利用生物信息学方法预测HAb18G/CD147拮抗肽的性质和功能

目的：利用生物信息学方法对HAb18G／CD147拮抗肽(AP-1～9)进行理化性质的预测及相似性的比较，为拮抗肽的结构与功能研究提供预测和帮助．方法：应用ExPASy数据库分析短肽的Mr、等电点、疏水性等理化性质．利用Blastp，PDB_ISL和SCOP等数据库对HAb18G／CD147拮抗肽进行相似性比较．结果：经ExPASy数据库分析9条拮抗肽中有6条呈碱性，且大部分呈亲水性，半衰期由1．3～30．0h不等．Blastp分析AP-2与血管紧张素转化酶Ⅱ的活性中心部分序列相似．PDB_ISL分析AP-3，9与NADPH氧化酶部分序列相似．SCOP分析AP-2与Ras结合蛋白(RBD)，CAD结构域及金属蛋白酶催化结构域相似；AP-7与环亲和素及微管蛋白C-末端结构域相似．结论：生物信息学对蛋白质结构功能的研究及基于结构的药物设计等方面提供了重要的线索．     

不同免疫方案制备鼠抗PBP2a多克隆抗体的比较

目的制备针对青霉素结合蛋白（PBP2a）的抗血清,比较不同免疫方案的免疫效果。方法以基因工程重组PBP2a转肽酶区蛋白作为免疫原,采用多种注射途径（足垫、腹腔、足垫＋腹腔、足垫＋皮下）免疫BALB／C小鼠,ELISA和Western-blot法检测所制备的抗血清效价和特异性。结果足垫快速免疫组、腹腔免疫组、足垫和腹腔免疫组、足垫加皮下免疫组的效价依次为1：12800、1：25600、1：51200、1：102400。Western-blot显示所制备的抗血清能有效识别原核表达及耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）临床分离株中的PBP2a。结论重组PBP2a蛋白免疫BALB／c小鼠能有效刺激特异性抗体的产生,足垫加皮下多点免疫法是一种值得推崇的免疫方案。     

不同免疫方案制备肠道病毒71型抗血清的免疫效果比较

目的比较不同免疫方案制备肠道病毒71型(EV71)抗血清的免疫效果,选择最佳免疫方案。方法制备EV71,并对病毒进行滴定和灭活。将BALB/c鼠随机分为5组,每组9只。1、2组以灭活病毒免疫,3、4组以活病毒免疫,1、3组的免疫间隔时间为2周,2、4组为3周,第5组为对照组,用磷酸盐缓冲液(PBS)免疫,免疫间隔2周。免疫4次后用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组小鼠血清抗体滴度。结果 4个实验组均产生阳性抗体(A/A0≥2.1),对照组抗体阴性(A/A0<2.1),1～5组吸光度值依次为1.081 7±0.289 7、1.029 6±0.3719、1.074 8±0.374 9、1.492 9±0.215 9、0.168 7±0.021 8。对其进行单因素方差分析,F=23.449,P<0.05,差异有统计学意义,LSD-t检验结果,第4组与1、2、3组差异均有统计学意义(P<0.05),而1、2、3组两两比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论各组抗体滴度不完全相同,其中第4组即活病毒间隔3周免疫组抗体滴度最高,所以活病毒间隔3周免疫方案可作为制得高滴度EV71抗血清的理想选择。     

稳定表达肝癌相关抗原HAb18G/CD147成纤维细胞株的建立及其意义

目的:探讨将HAb18G全长cDNA转染成纤维细胞NIH/3T3的可行性及其意义.方法:将含有肝癌相关抗原HAb18G全长cDNA的真核表达载体pcDNA3.0/HAb18G利用脂质体介导法转染小鼠成纤维细胞NIH/3T3,G418筛选建立稳定表达阳性克隆细胞株t3T3;利用流式细胞仪、间接免疫荧光染色方法鉴定目的蛋白转染情况;RT-PCR琼脂糖电泳、明胶酶谱分别从mRNA和蛋白水平检测转染前后HAb18G刺激3T3细胞分泌基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)的情况.结果:利用脂质体介导法将HAb18G全长cDNA转染入成纤维细胞NIH/3T3,G418筛选,流式细胞仪分析、间接免疫荧光染色证实成功建立了稳定表达HAb18G的阳性克隆株;RT-PCR琼脂糖电泳证实t3T3细胞MMP-2、MMP-9 mRNA转录水平较未转染前增多;明胶酶谱表明t3T3分泌MMPs能力较未转染前增强.结论:HAb18G全长cDNA可以稳定转染成纤维细胞,并能从核酸和蛋白水平诱导基质金属蛋白酶高表达,具有其独特的生物学意义.     

CD147/HAb18G单克隆抗体对人脑胶质瘤细胞乳酸转运及细胞生长的影响

目的研究CD147/HAb18G基因工程单克隆抗体对体外培养U251细胞单羧酸转运蛋白-1(monoc arboxylatetransporter-1,MCT1)表达分布和糖酵解乳酸代谢的影响。方法体外培养U251细胞分为对照组、低剂量组和高剂量组,分别加入不同剂量的CD147/HAb18G单抗封闭细胞表面CD147分子。免疫荧光法检测各组细胞膜上MCT1表达分布改变,分光光度计检测各组细胞内乳酸含量,分别绘制生长曲线并记录生长数据。结果低剂量组和高剂量组MCT表达分布改变,相比对照组其胞膜有效表达减少[随机计数500个细胞中胞膜完整表达细胞数:对照组(367.34±6.92),低剂量组(161.92±7.33),高剂量组(54.58±4.80),P<0.01],胞质无效表达增多[胞质表达细胞数:对照组(12.08±3.03),低剂量组(70.83±4.71),高剂量组(264.58±6.14),P<0.01];细胞内乳酸浓度在低、高剂量组明显增高[对照组(0.222±0.020)mmol/L,低剂量组(0.418±0.015)mmol/L,高剂量组(0.713±0.018)mmol/L,P<0.01],生长...     

不同免疫方法制备抗血清的效果比较

目的：比较不同免疫方法制备抗血清的以选取最佳免疫程序,方法以葡糖－Ｃ３复合物和重组葡激酶分别作为颗粒性和可溶性抗原,采用多种途径对２０只家兔进行免疫,并采用琼脂免疫扩散法测定抗血清的滴度。结果：多点肌肉、淋巴结和皮内注射所获抗血清的平均几何滴度分别为１：２２．６、１：１１．３和１：８。结论多点肌肉注射是一个好的免疫程序。     

人CD96基因胞外区的原核表达及抗血清制备

摘要：目的原核表达并纯化人CD96胞外区蛋白,免疫家兔制备抗体。方法构建pET32-CD96重组质粒,转化大肠埃希
菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,Ni2+-NTA树脂纯化蛋白并免疫家兔,以间接ELISA检测抗体效价,Western blot鉴定抗
体特异性。结果质粒pET32-CD96经测序鉴定,通过SDS电泳显示能在BL21(DE3)中高效表达,相对分子质量约37 000;
Western blot实验结果显示制备的多克隆抗体可与HL-60细胞提取蛋白及原核表达的人CD96蛋白胞外区特异性结合。
结论成功构建并表达人CD96胞外区蛋白,免疫家兔获得高滴度抗血清,为后续研究奠定了基础。     

不同免疫程序制备伤寒抗血清的效价比较

目的 比较两种免疫程序制备伤寒杆菌抗血清的效价,寻求获取符合实验教学需要的高效价伤寒抗血清的较佳方法.方法 采用2天短期间隔的免疫程序和常规2周间隔的免疫程序,分别以伤寒沙门菌O、H菌液免疫家兔,用试管凝集法检测并比较其血清抗体效价.结果 免疫后获取的伤寒沙门菌O抗原和H抗原抗血清的几何平均滴度(GMT),2天间隔免疫程序分别为1∶22807和1∶25600,2周间隔免疫程序分别为1∶2691和1∶5702.结论 2天短间隔免疫程序所制备的伤寒杆菌抗血清效价较高,不失为获取实验教学用抗血清的较佳免疫程序.     

不同免疫程序制备兔抗牛血清白蛋白抗血清的效价比较

目的比较两种免疫程序制备牛血清白蛋白（BSA）抗血清的效价,以获取能满足实验教学需要的高效价可溶性抗血清。方法采用2天短期间隔免疫程序和1周间隔免疫程序,以牛血清白蛋白（BSA）免疫家兔,对流免疫电泳和双向琼脂扩散试验检测并比较其血清抗体效价。结果BSA浓度在5mg／mL时,双向琼脂扩散试验和对流免疫电泳测得的2天间隔免疫程序所制备的BSA抗血清几何平均滴度（GMT）分别为1：6．50和1：4．2,1周间隔免疫程序的BSA抗血清GMT分别为1：10．56和1：8．00。结论1周间隔免疫程序所制备的牛BSA抗血清效价高于2天短周期间隔的免疫程序所制备抗血清效价,BSA短周期免疫家兔可获取符合教学实验要求的抗血清效价。     

不同免疫途径制备伤寒抗血清效价的比较

目的筛选制备高效价伤寒抗血清的方法。方法分别通过腹腔、耳静脉、腹腔 耳静脉途径，用伤寒“O”、“H”，菌液免疫家兔，用试管凝集法检测并比较其效价。结果腹腔免疫组、耳静脉免疫组、腹腔 耳静脉免疫组抗血清几何平均滴度分别为：“O”1：640、1：16060、1：1280；“H”1：1810、1：25600、1：2560。结论伤寒“O”、“H”菌液通过耳静脉途径免疫，抗血清的效价优于其他两种方法。     

泡球蚴Em18多克隆抗血清的制备和鉴定

目的：制备和鉴定泡球蚴Em18抗原的多克隆抗血清.方法： 利用大肠杆菌BL21（DE3）表达重组质粒pET41a-Em18,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导、表达和纯化rEm18-GST蛋白,免疫BALB/c小鼠,制备鼠源抗Em18多克隆抗体,采用ELISA和Western blot法鉴定其特异性.结果： （1）SDS-PAGE检测表明,rEm18-GST蛋白得到成功表达,在相对分子量为50 kDa处有表达条带.（2）纯化后获得高纯度的rEm18-GST蛋白.（3）ELISA结果表明,抗Em18抗血清的抗体滴度为1∶25 600;Western blot结果表明抗Em18抗血清能与rEm18-GST蛋白发生特异性结合.结论： 获得了特异性识别rEm18-GST蛋白的多克隆抗体,为进一步筛选Em18模拟抗原表位奠定基础.     

肝癌相关抗原HAb18G胞外区片段的原核表达与免疫学活性分析

目的：利用大肠杆菌高效表达肝癌相关抗原HAb18G胞外区片段，并分析其与相应抗体的结合活性，进而明确表达产物用于筛选基因工程抗体的可行性．方法：用PCR技术扩增出HAb18G胞外区基因片段，克隆入原核表达载体pGEX-4T-3中，筛选及鉴定阳性重组子，IPTGv诱导表达后对表达产物进行纯化及复性等处理，同时利用SDS-PAGE，Western-Blot以及ELISA等方法检测蛋白表达情况及其免疫学特性。结果：成功构建了肝癌相关抗原HAb18G胞外区片段的原核表达载体pGEX-4T-3／HAb18GE，并在大肠杆菌中成功实现高效融合表达，表达蛋白Mr46000，表达量约占菌体总蛋白量的43％，表达产物主要以包涵体形式为主。另外，表达蛋白在变性和非变性的条件下均可以与HAb18G mAb特异性结合。结论：原核融合表达的HAb18G胞外区片段可以替代天然的HAb18G蛋白，以用做抗原来筛选新型的基因工程抗体。     

HAb18G／CD147在激活的人脐静脉内皮细胞表达上调促进肿瘤血管生成

以前的研究证实HAb18G/CD147分子是一个在多种恶性肿瘤细胞表面高表达的质膜糖蛋白,与肿瘤的恶变显著相关。但该分子在内皮细胞的作甩尚未被揭示。本研究发现,HAh18G／CD147在激活的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）表达显著增强。     

麻疹抗血清不同制备方法的比较

目的:比较评价两种麻疹抗血清制备的方法,找到一种操作简便,效果理想,同时又能制备出高效价麻疹抗血清的方法。方法:将6只家兔随机分成两组,分别用腹腔免疫法和颈部免疫法进行免疫,制备麻疹抗血清。结果:腹腔免疫法制备的抗血清效价最高为1:2560,颈部免疫法制备的抗血清效价最高为1:1280。结论:腹腔免疫法操作简单,免疫次数少,免疫效果好,可以制备出高效价的麻疹抗血清。     

肝癌相关抗原HAb18G反义RNA表达质粒的构建及克隆鉴定

目的 构建HAb18G反义RNA表达质粒载体。方法 用DNA重组技术将人HAb18G基因反向克隆到真核表达质粒PCI－neo中，构建成HAb18G反义RNA表达质粒PCI－asHAb18G。用阳离子脂质体介导转染人肝癌细胞系HHCC，经G418筛选后获得的克隆进行鉴定。结果 HAb18G反义RNA表达质粒载体PCI－asHAb18G经限制性酶切及部分序列分析证明基因插入正确。流式细胞仪及免疫组化SP法染色均证实：转染细胞HHCC／asHAb18G中HAb18G表达为阴性，而转染空载体的HHCC／neu及HHCC均为强阳性。结论 成功构建了HAb18G反义RNA表达质粒载体PCI－asHAb18G。为进一步研究HAb18G蛋白分子的生物学功能及肝癌的基因治疗研究奠定了基础。     

多疣壁虎SPARCL1多克隆抗血清的制备及鉴定

目的：制备针对多疣壁虎SPARCL1的多克隆抗体,为深入研究SPARCL1基因功能奠定基础。方法：构建pGEX-4T1-SPARCL1质粒,在大肠杆菌BL21表达GST-SPARCL1蛋白,经亲和层析纯化后免疫新西兰大白兔,获得SPARCL1抗血清,经酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测SPARCL1抗血清的效价,Western blot和免疫组化法检测多克隆抗体特异性。结果：成功构建多疣壁虎SPARCL1基因的原核表达质粒pGEX-4T1-SPARCL1,诱导得到较高纯度的GST-SPARCL1融合蛋白,免疫兔获得SPARCL1抗血清,经Western-blot及免疫组织化学实验显示所得抗体具有较高的效价及特异性。结论：成功获得较高效价特异性强的SPARCL1抗血清,为进一步深入研究多疣壁虎SPARCL1功能提供抗体工具。     

HAb18G／CD147胞外近膜区与integrinβ1亚基MIDAS位点结合调节肝癌细胞恶性表型

肝癌相关抗原HAb18G／CD147分子与整合素integrin α3β1、integrin α6β1之间存在着相互作用,但其作用机制还未得到阐明。     

山羊IL-2基因的克隆、表达及其多克隆抗血清的制备

应用RT-PCR方法从山羊外周血淋巴细胞中克隆了山羊白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）基因并测序，将编码山羊白细胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）成熟蛋白的基因亚克隆至原核表达载体pET30a（＋）上，构建重组质粒并进行确证性测定。然后将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）并用IPTG于37℃诱导培养。表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在。SDS-PAGE分析显示，表达的山羊IL-2融合蛋白分子量约为18kD。包涵体被6mol/L盐酸胍裂解后，通过ProBondTM蛋白纯化试剂盒纯化。用所获得的重组山羊IL-2纯化产物经3次肌内注射新西兰白兔，制备了兔抗山羊IL-2多克隆血清，并用Western blot进行了证明。本次试验成功地表达、纯化了山羊IL-2融合蛋白，并制备了抗山羊IL-2多克隆抗血清，为下一阶段关于山羊IL-2重组蛋白生物学特性及其应用的研究打下了坚实的基础。     

多克隆抗AGE抗体的制备

晚期糖化终产物（ＡＧＥ）在糖尿病慢性并发症（ＤＣＣ）、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病、透析综合征［１］的发病机制中起很重要作用,所以ＡＧＥ的检测在科研与临床上有着重要的意义。根据ＡＧＥ的荧光特性（入射波长３７０ｎｍ,发射波长４４０ｎｍ）,可用荧光法检测ＡＧＥ。但是对于ＡＧＥ的组织定位［２］,大分子如血红蛋白的ＡＧＥ测定［３］,荧光法却无法进行;并且荧光法对交联后的ＡＧＥ的定量不准［４］。本研究的目的是试图制备亲和层析纯化的抗ＡＧＥ抗体,并参照Ｍａｋｉｔａ等［１］的方法建立一种快速、灵敏、准确的ＡＧＥ竞争性…