人子宫内膜基质细胞及腺上皮细胞的分离纯化和体外培养

目的：建立人子宫正常内膜、内膜异位症在位及异位子宫内膜的基质及腺上皮细胞分离、培养的方法，为进一步研究子宫内膜异位症发生、发展的分子生物学机制提供一个理想的实验模型。方法：15例正常子宫内膜、15例在位子宫内膜及10例异位内膜经胶原酶消化、筛网过滤、差时贴壁等技术进行分离、纯化和体外培养，光镜观察，应用鼠抗人波形蛋白抗体、鼠抗人细胞角蛋白单克隆抗体免疫组化染色对间质及上皮细胞进行鉴定。结果：正常子宫内膜和子宫内膜异位症在位子宫内膜标本分离、培养均成功；5例异位内膜标本获得成功．基质细胞和腺上皮细胞纯度均可达95％以上，并均可传代。结论：采用酶解、筛网分离及贴壁能获得纯度较高的基质与腺上皮细胞。人子宫内膜细胞分离体外培养的成功，有助于研究子宫内膜异位症的发病机制．为临床实验提供重要的理论依据．     

一种新的子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞的分离纯化及培养方法的探讨

目的:建立一种简捷的分离纯化培养子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞的方法。方法:选择子宫全切育龄妇女的新鲜子宫内膜组织,经单酶消化、二次筛网过滤及贴壁纯化技术分离纯化培养人子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞,光镜及免疫细胞化学染色鉴定细胞纯度。结果:腺上皮细胞漩涡状生长,细胞呈蝌蚪形或类圆型,细胞角蛋白19免疫组化染色阳性,纯度可达92%。基质细胞呈平行状生长,细胞呈梭形或多角形。波形蛋白免疫组化染色阳性,纯度达95%以上。每例子宫肌瘤切除标本可获得(10～25)×106原代基质细胞和(4～6)×106原代腺上皮细胞。结论:该培养方法可获得高产量的纯化的子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞。     

人子宫内膜细胞纯化方法的研究

目的探讨一种人子宫内膜细胞体外分离培养的方法。方法将离体子宫内膜组织立即放入无菌瓶中,冲洗、剪碎,0.1%Ⅰ型胶原酶消化2h,100目和300目细胞筛分离上皮细胞和间质细胞,分别离心（前者700r/min,离心5min,后者1000r/min,离心10min）,应用含20%胎牛血清的DMEM培养基体外培养,并通过免疫细胞染色进行鉴定。结果胶原酶消化及细胞筛过筛后离心可以完全分离子宫内膜上皮细胞和间质细胞,并分别经角蛋白单抗和波形蛋白单抗组化染色为阳性。结论该方法简单,费用低廉,能达到完全分离子宫内膜细胞的目的。     

人子宫内膜细胞原代体外培养方法

目的改良人子宫内膜细胞原代体外培养方法的建立,并对其进行特征鉴定。方法将选择的子宫内膜组织机械法分离,复合酶消化,传代自然增殖法纯化细胞,进行单层培养。通过倒置显微镜观察其大体形态,HE染色观察其胞核情况,免疫细胞化学染色法对间质细胞(endometrial stromal cell,ESC)及上皮细胞(endometrial glandular epithelial cell,EEC)进行鉴定。结果培养的子宫内膜细胞均有ESC和EEC两种形态细胞。EEC和ESC经角蛋白单抗体和波形蛋白单抗体染色,凡是胞质被染成棕黄色的细胞为阳性细胞。结论成功培养了原代人子宫内膜细胞,方法经济、简单,获得细胞成活率高,生长稳定。成功建立子宫内膜细胞原代体外培养体系,为从细胞和分子水平方面研究子宫内膜的各种功能及干预调节奠定基础。     

人子宫内膜细胞的纯化和培养

目的：本研究旨在建立一套子宫内膜细胞体外培养和贮存传代的方法，为进一步对其进行抗原组分研究奠定基础。方法：用胶原酶消化和铜网过筛法分离子宫内膜基质细胞和上皮细胞，进行单层培养。结果：子宫内膜上皮细胞和基质细胞分别经角蛋白单抗和波形蛋白单抗组化染色为阳性，腺细胞可持续培养4～6周，传代2～3次。结论：子宫内膜腺体细胞培养方法的建立为减少外科来源的子宫内膜抗原建立了基础。     

子宫内膜基质干细胞培养方法的比较研究

目的通过贴壁纯化技术和磁珠分选法培养人子宫内膜基质干细胞,并对两种方法进行比较,寻求既能方便获得大量子宫内膜基质干细胞,又能减少其分化的理想分离培养方法。方法采用贴壁纯化和磁珠分选法分离培养子宫内膜基质细胞,通过倒置显微镜观察细胞的形态,免疫组化鉴定细胞的来源,流式检测CD146和CD90的表达鉴定基质干细胞。通过比较细胞的克隆形成率和CD146、CD90阳性率的差异,综合评估2种培养方法的优劣。结果倒置显微镜观察2种培养方法所得子宫内膜基质细胞均多呈梭形;波形蛋白免疫组化染色均呈阳性。流式细胞仪检测贴壁纯化培养的基质细胞中CD146、CD90阳性率为51.45%、47.24%;磁珠分选法培养体系为CD146、CD90阳性率为63.53%、77.48%。贴壁纯化和磁珠分选法培养的子宫内膜基质细胞克隆形成率分别为(1.25±0.18)%和(3.3±0.4)%。结论贴壁纯化和磁珠分选培养作为子宫内膜基质干细胞的2种培养方法,均可以获得未分化的干细胞。用磁珠分选培养干细胞的方法比较复杂,但可获得大量的干细胞。用贴壁纯化技术培养干细胞方法简单,但细胞不易贴壁,且数量较少,但也能有效分离出较纯的干细胞,保持较好的细胞活性。     

人子宫内膜腺上皮细胞及基质细胞分离方法的研究

目的 探索子宫内膜腺上皮细胞及基质细胞分离的新方法。方法 通过胶原酶阶梯消化(0．25％，0．15％，0．1％，0．08％)、不同目次的筛网过滤、重力沉降等技术得到高纯度的人子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞。结果 应用浓度逐渐降低的胶原酶消化子宫内膜组织，可提高细胞的存活率及细胞收集量。筛网过滤和重力沉降法，可提高子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞的纯度，腺上皮细胞可达90％，基质细胞可达96％以上。结论 采用此方法可得到大量高纯度的子宫内膜腺上皮细胞及基质细胞，为体外研究子宫内膜提供模型。     

人子宫内膜腺上皮细胞的体外分离培养及纯化

[目的]优化子宫内膜腺上皮细胞的分离培养及纯化技术,以获得经济、数量多、活性好、纯度高的子宫内膜腺上皮细胞,为子宫内膜异位症的研究提供可靠的体外模型。[方法]采用复合酶重复消化、80目筛网单次过滤、低速离心、差时贴壁法处理。[结果]经诊断性刮宫获取的19例标本中,18例腺上皮细胞培养成活,1例失败;腺上皮细胞纯度高达94.2%。[结论]复合酶多次消化、80目筛网单次过滤、低速离心、差时贴壁法培养子宫内膜腺上皮细胞,可以获得经济、数量多、活性好、纯度高的细胞。     

吗啡对体外培养人子宫内膜基质细胞ERmRNA表达的影响

目的　研究吗啡对体外培养的人子宫内膜基质细胞的雌激素受体信使核糖核酸 (ERmRNA)表达的影响。方法　体外分离培养人子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞 ,并通过免疫细胞化学的方法进行鉴定 ;将基质细胞给予 17 β雌二醇或吗啡及纳洛酮干预 ,通过RT PCR的方法半定量分析吗啡对基质细胞ERmRNA表达的影响。结果　雌激素上调基质细胞ERmRNA的表达 ,吗啡作用 2 4h ,呈剂量依赖性抑制基质细胞ERmRNA的表达 ,r =- 0 .94 6 (P <0 .0 5 )。结论　外源性阿片类药物吗啡抑制基质细胞雌激素受体mRNA的表达。     

人子宫内膜间质细胞的体外培养

目的：建立分离培养符合实验要求的人在位及异位子宫内膜间质细胞的方法,为进一步探讨子宫内膜异位症发生、发展的分子生物学机制提供一个理想的实验模型。方法：胶原酶消化在位和异位内膜组织,进行原代培养,胰蛋白酶消化法传代培养,光镜、免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。结果：角蛋白、波形蛋白染色证实细胞纯度达95%以上。 结论：胶原酶消化法简便易行,可获得符合实验要求的人子宫内膜间质细胞,可以用于子宫内膜异位症发病机制、药物筛选等研究。     

人子宫内膜细胞的分离培养及鉴定方法的探索

目的　体外分离并培养人子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞。方法　用酶解、二次滤网过滤、沉降等方法进行分离、纯化及培养 10例正常子宫内膜腺上皮细胞及基质细胞并传代 ,通过光镜进行形态学观察 ,用免疫细胞化学法进行细胞鉴定。结果　 9例标本获得成功 ,基质细胞纯度可达 95 %以上 ,腺上皮细胞的纯度约为 90 % ,分离出的子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞可以在体外进行增殖。结论　采用二次滤网过滤法可以分离得到纯度较高的内膜腺上皮细胞和基质细胞 ,这两种细胞均能在体外成活并传代。     

人子宫内膜异位症异位及在位内膜间质细胞分离与培养

目的：建立子宫内膜异位症（EMs）异位、在位内膜间质细胞的体外细胞模型,实时观察间质细胞形态变化。方法胶原酶消化异位、在位内膜组织,二次筛网过滤结合低速离心法分离纯化间质细胞,应用免疫细胞化学染色进行细胞鉴定,并进行传代培养,观察细胞生长状况及细胞形态差异。结果培养成功率91．3％,间质细胞纯度达95％;异位间质细胞9代内、在位及对照组间质细胞11代内,细胞形态及活性并无明显改变。结论子宫内膜间质细胞可为子宫内膜异位症研究提供较好的细胞模型。     

人在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的原代培养

目的:探讨在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养方法,为研究子宫内膜异位症的发病机制提供体外细胞模型.方法:通过消化、过滤、沉降等方法,分离培养正常对照子宫内膜以及子宫内膜异位症在位、异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞,模拟人体内雌激素水平研究促进细胞生长的方法,光学显微镜观察离体细胞形态.结果:正常对照子宫内膜细胞分离培养成功率达91.7%(11/12),子宫内膜异位症在位子宫内膜细胞成功率为93.8%(15/16),子宫内膜异位症异位子宫内膜细胞成功率为75.0%(12/16).间质细胞传代2次后,生长缓慢,经雌激素作用后,生长明显改善;腺上皮细胞不能传代,经雌激素作用后,生长改善不明显.结论:体外分离培养的人子宫内膜细胞比子宫内膜异位动物模型更接近于人体的特点,在位和异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养可作为研究子宫内膜异位症的体外细胞模型之一.     

小鼠子宫内膜上皮细胞的分离和原代培养

目的 建立一种高效的子宫内膜上皮细胞分离和体外培养方法,为子宫疾病的发病机制或治疗药物筛选的进一步研究提供一个比较理想和有价值的的实验模型.方法 用酶消化、过滤、离心与差速贴壁纯化相结合的方法分离培养小鼠子宫内膜上皮细胞,以上皮细胞角蛋白为抗原的免疫荧光法对分离培养的细胞进行纯度鉴定.结果 小鼠子宫内膜上皮细胞培养4～...     

人主动脉瓣间质细胞原代培养及体外钙化模型的建立

目的原代培养人主动脉瓣间质细胞并建立体外瓣膜细胞钙化模型,诱导人主动脉瓣间质细胞向成骨细胞分化,并观察其表型变化。方法采用胶原酶两次消化法原代培养人主动脉瓣间质细胞,取传代3～7代间质细胞,随机分为2组,实验组以钙化诱导培养基培养,对照组以标准培养基培养。1周后,行von Kossa染色观察钙化结节形成情况,分光光度计测定碱性磷酸酶活性,免疫荧光染色检测瓣膜间质细胞表型蛋白,real-time PCR及蛋白质印迹分析检测成骨相关因子的表达,评价模型建立情况。结果培养1周后实验组出现钙化结节,每孔钙化结节数量[(51.20±14.31)个]高于对照组[(3.60±1.82)个],差异有统计学意义(P<0.05),同时实验组碱性磷酸酶活性较对照组升高(约上升4倍,P<0.05),细胞收缩表型平滑肌肌动蛋白(α-SMA)增高。Real-time PCR及蛋白质印迹分析提示,实验组中成骨相关因子Runx2、osteocalcin及osteopontin在mRNA及蛋白水平均较对照组升高,磷酸化Smad1/5/8蛋白表达也同时升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功建立了人主动脉瓣间质细胞体外诱导钙化模型,诱导后间质细胞呈现相对激活状态,表型向收缩表型和成骨表型转化,为今后实验提供了可靠的细胞模型。