舌鳞癌角蛋白单抗的制备与鉴定

目的:以人舌鳞状细胞癌角蛋白组群为抗原,制备了抗舌鳞癌角蛋白单克隆抗体,并对单抗的特异性进行鉴定和免疫组织定位。方法:提取和纯化的舌鳞癌角蛋白免疫小鼠,建立了五株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。免疫组化方法对18例口腔鳞癌病例进行抗体的特异性鉴定。结果:共获得5株抗角蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为Lck1-5,免疫鉴定Lck1、Lck3、Lck4、Lck5都可在癌组织及癌转移淋巴结中部分表达,表达阳性细胞位于癌巢中的癌细胞胞浆中。其中以Lck4的特异性和敏感性最高。结论:成功进行了舌鳞癌角蛋白单克隆抗体的制备,其中Lck4敏感度、特异度最高。     

抗小鼠endolgin单克隆抗体杂交瘤的建立和初步应用

目的 建立能够分泌特异性抗小鼠endogun的单克隆抗体杂交瘤细胞系，为深入研究endoglin的新功能、诊断和治疗肿瘤血管生成提供物质基础。方法 利用小鼠endc，glin胞外段重组蛋白作为抗原免疫大鼠，通过细胞融合和杂交瘤筛选技术建立特异分泌抗小鼠endoglin单克隆抗体的杂交瘤系。利用酶联免疫吸附方法确定单克隆抗体亚型，免疫印迹方法明确筛选的单克隆抗体的特异性，免疫组化和免疫荧光初步判定获得的单克隆抗体是否可以应用于临床诊断。结果通过对90多个分泌抗体的融合细胞克隆的筛选，获得一株分泌特异性抗小鼠endoglin的单克隆抗体杂交瘤细胞系，分泌的单克隆抗体亚型为IgG1，轻链亚型为kappa。免疫印迹显示该研究获得的单克隆抗体可以特异识别小鼠endoglin重组蛋白，该单克隆抗体可以结合实体肿瘤组织微血管上的特异抗原并将微血管有效染色。结论本研究所获得的抗小鼠endglin单克隆抗体将有助于深入研究endoglin的新功能，为肿瘤血管生成的诊断和治疗提供了物质保障。     

肿瘤内皮细胞标志物8单抗的制备及组织分布

目的　制备特异性抗人肿瘤内皮细胞标志物 8(TEM8)单克隆抗体 ;检测TEM 8蛋白在部分肿瘤和正常组织中的分布。方法　原核表达含TEM 8膜外段多肽的融合蛋白 ,免疫Balb/c雌性小鼠后取效价较高的小鼠脾细胞与SP2 / 0骨髓瘤细胞进行细胞融合 ,以ELISA、Westernblot筛选、鉴定分泌特异性抗TEM8的单克隆杂交瘤细胞株 ;ABC免疫组织化学方法检测TEM 8蛋白表达产物在结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌旁组织等组织中表达。结果　共获得 5株稳定分泌TEM 8抗体的单克隆杂交瘤细胞株 ;TEM 8在多种组织细胞表达 :结肠癌新生血管 (4 / 2 3) ,结肠癌癌性腺上皮 (8/ 2 3) ,结肠癌旁组织腺上皮 (6 / 17) ,结肠组织平滑肌 (17/ 37) ,前列腺癌腺上皮 (1/ 17)。结论　成功制备抗人TEM 8单克隆抗体 ;TEM8在蛋白质水平并非肿瘤血管特异性标志物     

B7-H4 在前列腺癌中的表达及其临床意义

目的:研究共刺激分子B7-H4 在前列腺癌中的表达情况及其临床意义.方法:应用免疫组织化学染色,检测B7-H4 分子在前列腺癌中的表达情况,并评价其与临床病理特征的关系.结果:前列腺癌组织中B7-H4 在胞浆和(或)胞膜弥漫表达,表达量显著高于正常前列腺组织(P<0.05).B7-H4在临床肿瘤分级较高患者的前列腺癌组织中,表达显著强于临床肿瘤分级较低患者的前列腺癌组织.结论:B7-H4 在前列腺癌组织中表达上调,与患者肿瘤分级密切相关.异常表达的B7-H4 在肿瘤的发生、进展中起到一定作用,有望成为肿瘤新的诊断和预后判断指标,封闭肿瘤组织中的B7-H4 有可能成为肿瘤免疫治疗的新策略.     

结直肠癌组织中B7-H1和B7-H4表达与Foxp3+调节性T细胞浸润的关联性

目的：探讨B7-H1和B7-H4在结直肠癌（CRC）组织中的表达及其与肿瘤中Foxp3⁺调节性T细胞（Treg）浸润的关系,为判定CRC的生物学行为及预后提供依据。方法：免疫组织化学法检测56例CRC患者肿瘤标本及癌旁正常组织样本中B7-H1、B7-H4蛋白的表达和Treg的浸润情况,并与CRC患者的临床病理特征进行关联性分析。结果：CRC患者CRC组织中B7-H1阳性表达率高于癌旁正常组织（χ²=72.34,P<0.01）。不同浸润深度的CRC组织中B7-H1表达频数比较差异有统计学意义（P<0.01）;淋巴结转移阳性者CRC组织中B7-H1高表达频数高于淋巴结转移阴性者（P<0.01）;Duke's分期C+D者CRC组织中B7-H1高表达频数高于Duke's分期A+B者（P<0.01）。CRC组织中B7-H4阳性表达率高于癌旁正常组织（χ²=78.92,P<0.01）。不同浸润深度的CRC组织中B7-H4高表达频数比较差异有统计学意义（P<0.05）,淋巴结转移阳性者CRC组织中B7-H4高表达频数高于淋巴结转移阴性者（P<0.05）;肿瘤组织中Treg阳性细胞数明显高于癌旁正常组织（P<0.01）;分化程度不同CRC组织中Treg阳性细胞数比较差异有统计学意义（P<0.01）;淋巴结转移阳性者CRC组织中Treg阳性细胞数高于淋巴结转移阴性者（P<0.01）。Treg浸润与B7-H1的表达有相关性（P<0.01,Cramer's=0.463）,Treg浸润与B7-H4的表达有相关性（P<0.05,Cramer's=0.320）。结论：B7-H1和B7-H4在CRC组织中呈异常高表达,并与肿瘤中Treg浸润增加有关,可作为评估CRC预后的指标。     

抗重组人乳腺珠蛋白单克隆抗体的制备及其特异性鉴定

目的通过杂交瘤技术获得特异性抗hMAM单克隆抗体,为进一步研制基于hMAM的乳腺癌早期诊断试剂盒奠定基础。方法以纯化的重组蛋白为抗原免疫Balb/c小鼠,运用杂交瘤技术制备、间接ELISA法及免疫组化法筛选出能稳定分泌特异性抗hMAM的单克隆抗体细胞株。结果通过杂交瘤技术获得了2株能分泌特异性抗hMAM单克隆抗体的杂交瘤细胞株hMAM-A2及hMAM-B7,其分泌的单克隆抗体亚类均属于IgG1,Western blotting结果显示2株细胞分泌的单克隆抗体特异性强能与34kDa处的hMAM抗原形成单一的蛋白质显色条带,免疫组化结果显示其仅与乳腺癌组织呈阳性反应,与其他肿瘤组织不发生交叉反应。结论利用鼠-鼠杂交瘤技术成功的制备了2株稳定分泌高效价、高特异性抗hMAM的杂交瘤细胞株。     

人OX40单克隆抗体的制备、纯化及初步鉴定

目的 应用杂交瘤技术,制备鼠抗人OX40单克隆抗体.方法 以本室纯化的OX40胞外段融合蛋白免疫6～8周龄的雌性BalB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞阳性克隆.用杂交瘤细胞接种小鼠腹腔诱生腹水,腹水经饱和硫酸铵纯化沉淀后用间接ELISA法测定抗体的Ig类别.SDS-PAGE分析抗体的纯化程度,用免疫组化技术鉴定单克隆抗体与表达有OX40分子的组织及细胞特异性结合的情况.结果 获得1株能稳定分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞,细胞株诱生的小鼠腹水纯化后抗体纯度较高,Ig类别为IgG,蛋白浓度为6.129g/L.制备的单抗经淋巴细胞免疫组化及炎性淋巴组织免疫组化技术初步鉴定结果表明,该抗体与OX40单克隆抗体标准品制剂相比具有类同的特异性.结论 成功获得能稳定分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备的单克隆抗体具有较高的纯度和活性.     

抗人胰腺癌单克隆抗体SZ-121的制备和初步鉴定

目的探讨抗人胰腺癌单克隆抗体SZ-121的制备并对其进行初步鉴定。方法用人胰腺癌细胞株Patu8988作为免疫原,利用杂交瘤技术制备抗人胰腺癌单克隆抗体,应用流式细胞术和免疫组化鉴定抗体的特异性。结果成功获得一株能够稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞系SZ-121,该抗体与胰腺癌组织呈阳性反应,与胰腺良性病变组织呈弱阳性反应。结论单抗SZ-121对胰腺癌的早期诊断可能具有一定的潜在价值。     

重组人内抑素单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备抗重组人内抑素(ES)单克隆抗体(McAb)并进行鉴定。方法利用重组人ES为抗原,免疫Balb/c小鼠,应用杂交瘤技术将免疫小鼠的脾细胞与同源小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,间接ELISA法对细胞培养上清进行筛检,对能稳定分泌抗重组人ES的细胞株,进行扩大培养。体内诱生法制备腹水并对其初步鉴定。结果获得3B4、1D10、1G5、2D10,4株能稳定分泌抗重组人ESMcAb的杂交瘤细胞株,并对3B4和1D10两株给予鉴定,其免疫亚型为IgG2a、IgG3。腹水ELISA效价为10-6、10-5。通过蛋白免疫印迹法和免疫组化证明抗体有特异性和敏感性。结论成功制备分泌抗重组人ES的杂交瘤细胞株,为研究人ES的表达及相关领域奠定了基础。     

抗人hER单克隆抗体的制备及其应用

目的:制备抗人hER单克隆抗体。方法:用原核表达的人雌激素受体(hER)重组蛋白为抗原,免疫BalB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞,进行细胞融合。结果:通过ELISA和免疫组织化学法筛选,有限稀释克隆化,得到一株分泌抗hER单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2B8/1C5/2C3),经鉴定2B8/1C5/2C3分泌的单克隆抗体为IgG2a,利用Western Blot分析,显示在23kU处针对hER重组蛋白位置有一特异性条带;利用乳腺癌组织进行的免疫组织化学染色结果显示该株细胞产生的单克隆抗体与细胞核呈强阳性反应。结论:该单克隆抗体适于乳腺癌组织hER的免疫组化检测。     

Development of a novel monoclonal antibody to B7-H4: characterization and biological activity

Objective

B7-H4, a member of the B7 family of immunoregulatory receptors, may participate in the negative regulation of cell-mediated immunity. Aberrant B7-H4 expression is detected in some tumors and it plays a role in the occurrence and development of tumors. The aim of this study was to elucidate the functional and structural properties of B7-H4.

Methods

We developed a monoclonal antibody (mAb) against the extracellular domain of B7-H4 through immunization of Balb/c mice with 3T3-mB7-H4 cells which expressed extrinsic B7-H4. A stable hybridoma cell line was established. Then, we analysised the characterization of the mAb through Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), Immunoprecipitation (IP), western blotting, Immunohistochemical (IHC), and tested the biological activity of the mAb.

Results

ELISA, IP, and western blotting analyses indicated that the mAb specifically recognized B7-H4. In addition, flow cytometry demonstrated that the mAb exhibits excellent reactivity when applied to leukemic cells. IHC staining revealed that the mAb stained in a predominantly diffuse plasmalemmal or cytoplasmic pattern when applied to certain tumor tissues. The preliminary results of the mAb's biological activity showed that the mAb could effectively inhibit the function of B7-H4 in the inhibition of T cell, while promotingg the growth of T cells and the secretion of Interleukin-2 (lL-2), Interleukin-4 (IL-4), Interleukin10 (IL-10) and Interferon-γ (IFN-γ).

Conclusion

This mAb will be a valuable tool for the further investigation of B7-H4 function.

     

B7-H1与胰腺癌临床病理学特征和预后的关系

目的 检测B7-H1在胰腺癌中的表达情况,初步探讨其与胰腺癌临床病理因素及预后的关系。 方法 应用免疫组化法和Western-blotting检测46例胰腺癌组织和5例正常胰腺组织中B7-H1的表达情况,统计学分析B7-H1和胰腺癌临床病理学特征和预后之间的关系。 结果 免疫组化结果发现46例胰腺癌标本中,B7-H1阳性率为56.5%(26/46),而正常胰腺组织中,未发现B7-H1阳性显色。Western-blotting结果显示在胰腺癌组织中B7-H1蛋白呈高表达(0.512±0.125);正常胰腺组织仅微弱表达(0.122±0.027),P<0.05。结合分析患者临床资料发现,B7-H1的表达与淋巴结转移、TNM分期和病理分化程度相关(P<0.05),与患者年龄、性别、肿瘤部位和大小无关。Spearman相关性分析提示肿瘤组织中B7-H1表达与血清CA19-9表达有正相关性(r=0.63)。生存曲线结果显示B7-H1阴性组胰腺癌患者较阳性组生存期明显延长(P<0.05)。Cox回归多因素分析显示B7-H1的表达是影响胰腺癌患者预后的独立因素。 结论 人胰腺癌组织中存在B7-Hl高表达并与胰腺癌患者的预后相关,可能是胰腺癌病情评估和预后监测的独立指标。      

B7-H4、P53、CEA在胃癌中的表达及临床意义

目的探讨B7-H4、P53、CEA在胃癌中的表达特点及临床意义,寻找胃癌早期诊断的免疫学指标。方法用免疫组织化学方法测定B7-H4、P53、CEA在正常胃黏膜、癌前疾病、胃癌中的表达情况。结果 B7-H4在胃癌中高表达,其表达强度与浸润深度、淋巴结转移相关。生存期≤5年的患者B7-H4阳性表达率高于生存期〉5年的患者,差异有统计学意义（P〈0.05）。B7-H4、P53、CEA中两个或两个以上基因异常表达者与无基因或单基因异常表达者相比,在浸润深度、淋巴结转移、组织学分型及病理分期中显著相关。结论 B7-H4与胃癌的发生、发展及预后有着重要关系,联合检测B7-H4、P53、CEA能弥补单项基因检测的不足,有利于胃癌的早期诊断、生物学行为和预后的判断。     

B7-H3分子在非小细胞肺癌中表达的研究

目的研究T淋巴细胞共刺激分子B7家族成员B7-H3分子在非小细胞肺癌中的表达情况及其与各临床病理因素间的相关性。方法应用免疫组织化学染色法检测70例非小细胞肺癌患者肿瘤标本中B7-H3的表达情况,分析其与肿瘤类型、大小、淋巴结转移情况的关系。结果B7-H3可表达于肺癌细胞的胞膜、胞浆内或二者均有表达。鳞癌和腺癌患者B7-H3阳性表达率间差别无统计学意义(P>0.05);发生淋巴结转移和未发生淋巴结转移者B7-H3的阳性表达率间差别有统计学意义(P=0.046)。结论B7-H3的表达可能与非小细胞肺癌的转移和进展相关。     

上皮性卵巢癌患者血清B7-H4蛋白水平的测定及其临床意义

2005年7月至2009年11月检测本院62例上皮性卵巢癌患者、20例卵巢良性疾病患者及30例健康者血清B7-H4蛋白水平,探讨其在上皮性卵巢癌中的临床意义。结果示,上皮性卵巢癌患者[0．72（0．32,1．88）μg/L]与卵巢良性疾病患者[（0．45±0．21）μg/L]及健康者[（0．38±0．19）μg/L]血清B7-H4蛋白水平比较差异有统计学意义（均P〈0．01）;血清B7-H4蛋白水平与上皮性卵巢癌患者是否绝经、有无腹水无关（均P〉0．05）,而与肿瘤的国际妇产科联盟（FIGO）分期、有无淋巴结转移、分化程度以及组织学类型有关（均P〈0．01）;根据受试者工作特征曲线血清B7-H4蛋白诊断上皮性卵巢癌的敏感度为69％（43／62）、特异性为86％（43／50）。提示B7-H4蛋白是上皮性卵巢癌较好的肿瘤标志物。     

B7-H4在肝内胆管癌的表达及临床意义

  目的  探讨协同共刺激分子B7-H4在肝内胆管癌组织中的表达及其临床意义。  方法  采用免疫组化检测90例肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）及其癌旁组织中B7-H4的表达，并分析B7-H4表达与患者临床病理特征及预后关系。  结果  在肝内胆管癌中B7-H4表达率为44.4%，明显高于癌旁组织，且肝内胆管癌中B7-H4表达上升与TNM分期、肿瘤的分化、淋巴结转移及不良预后相关（P < 0.05）。生存分析提示B7-H4高表达组患者术后总生存率明显低于B7-H4低表达组（P = 0.005）。Cox比例风险回归模型分析表明B7-H4是肝内胆管癌患者的独立预后因子。  结论  B7-H4在肝内胆管癌组织中表达增加，且B7-H4高表达与ICC患者恶性病理特征及不良预后密切相关，对预估患者预后有一定临床指导意义。     

B7-H4蛋白在卵巢上皮性肿瘤组织中的表达及其临床意义

目的：研究B7-H4蛋白在卵巢上皮性肿瘤组织中的表达,探讨其与卵巢上皮性肿瘤临床病理学特征的关系及与CA125表达的相关性。方法： 采用免疫组织化学法检测B7-H4 蛋白和CA125 在70例卵巢上皮性癌（卵巢浆液性囊腺癌41例、卵巢黏液性囊腺癌11例、卵巢子宫内膜样癌9例和卵巢透明细胞癌9例）、30例卵巢良性上皮性肿瘤及10例正常卵巢组织中的表达。结果：① B7-H4蛋白在卵巢上皮性癌组织中的阳性表达率（84.3%）显著高于卵巢良性上皮性肿瘤（23.3%,P<0.05）,在正常卵巢组织中呈阴性表达。② B7-H4蛋白在卵巢浆液性囊腺癌、卵巢子宫内膜样癌和卵巢透明细胞癌组织中的阳性表达率（100%、77.8%和88.9%）均显著高于卵巢黏液性囊腺癌（27.3%,P<0.01）。③ B7-H4蛋白在卵巢上皮性癌晚期组（Ⅲ和Ⅳ期）的阳性表达率（92.9%）显著高于卵巢上皮性癌早期组（Ⅰ和Ⅱ期）（71.4%,P<0.05)。④ B7-H4蛋白在卵巢上皮性癌低分化组（G3）的阳性表达率（100%）显著高于卵巢上皮性癌高、中分化组（G1和G2）（67.6%,P<0.01）。⑤除卵巢黏液性囊腺癌外,CA125在卵巢黏液性癌、卵巢子宫内膜样癌和卵巢透明细胞癌组织中的阳性表达率均显著低于B7-H4的阳性表达率,CA125与B7-H4表达率呈正相关关系（r=0.277,P<0.05）。结论：B7-H4蛋白在卵巢上皮性癌组织中的阳性表达与卵巢上皮性癌的病理类型、临床分期和病理分级相关,B7-H4可以作为诊断卵巢癌新的肿瘤标志物之一。     

负性分子B7-H4在乳腺癌组织中的表达及其临床意义

目的:探讨负性分子B7-H4在乳腺癌组织中的表达情况及其与临床病理参数之间的关系?方法:通过免疫组织化学技术分析68例乳腺癌组织和30例良性纤维瘤中B7-H4的表达情况,并结合临床资料统计分析B7-H4表达与乳腺癌患者临床特征之间的关系?结果:免疫组织化学结果显示,乳腺癌组织中B7-H4的阳性率为75%,明显高于纤维瘤组织(17%)(P < 0.05),并与雌激素受体(estrogen receptor,ER)表达呈负相关?与人类表皮生长因子2(human epidermal growth factor receptor2,HER-2)呈正相关,而在年龄?肿瘤大小?病理类型等其他变量之间不存在显著差异?结论:乳腺癌组织中B7-H4异常表达,与乳腺组织良性病变存在差异(P < 0.05),并与ER?HER-2的表达相关,提示B7-H4分子在乳腺癌的发生发展过程中起了重要作用?     

nm23-H1蛋白在食管癌组织中的表达及意义

目的：探讨肿瘤转移抑制基因（nm-23H1）蛋白在不同食管癌组织中表达及与临床的意义。方法：选取收治的60例食管癌患者,取患者手术标本包括食管癌组织、食管癌旁1cm粘膜（癌旁）、食管正常粘膜（切缘）及食管癌区域淋巴结,采用流式细胞仪检测不同组织标本中nm23-H1蛋白表达水平。结果：癌组织与癌旁组织、组织切缘之间nm23-H1蛋白表达比较,差异具有统计学意义（P〈0．05）;nm23-H1蛋白在癌组织与淋巴结表达比较,差异无统计学意义（P〉0．05）;在有、无淋巴结转移两组对应组织间,癌与癌、癌旁与癌旁、淋巴结与淋巴结比较,差异具有统计学意义（P〈0．05）;nm23-H1蛋白在切缘与切缘间表达比较,差异无统计学意义（P〉0．05）。nm23-H1蛋白表达与食管癌组织病理分期有关,呈逐级降低趋势（P〈0．05）。结论：nm23-H1蛋白检测可作为食管癌判断肿瘤淋巴结转移的重要指标,有助于对食管癌患者术后转移的判断。