志贺菌属整合子的耐药贡献与稳定性研究

目的分析志贺菌属整合子对耐药性的贡献及其稳定性。方法对志贺菌属1类、2类整合子的耐药基因盒分别克隆、转化DH5α,观察阳性克隆菌对多种抗生素敏感性的变化。将整合子阳性克隆菌与多重耐药志贺菌进行质粒接合实验,并测定耐药性的改变。对10株耐药谱不同、携带整合子不同的志贺菌属细菌进行无抗生素压力下连续多次传代实验,检测其耐药性及整合子的变化。结果志贺菌属1类整合子耐药基因盒dfrA17-aadA5阳性克隆菌对链霉素和甲氧苄啶的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)分别提高了8倍和32倍;2类整合子耐药基因盒dfrA1-sat1-aadA1阳性克隆菌对链霉素和甲氧苄啶的MIC分别提高了64倍和32倍;整合子阳性克隆菌经质粒接合传递后对抗生素的MIC无改变。1株携带2类整合子的志贺菌属菌株经过多次传代培养后丢失整合子及其耐药性。结论志贺菌属整合子-耐药基因盒系统可引起特定抗生素的耐药性,对质粒接合传递耐药性无影响。志贺菌属的2类整合子可发生丢失。     

细菌多重耐药与整合子-基因盒系统

细菌的耐药性,尤其是多重耐药已成为临床治疗的大难题。修饰酶及灭活酶的产生、抗生素作用靶位的改变以及利用膜蛋白的缺失与主动外排泵系统过表达来减少抗生素在细胞内的浓度,是细菌的几个重要耐药机制。整合子介导耐药基因在染色体、质粒及转座子之间移动,从而导致细菌耐药性的传播,是细菌耐药性迅猛发展的重要原因。     

一株多重耐药铜绿假单胞菌的双整合子基因结构分析

目的 检测临床多重耐药铜绿假单胞菌的整合子,并进行结构及定位分析.方法 PCR扩增耐药基因和整合子、电泳胶回收DNA片段并进行序列比对分析.结果 在一株多重耐药铜绿假单胞菌(PAVim2)中检测到双整合子,其中一个为Ⅰ类整合子,一个为Tn402样的Ⅰ类整合子,两者基因结构为5'CS-IntI-sul1-3'CS和5'CS-IntI-Vim2-Rh506.结论 双整合子结构的发现为铜绿假单胞菌多重耐药研究有临床意义.     

整合子在鲍曼不动杆菌多重耐药机制分析

目的:调查我院鲍曼不动杆菌耐药性;了解整合子类型以及整合子携带耐药基因盒特征。方法:收集我院临床分离鲍曼不动杆菌。细菌鉴定及药敏由MicroScan Walk Away 40仪器完成,整合子分类检测及开放阅读框扩增由PCR法完成。开放阅读框扩增产物经琼脂糖凝胶电泳及凝胶回收试剂盒回收纯化后进行DNA测序分析,测序结果在Genebank上作比对。结果:62株鲍曼不动杆菌有11株呈多重耐药,阳性率17.7%,11株鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类药物阿米卡星,妥布霉素,庆大霉素均耐药,其余菌株较敏感。11株鲍曼不动杆菌中均检出整合子;进一步分类鉴定显示均为Ⅰ类整合子,未检出Ⅱ类和Ⅲ类整合子。开放阅读框可变区扩增产物为(0.3～2.5)KB不等条带,测序结果证实11株Ⅰ类整合子含有6个不同耐药基因盒:blam-1,orfX,aacA4,catB3,dfrA1,aadA1。其中7株均出现catB3,aacA4和dfrA1组合。结论:与其他报道相比较,我院鲍曼不动杆菌多重耐药率相对较低,但耐药鲍曼不动杆菌携带整合子率较高,且均为Ⅰ类整合子;其整合子基因盒含有多种耐药基因编码,其中aacA4,catB3和dfrA1耐药基因组合在本地区占优势。     

福氏志贺菌毒力蛋白IpaC的表达、纯化及免疫活性鉴定

目的表达、纯化福氏志贺菌毒力蛋白IpaC并对其免疫活性进行鉴定。方法将含有ipaC基因的pET32a．ipaC表达质粒载体转入大肠杆菌BL21（kDE3）中表达,表达产物进行SDS—PAGE鉴定,并采用QIA expressionist^TM蛋白纯化系统纯化IpaC蛋白;用纯化的蛋白免疫动物获得抗血清,Western-blot检测抗原的免疫活性。结果诱导后的表达产物经SDS—PAGE发现有一相对分子量约为63000的条带,其含量约占总蛋白量的11％,对融合蛋白进行纯化纯度可达90％以上,抗His的抗体Western-blot分析,发现特异性区带出现在63000u处,证明该蛋白是所要表达的融合蛋白,制备的免疫血清可与Ipac发生特异免疫反应。结论pET32a-ipaC重组表达质粒转入大肠杆菌后,可稳定、高效地表达毒力蛋白IpaC,且纯化后的蛋白具有免疫活性。     

福氏志贺菌毒力蛋白IpaC的表达与纯化

目的表达和纯化福氏志贺菌毒力蛋白IpaC,研究福氏志贺菌的致病机制。方法将含有ipaC基因的pET32a-i-paC表达质粒载体转化大肠杆菌BL21(λDE3),在异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导下表达,对诱导后的表达产物进行SDS-PAGE鉴定,并采用QIA expressionistTM蛋白纯化系统来纯化目的蛋白。结果诱导后的表达产物经SDS-PAGE发现有一相对分子质量约为63 000的条带,其含量约占总蛋白量的11%,以350 mmol/L咪唑洗脱液洗脱,目的蛋白纯度可达90%以上。结论pET32a-ipaC重组表达质粒转入大肠杆菌后,可稳定、高效地表达目的蛋白,QIA-expressionistTM蛋白纯化系统是一种简便、高效的纯化系统,可获得高纯度的目的蛋白。     

痢疾杆菌GST-IpaH4.5载体构建及其在大肠杆菌中的表达

目的构建痢疾杆菌GST-IpaH4.5融合蛋白表达质粒,并在大肠杆菌（E.coli）中诱导表达。方法以痢疾杆菌福氏2a 301株全基因组为模板,PCR扩增痢疾杆菌ipaH4.5基因,在ipaH4.5的上游加上BamHⅠ酶切位点,下游加上XholⅠ酶切位点,将ipaH4.5基因定向插入质粒pGEX-4T-1中,构建原核表达质粒pGEX-IpaH4.5并转化E.coliDH5α,筛选阳性重组子,限制性内切酶切鉴定和DNA序列测定,DNA序列正确后提取质粒转化E.coli BL21,筛选阳性转化子,异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达结果。结果成功构建IpaH4.5原核表达质粒pGEX-IpaH4.5并表达出大小约86 000Mr的GST-IpaH4.5融合蛋白。结论 GST-IpaH4.5融合表达载体的构建,为进一步纯化IpaH4.5蛋白和研究其在痢疾杆菌致病机制中的作用奠定了基础。     

社区获得性腹泻患者中志贺菌的感染耐药状况及基因分型

目的调查武汉市社区获得性腹泻患者中志贺菌感染和流行状况,分析志贺菌血清型分布及耐药性,为社区获得性腹泻治疗和该菌的基因分型提供客观依据。方法菌株来自2004年夏秋季武汉市4所大型医院门诊腹泻患者的粪便标本;药物敏感试验采用琼脂稀释法和纸片扩散法;结果分析采用WHONET5.3软件和SPSS12.0软件;基因分型采用重复基因外回文序列-聚合酶链式反应(REP-PCR)。结果5079份粪便标本分离出29株志贺菌,占所检出病原菌总数的23%,血清分型涉及B群和D群,D群占59%。志贺菌对头孢他啶和头孢吡肟的敏感率最高,为100%;其次为氨曲南、呋喃妥因和氟喹诺酮(诺氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星和莫西沙星),敏感率为93.1%～96.6%;对头孢曲松、头孢噻肟、卡那霉素和庆大霉素的敏感率为75.0%～82.8%;对氯霉素、氨苄西林、萘啶酸、四环素和大观霉素的敏感率均小于50%;未发现复方新诺明敏感株。耐药模式多达20种,最多为12种联合耐药;各群有各自的优势耐药模式。REP-PCR基因分型结果提示16株D群志贺菌有7种指纹图谱,12株B群志贺菌有2种指纹图谱。结论武汉地区因志贺菌感染导致社区获得性腹泻的比例较低,D群感染占优势。头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南和氟喹诺酮有较好的抗菌活性。B群和D群对氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸和氯霉素的敏感性差异有极显著性意义。多重耐药普遍存在,耐药模式繁多。武汉市志贺菌有相同或相似的克隆,血清型单一的D群有多种基因型,B群中f2a比f4c的遗传多样性高。     

思茅地区1992～2001年志贺氏菌菌型分布和药敏试验

目的 了解本地区志贺氏菌菌型分布及对抗菌素的敏感性。方法 按肠道致病菌检验程序和方法进行分离培养、菌群菌型鉴定和药敏试验。结果 菌型分布于4个群、16个血清型(亚型)。B群占88．4％，其中福氏2a占66．3％；D群占6．6％；C群占3．2％；A群仅为1．8％。药敏试验对环丙沙星、庆大霉素、氟哌酸、丁胺卡那霉素、多粘菌素B等敏感；对氨苄青霉素、复方新诺明、新霉素、红霉素耐药。结论 B群福氏志贺氏菌为本地区流行的主要菌群，福氏2a为优势菌型；菌株对抗菌素耐药日趋增多，新的耐药菌株不断出现。     

具有伤寒杆菌和痢疾杆菌抗原的杂交菌株GW_1的构建

以福氏痢疾杆菌２ａ为供体菌，以伤寒沙门菌口服疫苗Ｔｙ_（２１ａ）株为受体菌，通过质粒诱动，将福氏痢疾杆菌的菌体抗原基因转移至伤寒沙门菌口服疫苗灯Ｔｙ_（２１ａ）株中，构建了既表达福氏痢疾杆菌ｏ抗原，又表达伤寒沙门菌Ｏ_９、Ｏ_（１２）和Ｈｄ抗原的杂交子，并将此杂交子命名为ＴＳＧＷ_１株。     

志贺菌属药敏试验结果及其耐药性原因的初步探讨

１９９１年５－１０月，作者从肠道门诊痢疾患者的粪便中分离出３２５株志贺氏菌，对其中的２４８株做１７种抗菌药物的敏感试验，对其结果进行分析。同时做了大肠埃希氏菌与志贺氏菌的耐药质粒接合传递试验，并对志贺氏菌耐药性原因进行了初步探讨。     

临床分离志贺菌属细菌主动外排系统acrAB-tolC基因的表达

目的：探讨临床分离志贺菌属细菌多重耐药机制。方法：从临床收集的141株志贺菌中筛选出64株多重耐药株和6株敏感野生株，应用荧光法测定其对环丙沙星的主动外排功能。PCR—SSCP检测主动外排系统acrAB—tolC基因单链构象多态性。Northern—blot测定acrAB-tolC mRNA表达水平。结果：敏感野生株细胞内环丙沙星稳态浓度高于多重耐药株（P〈0．0001）。所有临床分离志贺菌均检测到acrAB-tolC基因，未发现acrAB-tolC基因缺失株；发现4株多重耐药株acrA基因突变，1株敏感野生株tolC基因突变，未发现acrB基因突变株。多重耐药株acrA基因mRNA表达水平高于敏感野生株（P〈0．05），其acrB基因和tolC基因mRNA表达水平与敏感野生株相比，差异无统计学意义（P〉0．05）。结论：主动外排系统acrA基因高表达可导致志贺菌产生多重耐药性；acrAB-tolC的表达可能受多种耐药操纵子调控。     

深圳市从业人员中志贺菌型分布及药敏结果分析

目的了掌握深圳市食品、公共场所从业人员志贺菌血清型分布和耐药情况。方法按国标肠道致病菌中志贺菌的检验方法和国家卫生行业标准WS/T 125-1999纸片法抗菌药物敏感试验标准方法进行。结果33株志贺菌分型,B群32株占总数的96.97%,C群1株占3.03%。在B群中,2型12株占36.36%,4型10株占30.30%,1型4株占12.12%,X变种5株占15.15%,Y变种1株。33株菌对庆大霉素、左旋氧氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、头孢噻腭、头孢唑啉、头孢美唑、痢特灵为100%敏感,对麦迪霉素100%耐药。结论深圳市食品、公共场所从业人员中志贺菌型分布有所改变;治疗菌痢应首选药物为痢特灵,环丙沙星,氧氟沙星等。     

血液中分离大肠埃希菌的Ⅰ类整合子分析

目的:分析从血液分离大肠埃希菌中I类整合子的流行情况。方法:对15株大肠埃希菌进行PCR扩增I类整合子,将扩增产物测序并分析其中的基因盒。结果:6株细菌含有I类整合子,整合子大小分别为600bp、1700bp,600bp整合子含基因盒dfr2d,1700bp整合子含基因盒dfr17-aadA5。结论:整合子在从血液分离大肠埃希中流行。     

痢疾杆菌R质粒的检测、消除及药物敏感试验

目的：探讨得疾杆菌的耐药性。方法：采用Ｋ－Ｂ法测定痢疾杆菌的耐药谱,对耐药菌株进行Ｒ闰的检测及接合传递人工诱导痢疾杆功秋稳定Ｌ型,观察Ｒ质粒丢失情况。结果：４５株痢疾杆菌４４经,耐药率９７．８％,其中三重耐药菌株占９３．２％,四重以上耐药菌株占７３．３％。８８．９％（４０／４５）的菌株检测出Ｒ质粒,质粒的接合传递率为６１．４％。痢疾杆菌Ｌ型未见质粒丢失。结论：痢疾杆菌的耐药性十分严重,自由质粒控制     

鲍曼不动杆菌多重耐药性和同源性分析

目的了解重症监护病房（ICU）的多重耐药鲍曼不动杆菌的耐药谱特征及菌株同源性,为临床防治和控制院内感染提供依据。方法收集ICU重症监护病房2009年1～3月分离出的9株鲍曼不动杆菌,研究其耐药情况,并采用自动ribotyping技术进行同源性分析。结果 9株菌对头孢菌素类,氨基甙类等抗菌素均显示出较高水平的耐药性;ribotyping分型9株菌有高度同源性,其中7株同源性达90%以上。结论自ICU分离的鲍曼不动杆菌多重耐药率较高,且大多数菌株有高度同源性,因此,医院应加强ICU病房消毒隔离措施,降低病人院内感染的概率     

1994～2001年中国重症监护病房非发酵糖细菌的耐药变迁

目的 了解我国重症监护病房非发酵糖菌的耐药变迁。方法 1994-2001年,用E试验法检测全国32家医院分离的4450株非发酵糖细菌对亚胺培南等数10种抗生素的最低抑菌浓度（MIC）。用WHO NET-5软件分析数据。结果 7年中,主要的非发酵糖细菌为铜绿假单胞菌（46.9%)。不动杆菌属（31.0%)。嗜麦芽窄食单胞菌（9.2%)。总敏感率最高的是头孢哌酮/舒巴坦（78.6%)。亚胺培南（77.0%)。其次是头孢他啶（70.1%)。哌拉西林/三唑巴坦（69.5%)。阿米卡星（69.9%)。再次为头孢吡肟（63.0%)。环丙沙星（59.1%)。除嗜麦芽窄食单胞菌,洋葱伯克霍尔德菌之外,其他非发酵糖菌对亚胺培南,头孢哌酮/舒巴坦的敏感率分别为84.2%和77.4%。7年中铜绿假单胞菌对11种抗生素的敏感性都在下降,亚胺培南,头孢他啶,阿米卡星,头孢哌酮/舒巴坦,头孢吡肟,哌拉西林/三唑巴敏感率为70.0%-83.0%。对亚胺培南对不动杆菌的敏感率高达95.0%。且历年不减。其次是头孢哌酮/舒巴坦,对它的敏感率从1996年的88.0%降至2001年的69.0%。而对头孢他啶,头孢吡肟,哌拉西林/三唑巴坦,替卡西林/克拉维酸,庆大霉素,环丙沙星的敏感率只有45.0%-58.0%。嗜麦芽窄食单胞菌对头孢哌酮/舒巴坦,头孢他啶,替卡西林/克拉维酸的敏感率最高（78.0%-85.0%)。产碱杆菌属对头孢哌酮/舒巴坦,哌拉西林/三唑巴坦及亚胺培南敏感率高于80.0%;黄杆菌属仅对头孢哌酮/舒巴坦,哌拉西林/三唑巴坦敏感率高于70.0%;73.0%-86.0%的洋葱伯克霍尔德菌对头孢哌酮/舒巴坦,头孢他啶,头孢吡肟,哌拉西林/三唑巴坦敏感。结论 近7年非发酵糖菌对常用的广谱抗生素的敏感性在下降。目前迫切需要制定相关政策,延缓耐药的发展。     

猕猴志贺菌感染状况及药物敏感性调查

目的 研究志贺菌血清型的分布，针对不同血清型筛选高敏抗生素。方法 采用国标(GB／T14926．47—2001)的检测方法，对537份猕猴粪便样品进行细菌分离、鉴定及药敏实验。结果 检出74株志贺菌．检出率为13．78％。其中A群占6．76％，B群占71．62％，C群占21．62％。各个血清型分布为：A群1型占6．76％，B群2a型、Y变种、6型、3c型分别占35．14％、32．43％、2．70％、1．35％，C群鲍氏多价(7—11)型、(12-15)型分别占20．27％、1．35％。药敏实验表明志贺菌对氧氟沙星(86．49％)最敏感；对头孢三嗪(77．03％)、头孢他啶(64．86％)也较敏感；2a型志贺菌对头孢唑啉(65．38％)、痢特灵(65．38%)有较强敏感性；鲍氏多价(7—11)型对头孢唑啉(66．67％)、环丙沙星(66．67％)、诺氟沙星(66．67％)敏感性较强。结论 志贺菌2a、Y变种和鲍氏多价(7-11)型是目前引起细菌性痢疾的主要血清型，且对氧氟沙星、头孢三嗪、头孢他啶敏感，其中鲍氏多价(7—11)型对头孢唑啉、环丙沙星、诺氟沙星也有较强敏感性。     

呼吸道感染病原菌的分布及耐药监测分析

目的分析于2003～2007年收治呼吸道感染患者的病原菌的菌群分布及其耐药性变化,为临床合理用药提供依据。方法收集2003～2007年呼吸道感染患者的呼吸道标本作细菌培养、鉴定和药敏试验,依据CLSI颁布标准进行药敏试验结果判定。采用WHONET5．4软件进行数据分析。结果呼吸道病原菌以革兰阴性杆菌为主,其中铜绿假单胞菌的检出占比率最高,且铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的检出占比率逐年上升;革兰阳性球菌仍以葡萄球菌属多见。革兰阴性杆菌对阿米卡星、哌拉西林,他唑巴坦及头孢哌酮,舒巴坦尚有较高的敏感性;耐甲氧西林葡萄球菌的检出率逐年上升,未发现耐万古霉素和替考拉宁的葡萄球菌,葡萄球属对夫西地酸、氯霉素、米诺环素亦有较高的敏感率。结论呼吸道感染病原菌的分布及耐药性随年份而有一定变化,加强病原菌的耐药监测分析,对制订抗菌药物的使用策略具重要意义。