骨髓基质干细胞复合纳米羟基磷灰石/聚乳酸构建组织工程骨

目的：了解骨髓基质干细胞（MSCs）复合纳米羟基磷灰石／聚乳酸（n-HA／PLA）构建组织工程骨的异位成骨作用。方法：选择6只新西兰白兔，实验组于动物脊柱左侧肌肉内植入MSCs复合n-HA／PLA构建的组织工程骨，对照组于右侧植入n-HA／PLA生物材料。术后4、8周取材，行溴脱氧尿嘧啶（Brdu）标记细胞检测和组织学观察。结果：术后4周，实验组材料边缘均可检测到Brdu标记的MSCs。术后4、8周，实验组材料内部有新骨形成，随着时间推移，新骨量增多，编织骨向板层骨过渡。对照组材料未见新骨形成。结论：MSCs复合n-HA／PLA构建的组织工程骨具有很好的异位成骨作用。     

骨髓基质干细胞复合纳米羟基磷灰石/聚乳酸修复节段性骨缺损

目的了解骨髓基质干细胞(MSCs)复合纳米羟基磷灰石/聚乳酸(n-HA/PLA)构建的组织工程骨修复节段性骨缺损的可行性。方法选择30只新西兰白兔,制作15mm长的双侧桡骨节段性骨缺损模型,实验根据植入不同材料分为A、B组,A组分为A1组和A2组,A1组于动物左侧桡骨缺损区植入组织工程骨,A2组于右侧植入单纯材料。B组分为B1组和B2组,B1组于动物左侧桡骨缺损区植入自体髂骨,B2组右侧为空白对照。术后4、8、16周取材,行X线检查、组织学观察、计算机图像分析和生物力学测定。结果术后4、8、16周各组骨缺损区均有新骨生成,成骨量随着时间的推移而增加。经X线、组织学和生物力学评估,A1组与B1组比较未见差异(P>0·05),A1组或B1组分别与A2组或B2组比较,成骨能力依次为:A1或B1>A2>B2(P<0·001,P<0·05)。结论MSCs复合n-HA/PLA构建的组织工程骨可作为自体骨的替代材料修复节段性骨缺损。     

聚乳酸-聚羟基乙酸神经导管和骨髓间充质干细胞构建组织工程神经

[目的]用聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(poly lactide-co-glycolide acid,PLGA)为原料制备新型神经导管,同时对兔骨髓间充质干细胞与PLGA构建组织工程神经的可行性进行观察.[方法]以聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物和壳寡糖为原料,采用静电纺丝工艺制备中空的PLGA神经导管.通过扫描电镜观察材料的微观结构,排水法测定材料的孔隙率.将兔的骨髓间充质干细胞(BMSCs)分离培养后与导管共培养,扫描电镜观察细胞在材料上的生长粘附情况,MTT方法检测细胞在材料上的增殖活性.[结果]PLGA神经导管管壁具有疏松多孔结构,管壁纤维直径为18 μm左右,孔隙率为85.4%±1.6%,MTT结果显示导管无细胞毒性.兔骨髓间充质干细胞在导管表面生长良好.[结论]PLGA神经导管具有良好的孔隙率,生物相容性好,是构建组织工程神经的良好材料.     

利用人骨髓基质干细胞异位构建组织工程化骨的实验研究

目的 探讨以人骨髓基质干细胞为种子细胞、以部分脱钙骨为支架材料在体内构建组织工程化骨的可行性及其成骨机制。方法 培养、扩增人骨髓基质干细胞，将第4代hBMSCs接种于部分脱钙骨支架上，通过扫描电镜观察其生长和粘附情况，并测量粘附率。于裸鼠皮下植入人骨髓基质干细胞和部分脱钙骨复合物，以无细胞部分脱钙骨作对照。8及12周取材观察。结果 8及12周复合物植入组均见新骨形成，多数骨小梁表面衬有一层成骨细胞样细胞，提示可能存在膜内成骨。单纯部分脱钙骨植入组未见新骨形成。结论 人骨髓基质干细胞与部分脱钙骨复合可以在体内构建组织工程化骨；其成骨机制可能为膜内成骨。     

BMP-2基因转染的人骨髓基质干细胞复合PLA/PCL支架体外构建组织工程骨

目的　用人骨形态发生蛋白 2腺病毒表达载体 (Ad -BMP - 2 )转染的人骨髓基质干细胞 (hBMSC) ,复合PLA/PCL(聚乳酸 /聚己内酯 )生物降解支架体外构建组织工程骨。方法　用Ad -BMP - 2转染体外培养的成人BMSC ,免疫组化、原位杂交染色和蛋白印迹方法检测细胞BMP - 2的表达 ,并通过流式细胞仪和ALP活性检测分析其对细胞增殖、分化的影响。然后将转染后细胞接种到PLA/PCL支架上 ,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果　转染后 ,hBMP - 2基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达 ;S期细胞比例和ALP活性明显增高。扫描电镜见转染细胞分布均匀 ,伸展良好。结论　Ad-BMP - 2可高效转染hBMSC ,且促进细胞增殖及成骨转化。转染后细胞在PLA/PCL上生长良好 ,BMP - 2基因治疗的组织工程骨构建成功     

重组PcDNA3.1-hBMP-2转染骨髓基质干细胞及复合异种骨支架体外构建组织工程骨

目的：构建人骨形态发生蛋白-2(human bone morphogenetic protein,，hBMP-2)真核表达载体PcDNA3．1-hBMP-2，转染兔骨髓基质干细胞(bane marrow stromal cells，BMSCs)，种植去抗原牛松质骨(bovine cancellous bone，BCB)支架体外构建组织工程骨。方法：蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达，碱性磷酸酶(ALPase)活性检测分析基因转染对细胞分化的影响。然后将转染后细胞接种到BCB支架上，扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果：转染后，BMSCs表达BMP-2，ALP活性明显增高。扫描电镜见转染细胞分布均匀，伸展良好。结论：在脂质体介导下，BMP-2基因可导入细胞且稳定表达基因产物促进自身增殖分化，转染后细胞在支架材料上贴附生长良好，为进一步应用携带BMP-2基因的人工骨修复骨缺损奠定了实验基础。     

新型聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)支架的细胞相容性研究

目的研究骨髓基质干细胞(BMSCs)与该聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)类支架的细胞相容性及体外粘附情况,为制备负载多种细胞因子的PLGA类支架提供研究基础。方法抽取新西兰兔骨髓,用全骨髓培养法获取单核细胞,经条件培养液体外诱导、扩增。设立空白BMSCs组和具有良好细胞相容性的β-磷酸三钙(β-TCP)为对照组。BMSCs以1×106/mL浓度接种于PLGA和β-TCP上,通过倒置相差显微镜、扫描电镜观察细胞生长及细胞与材料的附着情况。以MTT实验、流式细胞仪等手段检测各组细胞增殖和细胞周期变化情况。结果BMSCs可较好粘附于PLGA支架上,且该PLGA类支架对细胞增殖、生长周期无明显影响。结论该PLGA类支架的细胞相容性较好,并可进一步作为多种细胞因子载体构建缓释型支架,从而用于骨组织工程。     

BMP—2基因转染的人骨髓基质干细胞复合PLA／PCL支架体外构建组织工程骨

目的 用人骨形态发生蛋白2腺病毒表达载体(Ad—BMP—2)转染的人骨髓基质干细胞(hBMSC)，复合PLA／PCL(聚乳酸／聚己内酯)生物降解支架体外构建组织工程骨。方法 用Ad—BMP—2转染体外培养的成人BMSC，免疫组化、原位杂交染色和蛋白印迹方法检测细胞BMP—2的表达，并通过流式细胞仪和ALP活性检测分析其对细胞增殖、分化的影响。然后将转染后细胞接种到PLA／PCL支架上，扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果 转染后，hBMP—2基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达；S期细胞比例和ALP活性明显增高。扫描电镜见转染细胞分布均匀，伸展良好。结论 Ad—BMP—2可高效转染hBMSC，且促进细胞增殖及成骨转化。转染后细胞在PLA／PCL上生长良好，BMP—2基因治疗的组织工程骨构建成功。     

含锌煅烧牛松质骨复合骨髓基质细胞构建组织工程骨

目的　探讨含锌煅烧牛松质骨和单纯煅烧牛松质骨复合骨髓基质细胞 (MSCs)构建的组织工程骨在体内的成骨能力。方法诱导培养骨髓基质细胞 ,将其分别接种至含锌煅烧牛松质骨及单纯煅烧牛松质骨 ,植入肌肉内 ,分别于术后 4、8周处死实验动物 5只 ,行组织学观察和新生骨面积测定。结果　术后不同时间组织学观察含锌组新生骨明显多于单纯组 ,新生骨面积测定值含锌组分别为 (17619.14 5± 44 5 9.816)、(2 5 2 3 8.5 3 9± 1995 .164 ) μm2 ,单纯组分别为(80 5 6.5 3 7± 5 67.60 3 )、(10 787.95 7± 92 5 .5 0 9) μm2 。含锌组明显大于单纯组 (P <0 .0 5 )。结论　含锌煅烧骨作为骨组织工程的支架材料优于单纯煅烧骨 ,是一种理想的生物活性支架材料。     

骨髓间充质干细胞复合脱细胞血管基质构建组织工程血管的初步研究

目的：探讨骨髓间充质干细胞复合脱细胞血管基质构建组织工程血管的可行性。方法：采用胰蛋白酶、乙二胺四乙酸和曲拉通X-100对兔主动脉进行脱细胞处理，制备成脱细胞血管基质；体外分离和扩增人骨髓间充质千细胞，并将其作为种子细胞种植于脱细胞血管基质上，复合构建组织工程化人工血管。结果：制备的脱细胞血管基质由胶原、弹力纤维等组成，未见细胞成分残留；体外扩增的人骨髓间充质干细胞种植于脱细胞血管基质上可生长增殖。结论：骨髓间充质干细胞与脱细胞血管基质支架材料复合可成功构建组织工程血管，有望为血管缺损的修复提供一种全新的技术方法和手段。     

Engineering scaffold‐free bone tissue using bone marrow stromal cell sheets

The use of exogenous scaffolds to engineer bone tissue faces several drawbacks including insufficient biological activity, potential immunogenicity, elevated inflammatory reaction, fluctuating degradation rate, and low cell‐attachment efficiency. To circumvent these limitations, we sought to engineer large scaffold‐free bone tissue using cell sheets. We harvested intact cell sheets from bone marrow stromal cells using a continuous culture method and a scraping technique. The cell sheets were then rolled and fabricated into large constructs. Finally, the constructs were implanted into the subcutaneous pockets of nude mice. The cells within the sheet maintained in vitro osteogenic potential after osteoblast differentiation. Computed tomography scans and histological examination confirmed new bone formation in vivo. Additionally, the engineered bone exhibited enhanced compressive strength. Our results indicate that the BMSC sheets can facilitate the formation of functional three‐dimensional bone tissue without the use of exogenous scaffolds. Hence, the study provides an intriguing alternative strategy for bone repair. © 2009 Orthopaedic Research Society. Published by Wiley Periodicals, Inc. J Orthop Res 28:697–702, 2010     

基因强化组织工程骨联合显微外科方法修复长段骨缺损的实验研究

目的评价骨形态发生蛋白2（BMP-2）基因强化的组织工程骨联合显微外科方法修复长段骨缺损的效果。方法分离培养兔骨髓基质干细胞，经BMP-2基因转染后复合异种骨支架体外构建基因强化的组织工程骨（GEB）。建立兔双侧桡骨缺损（2．5cm长）模型，采用5种方法修复。A：GEB加带血管蒂骨膜移植；B：GEB加血管束植入；C：GEB加游离骨膜移植；D：GEB；E：单纯支架。术后4、8、12周行X线、组织学、生物力学测定和微血管墨汁灌注等观察血管形成及成骨情况。结果A组血运建立最快，B组血管束早期即发出分支向移植骨内长入，C组4周时游离骨膜成活并发出微小血管，D组在BMP-2基因诱导下成骨速度和质量优于E组，12周时骨缺损部分修复，但中央区成骨不良，而E组12周时形成骨不连，缺损区内被纤维组织填充。在细胞成活率、生物力学性能、VEGF表达水平等方面，均表现为A〉B〉C〉D〉E，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论BMP-2基因强化的组织工程骨联合显微外科方法修复长段骨缺损，既提供了血运，又提供了有效的成骨诱导因子，是治疗长段骨缺损较为理想的方法。其中，带血管蒂骨膜联合移植修复效果最佳；血管束植入法血供重建较快，方便临床应用。     

骨髓基质细胞体内外成骨的实验研究

目的：探讨骨髓基质细胞（Bone marrow stromal cell,BMSc)向成骨细胞转化的条件,利用骨髓基质细胞构建组织工程化骨组织。方法：采用地塞米松、β-甘油磷酸钠诱导体外培养的兔骨髓基,上差异显微镜和碱性磷酸酶检测基向成骨细胞转化的能力。将骨髓基质细胞与生物活性玻璃陶瓷（Bioactive glass ceramic,BGC)复合后植入免自体肌袋内,观察成骨过程。结果：在适当诱导条件下,骨髓基质细胞可向成骨细胞分化,在体内外表现出明显的成骨能力,地塞米松、β-甘油磷酸钠起着重要的作用。结论：骨髓基质细胞是骨组织工程的良好细胞来源,利用组织工程化方法可构建新生骨组织。     

BMSCs来源成骨细胞和内皮细胞复合壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架构建血管化组织工程骨研究

目的探讨大鼠BMSCs来源的成骨细胞和内皮细胞复合壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架植入大鼠桡骨缺损处的成骨作用和成血管作用。方法取分离培养至第3代的SD大鼠BMSCs行成骨和成内皮细胞诱导并鉴定。分别将内皮细胞(A组)、成骨细胞(B组)、混合细胞(成骨细胞和内皮细胞比例为1∶1,C组)均匀滴加于壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架上制备3组细胞-支架复合物,MTT检测支架内细胞增殖活性。取2月龄雄性SD大鼠30只,制作大鼠桡骨5 mm长缺损模型并分别植入3组细胞-支架复合物(n=10)。术后4、8、12周分别取移植物行HE染色观察,CD34免疫组织化学染色计数微血管密度,RT-PCR法检测骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和骨保护素(osteoprotegrin,OPG)mRNA表达。结果 BMSCs成骨诱导7 d后ALP染色可见细胞质内蓝染颗粒,细胞核呈红染;内皮细胞诱导14 d后,CD34免疫细胞化学染色可见细胞内棕色颗粒。MTT检测示3组细胞活性随时间延长逐渐升高。HE染色示,术后12周A组未见明显类骨质形成,而有较密集的微血管结构及较多纤维组织形成;B、C组可见均质的类骨质,呈条索状和岛状分布,可见大量成骨样细胞存在。术后各时间点A、C组微血管密度均显著高于B组(P<0.05);A组术后12周微血管密度高于C组(P<0.05),其余2个时间点A、C组间差异无统计学意义(P>0.05)。A组3个时间点OPN和OPG mRNA表达水平均较低,与B、C组比较差异有统计学意义(P<0.05);B、C组分别于术后8、12周OPN mRNA表达达峰值,4周时OPG mRNA表达达峰值。结论 BMSCs来源的成骨细胞和内皮细胞按1∶1比例共培养于壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架作为组织工程骨移植物,可以促进大鼠桡骨缺损部位骨的形成和血管化,促进骨缺损愈合。     

转染BMP-2基因的兔BMSCs种植PLA/PCL支架体外构建组织工程骨

目的:用腺病毒载体将人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因导入兔骨髓基质干细胞(BMSCs),种植PLA/PCL(聚乳酸/聚己内酯)支架体外构建组织工程骨.方法:蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达,流式细胞仪和ALP活性检测分析基因转染对细胞增殖分化的影响.然后将转染后细胞接种到PLA/PCL支架上,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况.结果:转染后,BMSCs表达BMP-2,S期细胞比例和ALP活性明显增高.扫描电镜见转染细胞分布均匀,伸展良好.结论:BMP-2基因转染BMSCs,可促进细胞增殖分化.转染后细胞在PLA/PCL支架上生长良好,BMP-2基因治疗的组织工程骨构建成功.     

复合富血小板血浆新型可注射组织工程骨体内成骨研究

目的 以新型可注射生物材料壳聚糖β-磷酸三钙为支架,负载骨髓间充质干细胞(MSCs)与富血小板血浆(PRP)构建成新型可注射组织工程骨,观察其体内成骨效应.方法 采用中国青山羊双侧胫骨平台下腔穴型骨缺损模型.30只中国青山羊随机分为五组:空白组:骨缺损部不植入任何组织工程材料;单纯材料组:单纯植入组织工程材料壳聚糖β-磷酸三钙;PRP组:植入单纯复合PRP组织工程材料:MSCs组:植入单纯复合MSCs的组织工程材料;PRP/MSCs组:植入复合PRP、MSCs的组织工程材料.于术后第4、8周取出骨缺损区标本进行大体观察和组织学切片观察,图像分析骨缺损区域骨小梁的生成数量.结果 术后8周,大体观察显示PRP/MSC组骨缺损区域表面新生骨连续,外观类似正常骨.术后4、8周,组织学显示PRP/MSCs组骨缺损边缘区域类骨质数量明显增多,骨缺损部多为点片状新生骨组织,其中大的片状新生骨组织明显增多.术后4周空白组、单纯材料组、PRP组、MSCs组、PRP/MSCs组的成骨面积百分比分别为8.79±3.63、14.49±3.72、24.18±5.38、24.42±5.10、31.10±3.49:8周时分别为15.41±4.21、25.36±5.37、30.71±4.39、33.97±4.45、48.60±5.97,4周、8周PRP/MSCs组骨修复效果均优于其他各组(P<0.05).结论 负载PRP和MSCs的新型可注射组织工程骨具有良好的骨修复作用.     

基因修饰的组织工程骨联合带血管蒂骨膜移植修复长段骨缺损的研究

目的评价骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein2,BMP-2）基因修饰的组织工程骨联合带血管蒂骨膜移植修复长段骨缺损的效果。方法分离培养兔骨髓基质干细胞,经BMP-2基因转染后复合异种骨支架体外构建基因修饰的组织工程骨（gene modified tissue engineering bone,GMB）。建立兔双侧桡骨缺损（长2.5cm）模型,采用5种方法修复。A组：GMB＋带血管蒂骨膜移植;B组：GMB＋血管束植入;C组：GMB＋游离骨膜移植;D组：GMB;E组：单纯支架。于术后第4、8、12周行X线、组织学、生物力学测定和微血管墨汁灌注等观察血管形成及成骨情况。结果①A组血运建立快,第8周时即可修复骨缺损,其修复机制包括膜内成骨和软骨成骨两种机制;②B组血管束发出分支向移植骨内长入,但中心区成骨缓慢,第12周时骨缺损得到完全修复;③C组第4周时游离骨膜成活并发出微小血管,第8周时形成薄层外骨痂,第12周时骨缺损基本修复;④D组在BMP-2基因诱导下成骨速度和质量优于E组,可在第12周时使骨缺损部分修复,但中心区呈＂空心＂现象;而E组第12周时形成骨不连,缺损区内被纤维组织填充。结论带血管蒂骨膜与BMP-2基因修饰的组织工程骨联合移植,既提供了血运又提供了骨膜成骨细胞,同时具有良好的骨生成、骨诱导和骨引导作用,是治疗节段性骨缺损较为理想的方法。     

大鼠骨髓间充质干细胞作为滋养层培养小鼠胚胎干细胞

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSCs)作为滋养层体外培养小鼠胚胎干细胞(embryonic stemcells ESCs)的可能。方法:收集BALB/C小鼠3·5d胎龄的囊胚,接种于大鼠骨髓间充质干细胞的滋养层上,培养5~6d后挑取胚胎干细胞集落,胰酶消化传代。观察细胞集落生长情况,通过碱性磷酸酶染色、细胞核型分析对细胞生物学特性进行检测。结果:ES细胞呈集落性生长,碱性磷酸酶组织化学染色阳性,具有正常核型及多向分化潜能。结论:大鼠MSCs可以作为滋养层体外培养小鼠胚胎干细胞,并能保持未分化状态。