人纤溶酶真核表达重组质粒的构建

目的：构建人纤溶酶真核表达载体以用于抗栓、溶栓的研究。方法：人胎肝组织经PCR技术扩增人纤溶酶基因,定向克隆至真核表达质粒pC-DNA-3后测序。经测序鉴定正确后构建人纤溶酶真核表达重组质粒,利用PCR和酶切方法鉴定重组真核表达质粒的正确性。结果：目的基因 PCR扩增产物为1 740 bp,测序结果显示,目的基因PCR扩增产物与GenBank登记的序列完全相同。PCR和酶切鉴定结果显示,构建的重组真核表达质粒中含有正确编码的人纤溶
酶基因全长序列。结论：成功构建了含有人纤溶酶基因的真核表达重组质粒,并进行了鉴定。     

hTERT片段真核表达质粒的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)片段的真核表达质粒,方法：从肿瘤组织中提取总RNA．采用RT—PCR法扩增hTERT基因并克隆人PGEM—T Easy载体中,然后再亚克隆于pcDNA3．1真核表达载体,用PCR扩增及限制性酶切法筛选重组真核表达质粒,并以DNA测序鉴定。结果：PCR扩增及限制性酶切法证实重组真核表达质粒的构建成功。测序表明,hTERT基因片段与GenBank公布的相应基因同源性比较,核苷酸序列的同源性为98．73％,氨基酸序列的同源性为99．68％。结论：成功构建了hTERT真核表达质粒,为进一步研究与hTERT相关的抗肿瘤免疫治疗奠定了基础。     

真核表达质粒pcDNA3.1(+)-rmCGβ的构建和鉴定

目的 构建恒河猴绒毛膜促性腺激素β亚基(macaca mulatta chorionic gonadotrophin β subunit,rmCGβ)基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-rmCGβ,并了解该质粒能否在真核细胞中表达.方法 通过PCR扩增rmCGβ的全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的cDNA克隆至PGM-Teasy,测序后插入pcDNA3.1(+)真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-rmCGβ,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染B16细胞,通过RT-PCR扩增出B16/pcDNA3.1(+)-rmCGβ细胞株中rmCGβ全段基因cDNA.结果 经4轮PCR,成功扩增出rmCGβ的cDNA全长基因,酶切和测序证明正确构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)-rmCGβ,通过RT-PCR方法 证实该质粒能在B16真核细胞中正确表达.建立了稳定的细胞株B16/pcDNA3.1(+)-rmCGβ.结论 成功克隆和构建了rmCGβ的真核表达质粒载体pcDNA3.1(+)-rmCGβ,为进一步研究rmCGβ的新功能和免疫治疗奠定了基础.     

高迁移率蛋白A2基因真核表达载体构建与表达鉴定

目的：构建高迁移率蛋白A2（HMGA2）基因的真核表达载体,观察其在真核细胞中的表达,为进一步研究HMGA2 基因功能奠定理论基础。方法：采用RT-PCR 方法从人乳腺上皮HBL-100 细胞中扩增HMGA2 基因全长cDNA,扩增产物经双酶切及凝胶回收后,直接克隆至黄绿色荧光真核表达载体YFP-C1中,构建YFP- C1-HMGA2重组质粒。将YFP-C1-HMGA2真核表达载体转染到人前列腺癌PC3细胞中,通过RT-PCR方法验证所构建的真核表达质粒YFP-C1-HMGA2的正确性。结果：RT-PCR获得长度为351　bp的HMGA2全长cDNA,经YFP-C1真核表达载体克隆、酶切鉴定及测序分析,测序结果示基因序列与GenBank序列一致,证实真核表达质粒YFP-C1-HMGA2构建成功,并且能够在真核细胞中表达。结论：成功克隆了HMGA2基因,构建了YFP-C1-HMGA2重组质粒。     

真核表达载体pcDNA3.1-MAGE-1的构建

目的：构建含MAGE—1基因的重组真核表达质粒。方法：用RT—PCR方法从人肝细胞肝癌组织中扩增出MAGE-1基因cDNA序列，克隆至pGEM—T载体，测序证实基因碱基序列无误后，再克隆至真核表达载体pcDNA3.1( )，构建了pcDNA3.1—MAGE—1重组质粒。结果与结论：RT—PCR获得长度为927bp的阳性产物，经T载体和pcDNA3.1( )真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后。证实真核表达质粒pcDNA3．1—MAGE—1构建成功。     

稳定表达人survivin基因的B16细胞系的建立与鉴定

目的构建人survivin真核表达载体,稳定转染入小鼠黑素瘤B16细胞,建立稳定表达人survivin的小鼠黑素瘤细胞系。方法采用PCR方法扩增出人survivin全长基因的cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pIRES-neo中,并加入酶切位点和6×his标签,得到重组表达质粒pIRES-neo-SUR-(his)6。利用阳离子脂质体介导法将其稳定转染入小鼠黑素瘤B16细胞,经G418加压筛选出阳性克隆。利用RT-PCR、蛋白免疫印迹及免疫荧光等检测方法验证人survivin基因在稳定转染B16细胞株中的表达。结果经限制性内切酶鉴定及序列分析,pIRES-neo-SUR-(his)6重组体构建正确。RT-PCR结果表明:从稳定转染pIRES-neo-SUR-(his)6的B16细胞所抽提的总RNA中能够扩增出survivin基因(约530bp);蛋白免疫印迹结果表明:利用特异抗体能够从稳定转染pIRES-neo-SUR-(his)6的B16细胞中检测到survivin蛋白条带,而对照空质粒转染后的细胞则没有相应的条带;流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测结果显示,稳定转染pIRES-neo-SUR-(his)6的B16细胞用特异性抗体检测到高效的荧光表达,其中5号单克隆的荧光表达率为91.38%,而对照空质粒转染后的细胞则没有相应的荧光表达。结论成功构建了真核表达载体pIRES-neo-SUR-(his)6,建立了稳定转染高效表达人survivin的小鼠黑素瘤细胞系。     

人骨骼肌TnI-fast基因克隆和体外表达

目的：构建人骨骼肌TnI-fast基因分泌型真核表达载体，为利用TnI-fast基因进行抗肿瘤血管生成基因治疗奠定基础。方法：采用PCR和RT－PCR制备TnI-fast cDNA，构建TnI-fast基因克隆质粒，测序证实后将TnI-fast cDNA插入到pSecTag2B构建分泌型重组真核表达质粒。然后用TnI-fast基因重组表达质粒转染COS－1细胞，检测TnI-fast基因体外表达。结果：DNA测序证实，我们从人骨骼肌总RNA和cDNA文库中扩增的TnI-fas cDNA序列与NCBIGenebank TnI-fast cDNA序列完全一致。ELISA检测证实，TnI-fast/pSec Tag2 B转染后目的基因可在真核细胞中分泌表达。结论：本研究成功地构建了TnI-fast基因重组表达质粒，可进一步用于抗肿瘤血管生成基因治疗动物实验。     

人类肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体真核表达质粒的构建与临床意义

目的：为实现高表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)治疗前列腺癌,通过分子生物学技术构建TRAIL基因的真核表达质粒。方法：采用RT-PCR技术,从HL-60、Jurkat细胞mRNA中扩增出人类TRAIL基因序列,利用基因工程技术将其插入到真核表达载体pLXIN中获得重组质粒pLXIN-TRAIL,并进行酶切鉴定和DNA序列分析。结果：RT-PCR获得预期的扩增产物TRAIL884bp基因片段,成功构建pLXIN-TRAIL重组质粒,酶切鉴定及测序结果与预期相符。结论：重组克隆载体pLXIN-TRAIL构建成功。     

人PSCA真核表达载体的构建及表达

目的构建含有信号肽及FLAG标签的人前列腺干细胞抗原（PSCA）真核表达载体,并在人胚肾293T细胞中进行表达。方法通过PCR方法获得SIG-FLAG基因片段及人PSCA基因片段,插入到真核表达载体pIRES-neo中。构建的重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA转染293T细胞,利用流式细胞仪、免疫荧光及RT-PCR方法检测其表达情况。结果PCR扩增出的SIG-FLAG及PSCA基因测序正确,酶切鉴定证明重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA构建成功;检测结果显示重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA在293T细胞中得到表达。结论成功构建了重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA,且在293T细胞中能有效表达,为后续转人PSCA基因细胞系的构建工作奠定了基础。     

异种化PSCA融合基因抗前列腺癌DNA疫苗的构建及真核表达

目的：构建含有人前列腺干细胞抗原（PSCA）主要T细胞表位的DNA疫苗（pVAX1-PSCA3-Fc—GPI—IRES—GM／B7,简称pVAX1—PSCA3FcGB）,并在Cos7细胞中表达。方法：重叠延伸PCR合成异种化PSCA基因片段,同尾酶法将该片段3拷贝串联（PSCA,）后插入pCI—Fc—GPI载体中,再将PSCA3-Fc—GPI融合基因片段经酶切后导人真核表达载体pVAX1-IRES—GM／B7中,构建pVAX1-PSCA3FcGB疫苗,并检测其真核表达情况。结果：经测序异种化PSCA片段与设计一致,PCR和酶切鉴定证明pVAX1-PSCA3FcGB构建成功;间接免疫荧光和流式细胞仪检测结果显示,该疫苗在Cos7细胞中获得较好表达。结论：成功构建DNA疫苗pVAX1-PSCA3FcGB,并在Cos7细胞中有效表达,为下一步的DNA疫苗功能研究奠定了重要基础。     

人B7-H4基因转染细胞株的构建及其对T细胞的作用

目的克隆人B7-H4基因,构建人B7-H4基因转染细胞株并初步研究其对T细胞的作用。方法通过RT-PCR的方法获得人B7-H4分子的基因,将目的片段双酶切(EcoRⅠ和BamHⅠ)后与pIRES2-EGFP真核表达载体连接,构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP-B7-H4并进行鉴定;脂质体转染法将重组载体导入L929细胞,经G418加压筛选并通过流式细胞术和RT-PCR检测表达载体是否转入L929细胞中,通过检测活化T细胞上CD25,CD69的表达及T细胞增殖实验对B7-H4转基因细胞的生物学功能进行初步研究。结果从外周血活化单核细胞中扩增出目的基因,构建重组表达载体pIRES2-EGFP-B7-H4并将其转染至L929细胞,构建了一株稳定表达人B7-H4分子的基因转染细胞株,对其生物学功能的研究显示B7-H4分子可以下调活化T细胞上CD25,CD69的表达,并且对T细胞的活化增殖起到抑制作用(P<0.05)。结论成功构建了稳定表达B7-H4分子的基因转染细胞株,为进一步研制B7-H4分子的单克隆抗体提供了有效的免疫原。     

核糖核酸酶抑制因子过表达抑制B16细胞的侵袭和转移

目的 构建人核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)真核表达载体,检测其对B16细胞侵袭和转移能力的影响.方法 提取人7703细胞中的总RNA,RT-PCR特异性扩增RI编码区序列,利用基因重组技术将其克隆到载体pIRES2-EGFP中,稳定转染B16细胞以后,经G418筛选出阳性克隆.根据转染质粒不同分别命名为B16细胞组(未转染组)、空质粒对照组(pIRES2 -EGFP组)和实验组(pIRES2-EGFP-RI组).RT-PCR检测B16细胞中RI mRNA水平的表达,并通过Western blot和细胞免疫化学检测RI蛋白水平的表达;HE染色观察细胞形态的改变,黏附实验、划痕实验和Transwell法检测细胞黏附、迁移和侵袭能力的变化;Western blot检测MMP-2、MMP-9和nm23-H1以及E-cadherin的表达;建立C57BL/6小鼠肺转移模型,观察肺上肿瘤转移灶的变化.结果 酶切和测序结果证明重组质粒构建成功,实验组细胞RI的mRNA和蛋白的表达较B16细胞组和空质粒对照组显著升高(P＜0.05);HE染色结果显示,细胞铺展良好,核质比减小;转染pIRES2-EGFP-RI质粒的实验组细胞的黏附、迁移及侵袭能力明显降低(P＜0.05);与两对照组相比,实验组细胞MMP-2和MMP-9的表达水平明显降低,nm23-H1和E-cadherin的表达水平明显升高(P＜0.05);动物实验结果显示与对照组相比,实验组的肺转移灶明显减少.结论 成功构建的RI真核表达质粒能升高RI基因及蛋白水平的表达,显著抑制了B16细胞的转移和侵袭能力.     

人肠三叶因子重组真核表达载体的构建及在CHO/dhfr-细胞中的稳定表达

目的：构建人肠三叶因子（hITF）重组真核表达载体,并检测其在CHO/dhfr-细胞中的表达。方法：通过重叠延伸PCR法获得hITF cDNA片段,将目的基因插入真核表达载体pIRES/dhfr,得到重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr;经脂质体介导转染CHO/dhfr-细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO/dhfr-细胞系;用RT-PCR及ELISA法检测hITF的表达。结果：成功构建了重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达了目的基因。结论：成功构建了重组真核表达载体pIRES/hITF/dhfr,并在CHO/dhfr-细胞中分泌表达hITF蛋白,为进一步进行重组hITF的临床前研究奠定良好的实验基础。     

Survivin反义核酸真核表达载体的构建及在胶质瘤细胞中的表达

目的构建survivin反义核酸真核表达载体pIRES2-EGFP-SVVas,并检测其在恶性胶质瘤细胞SHG-44中的表达。方法构建survivin反义核酸真核表达载体pIRES2-EGFP-SVVas,并用脂质体介导转染入SHG-44细胞,通过RT-PCR及western blot检测细胞中survivin mRNA和蛋白的表达。结果构建了survivin反义核酸真核表达载体pIRES2-EGFP-SWas,并成功导入SHG-44细胞中,且有效表达,使SHG-44细胞中survivin mRNA和蛋白表达水平均降低。结论Survivin反义核酸真核表达载体pIRES2-EGFP-sVVas可以降低SHG-44细胞survivin基因的表达。     

加强型黄色荧光蛋白和VEGF双基因载体在肝细胞共转染表达

【目的】构建携带加强型黄色荧光素蛋白 (EYFP)和人类血管内皮生长因子 (VEGF)的双基因真核表达载体pIRES EYFP/VEGF12 1,用EYFP作标记基因 ,研究外源性VEGF12 1基因在大鼠原代培养肝细胞转染表达 ,为实时监测VEGF12 1基因修饰肝细胞移植后状态提供基础。【方法】将 pcDNA3VEGF12 1中VEGF12 1定向克隆到 pIRES EYFP ,构建重组质粒 pIRES EYFP/VEGF12 1,经酶切、PCR扩增和部分DNA序列分析证实后 ,转染大鼠原代培养肝细胞 ,用荧光显微镜等观察转染表达。【结果】酶切、PCR扩增和部分DNA序列分析等证明pIRES EYFP/VEGF12 1质粒成功构建 ,转染大鼠原代培养肝细胞后 ,可以通过荧光显微镜观察到黄绿色荧光。【结论】构建了 pIRES EYFP/VEGF12 1质粒 ,为实时监测外源性VEGF12 1基因转染表达和VEGF基因修饰肝细胞的基因治疗奠定基础。     

PSMA-IRES-FCY1-TK真核表达载体的构建及在前列腺癌细胞中的表达

目的: 构建前列腺特异性膜抗原(PSMA)启动子调控表达的FCY1/TK双自杀基因表达载体,并观察单、双自杀基因对前列腺癌细胞LNCaP的杀伤作用.方法: 通过PCR方法扩增出基因组DNA中PSMA启动子,利用基因重组的方法,替换真核表达载体pIRES中的CMV启动子.测序正确后,再将自杀基因FCY1和HSV-TK分别克隆于载体pIRES的两个多克隆位点,构建真核表达载体pPSMA-IRES-FCY1-TK.将该载体转染LNCaP细胞,用RT-PCR的方法检测其转录,用MTT法检测前体药物5-氟胞嘧啶、丙氧鸟苷单一或联合使用对转染后的LNCaP细胞的杀伤作用.结果: PCR扩增出长1400 bp的PSMA启动子片段,经克隆至pIRES后酶切鉴定证实,并测序表明序列与GenBank(Accession Number AF007544)报道的一致.pPSMA-IRES-FCY1-TK经脂质体转染LNCaP细胞后,RT-PCR检测到FCY1和TK基因在该细胞中均有转录.MTT法检测表明5-FC与GCV联合使用,其细胞生长抑制率明显高于单独使用5-FC,GCV(P<0.05). 结论: pPSMA-IRES-FCY1-TK的双自杀基因体系对前列腺癌细胞LNCaP细胞的杀伤作用,明显优于单自杀基因体系.     

Gankyrin真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的:构建Gankyrin基因的真核表达载体并转染NIH3T3细胞,获得稳定转染Gankyrin的NIH3T3细胞株,研究Gankyrin在真核细胞中的表达及功能。方法:通过RT-PCR方法从肝癌细胞SMMC-7721,中扩增获得人Gankyrin编码区基因,克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP上,利用阳离子脂质体转染NIH3T3细胞,经G418筛选获得稳定表达的细胞克隆。RT-PCR检测Gankyrin转染细胞后的转录;荧光显微镜观察确定Gankyrin在细胞中的定位分布;MTT法测定Gankyrin对细胞生长、血清依赖性及对地塞米松诱导细胞凋亡的敏感性影响。结果:重组表达载体pIRES2-EGFP-Gankyrin构建成功。Gankyrin在NIH3T3细胞中获得了有效转录及表达,并在细胞核和细胞浆中均广泛分布。Gankyrin可以显著促进NIH3T3细胞的增殖,降低血清依赖性并提高对地塞米松致细胞凋亡的耐受能力。结论:建立了稳定表达Gankyrin的NIH3T3细胞株,为进一步研究奠定了理论基础。     

脂质体介导hHCN2基因转染HEK293细胞的效率研究

目的:脂质体介导重组起搏基因pIRES2-EGFP-HCN2转染HEK293细胞,观察转染效率,探讨其构建生物起搏器的可行性。方法:对含hHCN2cDNA的PTR载体进行转化和扩增,将所得hHCN2基因定向克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP中,双酶切来鉴定克隆的正确性。将重组质粒用脂质体转染HEK293,荧光显微镜观察EGFP的表达并计算转染效率。结果:构建了重组质粒pIRES2-EGFP-HCN2。荧光显微镜下可见转染后的HEK293呈绿色荧光,其转染效率可达90%以上。结论:成功构建了重组质粒pIRES2-EGFP-HCN2,并用脂质体转染的方法导入HEK293细胞,为生物起搏的研究奠定实验基础。