各组细胞凋亡率．结果：与阴性对照组相比,DNR可诱导NF—κB表达上调、IκB表达下调、P-gp表达上调;加用PS-341可显著抑制NF—κB表达,同时使IκB表达增加、P—gp表达下降,上述作用随PS-341浓度增加而增强．NF—κB活性（％）检测示：DNR组为25．9±2．5,DNR＋0．4μg／LPS-341组为20．3±2．0,DNR＋4μg／LPS-341组为6．1±2．5,DNR＋40μg/LPS-341组为4．6±1．6,加入PS-341后,NF—κB活性受抑,该作用随PS．341浓度增加而增强．细胞凋亡率（％）检测结果示：DNR组为22．5±4．6,DNR＋0．4μg／LPS-341组为31．0±5．2,DNR＋4μg／LPS-341组为43．6±7．7,DNR＋40μg/LPS．341组为56．0±9．3,加入PS-341后可提高DNR引起的细胞凋亡率,该作用随PS-341浓度的增加而增强．结论：PS-341可逆转白血病细胞耐药,该作用呈浓度依赖性．     

蛋白酶体抑制剂MG-132诱导K562细胞株凋亡的时程效应

目的研究不同时间蛋白酶体抑制剂MG-132对人慢性粒细胞白血病急性红白血病变细胞株K562的干预作用。方法采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测16μmol／LMG-132作用不同时间（0、24、48、72、96h5个时间点）对K562细胞株增殖的影响,免疫细胞组织化学法检测MG-132作用不同时间后核因子-κB（NF—κB）及糖皮质激素受体（GR）的表达,采用流式细胞术检测MG-132不同作用时间对凋亡的影响。结果MTT：MG-132干预K562细胞株不同时间后K562细胞株的抑制率表现为对时间的依赖性,实验组明显高于对照组（P均〈0．05）,以干预72h时抑制率最高,为（63．33±1．52）％。免疫细胞组织化学法：MG-132干预K562细胞不同时间后,K562细胞株中的NF—κB、GR的表达水平均表现为对时间的依赖性;对于NF—κB,实验组明显低于对照组（均P〈0．05）,以干预96h时表达最低,为51．15±1．64;对于GR,以干预72h时表达最高,为89．21±3．49。流式细胞术：MG-132干预K562细胞株不同时间后K562细胞株的凋亡率表现为对时间的依赖性,实验组明显高于对照组（P均〈0．05）,以干预72h时,凋亡率最高,为（17．57±1．45）％。结论MG-132可能是通过下调NF—κB、上凋GR的表达诱导了K562细胞的凋亡和抑制,并表现出对时间的依赖性。     

白血病细胞株耐药与核因子κB蛋白质诱导表达的关系

目的:探讨慢性粒细胞性白血病细胞K562与其耐药株K562/ADR细胞中IκB-α和NF-κB的表达,以及三氧化二砷(As2O3)诱导白血病细胞凋亡的关系.方法:应用不同浓度的As2O3诱导K562和K562/ADR细胞凋亡,以Western-blot免疫印迹电泳检测NF-κB、IκB-α的表达,流式细胞术检测细胞凋亡及分析IκB-α的阳性表达率变化.结果:As2O3诱导K562/ADR细胞凋亡率明显低于K562细胞,当As2O3浓度为1 μmol/L时,两种细胞凋亡率分别是(6.33±1.51)%、(13.25±1.83)%,当As2O3浓度增高到4 μmol/L时,细胞凋亡率则分别为(8.00±1.47)%、(50.56±8.62)%(P＜0.05).在K562细胞胞浆中,IκB-α阳性表达率则由(88.07±0.99)%减少到(49.21±0.95)%(P＜0.01),胞核中P65量逐渐增加;而K562/ADR细胞中无明显变化.结论:As2O3可诱导K562细胞凋亡,伴有IκB-α的降解及NF-κB的激活;K562/ADR细胞NF-κB表达增加,对As2O3诱导的反应无明显改变.     

MG132诱导HL-60细胞表达共刺激分子CD86及对混合淋巴细胞反应的影响

目的研究蛋白酶体抑制剂MG132诱导HL-60细胞表达共刺激分子CD80、CD86及其对混合淋巴细胞反应的作用。方法流式细胞仪检测MG132诱导HL-60细胞表达共刺激分子CD80、CD86及细胞活力;逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析CD80和CD86mRNA表达情况;75Gy照射MG132诱导的HL-60细胞后,用CCK-8检测提高共刺激分子表达后,HL-60细胞对健康人单个核细胞的增殖作用。结果MG132上调HL-60细胞表达CD86,高浓度的MG132对HL-60细胞有直接杀灭作用,MG132诱导HL-60细胞表达共刺激分子CD86后,对健康人单个核细胞起增殖作用。结论MG132诱导HL-60细胞表达共刺激分子CD86,促进对健康人单个核细胞的增殖作用。     

塞来昔布对K562白血病细胞的细胞毒作用及与伊马替尼的协同效应

目的 研究塞来昔布（Celecoxib）对K562细胞增殖、早期凋亡的影响及Rb蛋白质（PRb）、P27^Kip蛋白质表达变化,观察Celecoxib和伊马替尼联用对K562细胞增殖抑制和凋亡诱导是否具有协同效应.方法将K562细胞用不同浓度的Celecoxib（0、10、20、40、80及160μmol/L）作用36 h,四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）测定细胞活力;磷脂结合蛋白Ⅴ分析检测K562细胞早期凋亡;Western印迹检测不同浓度Celecoxib对K562细胞PRb和P27^Kip蛋白质表达的影响;用40 μmol/L Celecoxib、0.2μmol/L伊马替尼分别或联合作用K562细胞,观察药物对细胞活力和凋亡诱导是否具有协同作用.结果Celecoxib能明显抑制细胞活力,并呈药物剂量依赖性：随着Celecoxib浓度增高,K562细胞凋亡百分率相应增高,在160μmol/L浓度,凋亡率达25.92%,蛋白质印迹结果显示,Celecoxib可使K562细胞PRb蛋白质表达呈浓度依赖性下调;P27^Kip蛋白质呈浓度依赖性上调.Celecoxib与伊马替尼联用,抑制K562细胞活力为对照组的27.68%.结论Celecoxib能以浓度依赖性方式抑制K562细胞增殖,诱导细胞凋亡;其抗增殖效应可能与PRb表达下调及P27^Kip表达上调有关.Celecoxib与伊马替尼联用,在抗白血病细胞增殖作用上具有显著的协同效应.     

Upregulation and activation of caspase-3 or caspase-8 and elevation of intracellular free calcium mediated apoptosis of indomethacin-induced K562 cells

Background A nonsteroidal anti-inflammatory drug, indomethacin, has been shown to have antileukemic activity and induce leukemic cell opoptosis. This study was to elucidate the mechanism of indomethacin-induced K562 cell apoptosis. Methods K562 cells were grown in RPMI 1640 medium and treated with different doses of indomethacin (0μmol/L, 100μmol/L, 200 μmol/L, 400μmol/L, 800μmol/L) for 72 hours. The cells were harvested, and cell viability or apoptosis was analyzed using MTT assay and AO/EB stain, combining laser scanning confocal microscopy (LSCM) technique separately. For the localization and distribution of intracellular caspase-3 or caspase-8 protein, immunofluorescence assay was carried out. To reveal the activation of caspase-3 or caspase-8 in indomethacin-treated cells, Western blot detection was used. The change in intracellular free calcium was determined by Fluo-3/ Am probe labeling combined with LSCM. Results Indomethacin could lead to K562 cell apoptosis and inhibit cell viability in a concentration-dependent manner. An increased expression of intracellular caspase-3 or caspase-8 was observed at higher doses of indomethacin (400-800μmol/L). Western blot results showed upregrulation and activation in both caspase-3 and caspase-8 protein. Under indomethacin intervention, the levels of intracellular free calcium showed a significant increase. Blocking the activity of cyclooxygenase did not abolish the effects of indomethacin on K562 cell apoptosis. Conclusions Activation and upregulation of caspase-3 or caspase-8 protein were responsible for Indomethacin-induced K562 cell apoptosis. Variation of intracellular free calcium might switch on the apoptotic pathway and the proapoptotic effect of indomethacin might be cyclooxygenase-independent.     

甲基莲心碱在K562/A02细胞对STI 571敏感性中的作用

目的:研究甲基莲心碱(Nef)在多药耐药白血病细胞K562/A02对STI 571敏感性中的作用，并探讨其逆转耐药的机制。方法:MTT法比较STI 571单独或与Nef联合应用对K562/A02细胞的抑制作用；RT-PCR法检测mdr1 mRNA转录水平及Western Blot法检测P-gp表达水平。结果:Nef与STI 571联合应用对K562/A02细胞增殖的抑制作用明显增强。单独应用STI 571对K562/A02细胞的IC50为3.02μmol/L，加Nef后,IC50为0.689μmol/L，逆转倍数为4.38倍(P＜0.05）。STI 571与Nef联合应用使mdr1 mRNA转录水平下调(45.4±2.5)%(P＜0.01)，使P-gp的表达下调40.58%(P＜0.05)。结论:甲基莲心碱能增强K562/A02细胞对STI 571的敏感性，下调其mdr1 mRNA的转录和阻断P-gp的表达，从而逆转白血病的多药耐药性。     

Puerarin逆转K562/AO2耐药的分子机制

目的:研究黄酮类化合物puerarin对K562/A02(人红白血病多药耐药细胞系)细胞耐药逆转作用的分子机制.方法:免疫荧光染色方法检测阿霉素(ADR)和puerarin对K562(人红白血病细胞系)和K562/A02两种细胞NF-кB活性的影响;免疫细胞化学染色方法检测ADR和puerarin对K562和K562/A02的survivin表达的影响;流式细胞仪检测ADR和puerarin对K562和K562/A02的P-gP表达的影响.结果:经ADR处理后的K562细胞和K562/A02细胞NF-кB的活性明显高于K562细胞空白对照组;经puerarin预处理后再加ADR处理的K562细胞中的NF-кB的活性明显低于只用ADR处理的K562细胞.经puerarin干预后的K562/A02细胞的NF-кB的活性明显低于未经puerarin干预的K562/A02细胞;经ADR处理后的K562细胞和K562/A02细胞的p-gP,survivin表达明显高于K562细胞空白对照组;经puerarin预处理后再加ADR处理的K562细胞中的p-gp,survivin表达明显低于未经pu-erarin预处理的K562细胞;经puerarin干预后的K562/A02细胞的p-gp,survivin表达明显低于未经puer-arin干预的K562/A02细胞.p-gp和survivin表达呈正相关.结论:NF-кB的活化使p-gp和survivin表达增多可能是K562细胞多药耐药形成的机制之一.Puerarin能预防和阻止K562细胞耐药形成,并能逆转K562/A02对ADR的耐药,其机制与抑制NF-кB活性及survivin和p-gp的表达有关.     

千层纸素诱导人慢性粒细胞白血病K562的凋亡作用

探讨千层纸素对人慢性粒细胞白血病细胞K562的凋亡诱导作用及其可能机制。采用MTT法检测细胞存活率;电镜下观察细胞超微结构的改变;DAPI染色观察细胞凋亡;流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western blot法分析凋亡相关蛋白caspase 9、survivin及ERK1/2的表达变化情况。结果表明千层纸素呈浓度依赖地抑制K562细胞的增殖作用,诱导K562细胞发生凋亡,上调 K562细胞中cleaved-caspase 9蛋白,下调survivin、pro-caspase 9及p-ERK1/2蛋白的表达水平。千层纸素可诱导K562凋亡,这可能与下调survivin蛋白表达,激活caspase 9蛋白,抑制ERK信号通路有关。     

汉防己甲素对白血病耐药细胞株K562/A02核因子κB表达的影响

目的：通过研究汉防己甲素（tetrandrine，Tet）对白血病细胞株K562及其耐药细胞株K562／A02核因子kB（nuclear factor-kaPPaB，NF-kB）表达的影响，探讨Tet逆转多药耐药的作用机制。方法：采用免疫细胞化学及蛋白印迹法分别检测1umol／L Tet作用K562和K562／A02细胞6h和12h舌，细胞NF-kB核转位水平和胞核NF—kB蛋白表达的变化。结果：Tet作用6h和12h后，对K562细胞的NF-kB核转位水平及胞核NF—kB蛋白表达均无明显影响（P〉0．05）；K562／A02细胞NF—kB核转位水平及胞核NF—kB蛋白表达明显高于K562细胞对照组（P〈0．01）；Tet作用6h和12h后，可明显降低K562／A02细胞NF-kB蛋白核转位（P〈0．05）和胞核NF—kB蛋白表达水平（P〈0．01）。作用12h较作用6h效果更显著（P〈0．05）。结论：1umol／L Tet可能通过抑制NF—kB活化逆转K562／A02细胞多药耐药性。     

微小RNA-132对白血病K562细胞增殖及凋亡的影响

目的 研究miRNA-132对白血病细胞株K562增殖、凋亡的影响,探讨其可能的作用机制。方法 应用LipofectamineTM 2000转染K562细胞,实时荧光定量PCR检测转染后miRNA-132的表达。CCK-8及流式细胞术检测转染后对K562细胞增殖及凋亡的影响。Western Blot法分别检测SRIT1及P53的表达量变化。结果 miRNA-132在正常细胞中的表达明显低于在K562细胞株中的表达,与空白对照组和阴性对照组相比,转染组miRNA-132的表达量明显升高。转染miRNA-132 mimics后,K562细胞增殖能力减弱,凋亡率明显增加。与空白对照组和miRNA-132-NC组相比,miRNA-132高表达后,转染组的SIRT1蛋白表达量明显降低,P53蛋白表达量明显升高。结论 高表达的miRNA-132对白血病K562细胞有显著的增殖抑制和凋亡诱导作用,其机制可能与其增强SIRT1、P53的活性有关。