体外诱导猪Müller细胞定向分化为光感受器细胞的研究

背景 大鼠、小鼠Müller细胞在体外能诱导分化为表达视网膜光感受器细胞特异标记的细胞,但目前有关成年猪Müller细胞分化为视网膜光感受器细胞的研究鲜有报道.目的 研究成年猪Müller细胞于体外定向诱导后分化成视网膜第一级传导神经元光感受器细胞.方法 消化成年猪眼视网膜组织,分离Müller细胞行体外继代单层贴壁培养.使用定向分化培养基对P2、P3和P4代Müller单层贴壁细胞及先形成细胞球悬浮培养2—3d,然后再对贴壁细胞进行诱导分化,最后结合细胞形态和免疫荧光染色结果鉴定Müller细胞以及诱导分化效果.结果 免疫荧光染色结果显示,P2,P3和P4 Müller细胞均能表达Müller细胞特异蛋白分子标记,即谷氨酸合成酶(GS),P3 Müller细胞还同时表达另一种Müller细胞特异蛋白分子标记,神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP).免疫荧光染色分析并计算视网膜光感受器细胞特异标记视紫质Rhodopsin阳性率,P2 Müller单层贴壁分化细胞为(27.99±6.53)％,P2悬浮细胞球分化为(16.54±3.40)％.P2悬浮细胞球诱导分化后形态更趋向神经元,而P2代Müller单层贴壁细胞分化后形态仍趋向于成纤维细胞.随着培养代数的增加,细胞球定向分化Rhodopsin阳性表达程度逐渐减弱,P2、P3和P4 Rhodopsin阳性率分别为(56.23±7.32)％、(35.26±8.55)％和(12.68±3.18)％,差异无统计学意义(F=2.618,P=0.099).同代细胞随着诱导时间的延长,Rhodopsin阳性表达有所减弱,差异无统计学意义(P=0.099),但分化细胞形态更为细长.结论 成年猪Müller细胞离体培养后可定向分化为表达视网膜光感受器样细胞特异标记的细胞.细胞球悬浮培养2～3d,以及延长诱导分化时间都能使得分化细胞形态更为细长.     

羊膜对体外培养的兔视网膜Müller细胞表皮生长因子受体表达的影响

目的研究羊膜对兔视网膜Müller细胞表皮生长因子受体（EGFR）表达的影响及其机制。方法取出生15d新西兰白兔视网膜Müller细胞进行原代培养及传代,采用神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和S-100进行细胞鉴定。0.25%胰蛋白酶、0.05%EDTA酶消化取第3代Müller细胞,实验组加0.5mL羊膜匀浆上清液继续培养12h,采用免疫组织化学法检测羊膜诱导和非诱导条件下兔视网膜Müller细胞EGFR表达的变化并进行分析。结果培养的兔视网膜Müller细胞GFAP和S-100表达阳性,透射电镜检查细胞质内可见8～10nm的中间丝。未经羊膜诱导的视网膜Müller细胞EGFR有少量表达,经羊膜诱导12h后,EGFR表达明显增多,2组灰度值分别为571588.80±67862.68和1000352.00±98386.22,差异有统计学意义（t=4.035,P〈0.01）。结论经羊膜诱导后可促进培养的兔视网膜Müller细胞EGFR的表达。     

新生大鼠视网膜Müller细胞原代培养方法的改良

背景 目前,视网膜Müller细胞的干细胞特性日益受到关注,优化Müller细胞的培养方法对视网膜干细胞治疗的进一步研究具有重要意义. 目的 对视网膜Müller细胞的原代培养方法加以改良,建立一种简单、有效的实验室分离纯化Müller细胞的方法.方法 取新生SPF级SD大鼠眼球,培养基浸泡后室温条件下避光过夜,显微镜下分离视网膜,直接吹打成微小组织悬液后接种于培养瓶中,8～10d后行第1次换液,之后2～3d换液1次,至细胞完全融合后进行传代.细胞形态一致后于光学显微镜下观察细胞的形态特征,免疫荧光法检测Müller细胞标志物谷氨酰胺合成酶(GS)和波形蛋白(Vimentin)的表达,进行细胞鉴定;采用流式细胞术对所得细胞进行纯度检测. 结果 原代培养的Müller细胞胞体狭长,细胞质丰富.传至3代的细胞95％以上对GS和Vimentin反应阳性,阳性染色主要位于细胞质和细胞核.Vimentin阳性染色主要位于细胞质.流式细胞仪检测显示传3代后99.7％的细胞GS表达阳性. 结论 采用Müller细胞改良法-流式细胞术对所得细胞进行纯度检测,简单可行,收获的细胞数量多、纯度高.     

脂质体法和电穿孔法体外转染SD大鼠视网膜M-ller细胞的比较

目的:探讨脂质体法及电穿孔法介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染体外培养的视网膜Müller细胞的可行性和区别.方法:体外培养出生后7～10d的SD大鼠视网膜Müller细胞,免疫荧光染色法鉴定95%以上为视网膜Müller细胞.分别用阳离子脂质体Lipofectamine 2000介导的脂质体转染法和电穿孔法将质粒PEGFP-N1转染视网膜Müller细胞,荧光显微镜下检测转染后1,2,3,4d的转染效率,并持续观察至转染后14d,比较两者基因表达持续时间.结果:荧光显微镜下检测转染后1d,两组均可见少量细胞表达EGFP绿色荧光蛋白.转染后2d,两者转染效率均达到最大,并且电穿孔法介导质粒PEGFP-N1转染Müller细胞效率约为31.0%±2.8%,较脂质体法转染效率(10.5%±2.4%)更高.两者比较有统计学意义(P＜0.01).随后,两者转染效率均逐渐降低.电穿孔转染后的PEGFP-N1可在视网膜Müller细胞内持续表达近14d,而脂质体转染后仅能表达约7d.结论:脂质体法和电穿孔法均适用于视网膜Müller细胞的基因转染,但电穿孔法效率更高,表达时间更长.     

Müller细胞干细胞特性的研究进展

视网膜退行性病变缺少有效的防治方法.研究显示,Müller细胞可表达视网膜神经元细胞标记物如钙视网膜蛋白、视黄醛结合蛋白等.人Müller细胞不但可表达神经干细胞相关转录因子如SOX2、PAX6、CHX10、NOTCH1,还表达视网膜神经元标记物如双极细胞标记物蛋白激酶C,光感受器神经元标记物(盘膜边缘蛋白),神经节细胞标记物HuD与Brn3,大部分神经元标记物神经丝蛋白、βⅢ微管蛋白,神经节细胞、无长突细胞和水平细胞阳性标记物(钙视网膜蛋白).因此表明,视网膜Müller细胞可分化成不同视网膜神经元细胞,具有干细胞特性,利用Müller细胞进行细胞移植可能是治疗视网膜退行性病变具有潜力的新策略.     

改良的人视网膜Müller细胞的原代培养方法与鉴定

背景 视网膜Müller细胞是视网膜重要的胶质细胞,也是视网膜干细胞的来源之一,研究Müller细胞的生物学行为对研究视网膜的各种生理病理过程和视网膜干细胞治疗研究具有重要意义,而建立稳定的视网膜Müller细胞培养体系是相关研究的基础. 目的 优化分离培养和纯化人视网膜Müller细胞的方法,为相关的实验研究提供良好优质的Müller细胞来源. 方法 分离人供体眼视网膜组织,然后将剪碎的视网膜组织置入质量分数0.25％胰蛋白酶+100 U透明质酸酶混合溶液中进行消化,添加含体积分数10％胎牛血清的DMEM/F12培养液1～2 ml终止消化,然后加入含体积分数20％胎牛血清的RPMI1640培养液培养72 h,行半量换液,再以含10％胎牛血清的培养液进行传代.光学显微镜下根据细胞的形态特征进行细胞鉴定,并分别采用免疫荧光技术和免疫组织化学法检测胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和Müller细胞特异性标志物谷氨酰胺合成酶(GS)的表达,对培养的细胞进行鉴定.结果 应用0.25％胰蛋白酶+100 U(商品单位)透明质酸酶的混合酶消化法可成功获取人视网膜Müller细胞,原代培养后24 h细胞贴壁,培养后9～1Od细胞融合.培养的细胞胞体呈长圆形,细胞质丰富,部分细胞体两端锥状长突起,末端膨隆,细胞核大.传代后的细胞胞体大,呈扁平多角形,符合Müller细胞的形态.细胞免疫组织化学和免疫荧光技术检测显示95％以上的细胞中GFAP呈阳性表达,90％以上的细胞中GS呈强阳性表达. 结论 应用透明质酸酶和胰蛋白酶混合液消化法可以成功分离人视网膜Müller细胞,分别用含20％胎牛血清和含10％胎牛血清的RPMI1640培养液培养和传代的人视网膜Müller细胞产量高且纯度好.     

Müller细胞对大鼠光感受器变性及视功能的保护作用

目的以RCS视网膜色素变性大鼠为模型,研究经诱导产生神经干细胞特性的Müller细胞视网膜下腔移植对光感受器变性的保护作用。方法向6周龄VC大鼠玻璃体腔内注射神经毒素混合液（包含NMDA、kainate、FGF2和胰岛素）刺激视网膜Müller细胞。1周后取材分离Müller细胞体外原代培养。将细胞标记后,以每眼1×10^5个细胞密度移植到6周龄RCS大鼠右眼视网膜下腔,左眼分组注射正常Müller细胞和PBS作为同型对照及阴性对照。术后分别于第1、3、5、7周,行视网膜铺片、组织病理学及视觉电生理检查。结果培养的Müller细胞纯度可达96％以上,其中表达神经干细胞标志物的细胞占总细胞量的53％以上。组织病理学观察显示,在相同时间点移植眼保留的光感受器细胞数量明显较同型对照眼多,同型对照移植眼保留的光感受器细胞数量明显较阴性对照眼多。视网膜电图（ERG）检查结果与病理学结果相符。结论视网膜下腔移植经诱导产生神经干细胞特性的Müller细胞可以有效延缓RCS大鼠视网膜光感受器变性,为治疗视网膜变性疾病提供了新的途径。     

视网膜神经节细胞无血清上清培养液诱导大鼠视网膜干细胞的分化

目的　探讨视网膜神经节细胞无血清上清培养液对视网膜干细胞分化的影响。方法　分离大鼠视网膜干细胞和视网膜神经节细胞;采用免疫荧光法鉴定体外培养的大鼠视网膜干细胞与视网膜神经节细胞,视网膜干细胞以Nestin抗体进行鉴定,视网膜神经节细胞以Thy-1抗体进行鉴定;以视网膜神经节细胞无血清上清培养液培养视网膜干细胞,以不加入条件培养液培养的视网膜干细胞为对照组,收集分化细胞,采用qPCR法检测Nestin、Pax6、Thy-1及Brn-3的基因表达。结果　培养的视网膜干细胞Nestin抗体染色阳性,视网膜神经节细胞Thy-1抗体染色阳性。培养视网膜干细胞72 h后,与对照组相比,无血清上清培养液组细胞Nestin和PAX6基因相对表达量降低,差异均有统计学意义（均为P<0.000 1）;Thy-1和Brn-3基因相对表达量升高,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　视网膜神经节细胞无血清上清培养液能够诱导视网膜干细胞分化为视网膜神经节样细胞。     

骨髓间充质干细胞向视网膜神经节样细胞的诱导分化

目的 探讨视网膜条件分化液诱导骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stemcells,BMSCs)向视网膜神经节样细胞定向分化的作用.方法 采用PCR技术、流式细胞术、免疫荧光法观察视网膜条件分化液对BMSCs分化的影响.结果 视网膜条件分化液诱导BMSCs 3 d后,Nestin阳性细胞比率为(30.9±7.7)%.诱导后第7天,免疫荧光结果显示Neurofilament的阳性细胞比率为(23±4)%,β-tubulin Ⅲ的阳性细胞比率为(18±3)%.RT-PCR结果也显示上述神经元或神经节细胞标志物的表达阳性.结论 视网膜条件分化液对BMSCs向视网膜神经节样细胞定向分化具有促进作用.     

缺氧对视网膜Müller细胞上水通道蛋白-4表达的影响

目的 利用体外培养的视网膜Müller细胞,研究在缺氧条件下视网膜Müller细胞上水通道蛋白-4(AQP-4)表达的变化.方法 采用组织块培养法从新西兰大白兔视网膜中获取Müller细胞,在含20%胎牛血清的DMEM培养液中原代培养,培养的细胞通过胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色及透射电子显微镜进行鉴定.取第2代细胞进行实验,将化学缺氧诱导剂CoCl_2联合DMEM培养液培养24h的细胞作为缺氧组;将DMEM培养液单独培养24h的细胞作为对照组.采用免疫细胞化学法及半定量RT-PCR法分别检测2组Müller细胞上AQP-4蛋白及AQP-4 mRNA的表达.结果 Müller细胞(第2代)上GFAP的阳性率为90%以上,细胞质染色呈棕色.细胞内含特征性的中间丝,细胞表面有微绒毛,细胞质内含丰富的细胞器.CoCl_2联合DMEM培养液培养24h后Müller细胞上AQP-4蛋白的表达较对照组明显增加(t=6.74,P＜0.05);AQP-4 mRNA的表达亦明显增加(t=21.79,P＜0.05).结论 缺氧能增强Müller细胞上AQP-4的表达,进而使视网膜内液体的积聚增加.提示Müller细胞在糖尿病视网膜病变(DR)或增生性视网膜病变的视网膜水肿形成过程中起重要作用.     

Nestin在视神经横断大鼠视网膜Müller细胞上的诱导表达

目的:探讨中间丝蛋白nestin在视神经横断大鼠视网膜神经胶质细胞中的表达情况及可能的意义。方法:制作大鼠视神经横断模型,分别于术后1,3,7d取材,制作视网膜矢状位冰冻切片,进行GS/nestin,免疫荧光双标。提取视网膜总RNA行nestin Real-time PCR半定量分析。结果:正常大鼠视网膜中几乎看不到nestin阳性染色。术后1d,在Müller细胞上出现nestin的诱导表达,术后3d,nestin在Müller细胞上的表达进一步增强,术后1wk,nes-tin在Müller细胞上的表达保持在较高水平,Real-time PCR半定量分析与以上结果吻合。结论:视神经横断后nestin在Müller细胞上的诱导表达是Müller细胞对视网膜损伤产生的一种反应,Nestin的表达量在一定时间内与病程进展相一致。Nestin在Müller细胞上的诱导表达尤其在足板处的强烈表达可能对视网膜神经节细胞具有保护作用。     

高糖对体外培养的视网膜Müller细胞表达蛋白转录活化因子4的影响

目的 观察高糖对体外培养的视网膜Müller细胞表达蛋白转录活化因子4(ATF4)的影响.方法 组织块悬浮法体外原代培养Sprague-Dawley(SD)大鼠视网膜Müller细胞,用链酶亲和素生物素过氧化物酶复合物(SABC)法对Müller细胞进行神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及谷氨酰胺合成酶(GS)的鉴定.将培养的视网膜Müller细胞分为正常对照组和A、B、C组,正常对照组使用5.5 mmol/L葡萄糖培养液,A、B、C组分别使用20.0、30.0、40.0 mmol/L葡萄糖培养液进行.培养4d后,蛋白免疫印迹(Western blot)法检测各组视网膜Müller细胞上ATF4蛋白的表达.结果 体外培养的细胞均为视网膜Müller细胞,95％以上细胞染色呈GFAP及GS阳性.A、B、C组视网膜95％的Müller细胞呈阳性.Western blot检测显示,4d后A、B、C组Müller细胞表达ATF4蛋白的量均较正常对照组升高,组间比较,差异有统计学意义(q＝0.293、0.754、0.484,P＜0.05).结论 高糖能促使体外培养下的视网膜Müller细胞表达内质网应激蛋白ATF4增加,高糖培养下的视网膜Müller细胞可发生内质网应激反应.     

乳鼠视网膜细胞诱导骨髓间充质干细胞分化为视网膜神经节样细胞

目的 探讨乳鼠视网膜细胞对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的诱导分化作用.方法 从出生8 d的大鼠骨髓中分离培养BMSCs,同时培养乳鼠视网膜神经细胞.在Transwell双层培养体系下,利用乳鼠视网膜细胞诱导BMSCs,诱导后细胞经RT-PCR及免疫荧光鉴定.结果 加入乳鼠视网膜细胞共培养第7 d有神经元样细胞形成,经nestin、NF、β-III Tubulin、Thy1.1行免疫组织化学、RT-PCR、免疫荧光鉴定,细胞呈阳性反应.结论 BMSCs在体外培养条件下,经过新生乳鼠视网膜细胞诱导,可以分化为视网膜神经节样细胞.     

脂质体介导增强型绿色荧光蛋白基因在鼠视网膜Müller细胞中的表达

目的研究脂质体介导增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因对体外培养的鼠视网膜Müller细胞转染的有效性及安全性。方法采用视网膜组织块法培养鼠视网膜Müller细胞,振荡法分离纯化细胞,并对其进行免疫细胞化学鉴定。用阳离子脂质体Lipofectamine 2000负载pEGFP-N1质粒转染Müller细胞,荧光显微镜检测转染后12、24、48、72h的转染效率。台盼蓝排斥实验检测转染和未转染细胞的活力,明确脂质体Lipofectamine 2000对Müller细胞的毒性作用。结果成功培养视网膜Müller细胞,传代后90%以上的细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色阳性。Lipofectamine 2000介导质粒pEGFP-N1转染Müller细胞后12、24、48、72h的转染效率分别为（9.7±1.9）%、（18.1±16）%、（17.2±2.5）%、（16.9±1.7）%。台盼蓝排斥实验显示Lipofectamine 2000转染前后活细胞率分别为（98.2±5.6）%、（96.1±6.2）%。结论脂质体Lipofectamine 2000可安全有效地介导Müller细胞的转染,为进一步明确Müller细胞的病理、生理功能及靶向Müller细胞的基因治疗提供了新的手段。     

视网膜Müller细胞的研究现状

Müiler细胞是脊椎动物视网膜最重要的胶质细胞,了解其在健康视网膜的生理及功能和在病变视网膜的病理变化,可更好地理解在病变视网膜Müller细胞的胶质反应,探索有效的治疗措施.成年哺乳动物视网膜Müller细胞具有神经干细胞特性,在特定的条件下可能被激活,井受:Notch等一些信号通路的调控.视网膜Müller细胞在维持视网膜正常结构和功能中起重要作用,在病变视网膜中Müller细胞主要表现胶质增多反应,对神经元的功能既有保护又有损害,而Müller细胞的干细胞特性为视网膜神经元再生和对视网膜病变的治疗引出了新方向.     

体外诱导室管膜下区神经干细胞分化为视网膜神经细胞样细胞的研究

目的 研究室管膜下区细胞的体外培养及其诱导分化情况。方法 取新生0—3d的SD乳鼠室管膜下区细胞进行体外培养,同时培养视网膜神经细胞。收集视网膜细胞培养上清液,配制成条件分化液,将培养的室管膜下区细胞接种于视网膜细胞条件分化液中,并对诱导的细胞进行免疫荧光鉴定。结果体外培养的室管膜下区细胞在无血清的培养基中生长良好,接种于SD乳鼠视网膜细胞条件分化液中的室管膜下区细胞可分化为视网膜神经样细胞。应用,Thyl.1单克隆抗体行免疫荧光检查,细胞呈阳性反应。结论 在一定条件下室管膜下区细胞能够于体外培养存活,视网膜细胞条件分化液可定向诱导室管膜下区细胞分化为视网膜神经节细胞样细胞,体外模拟眼内环境行室管膜下区细胞诱导,将为进一步的眼内移植提供理论依据。     

Müller细胞在视网膜损伤中对视神经节细胞影响的研究进展

Müller细胞是视网膜中主要神经胶质细胞,贯穿视网膜全层。尽管近年来针对Müller细胞功能的研究较多,但是Müller细胞和视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)的相互作用关系仍不完全清楚。目前已知生理状态下Müller细胞的许多功能和RGCs密切相关,例如Müller细胞已经证实为神经元祖细胞的来源,调节视网膜细胞间质K⁺水平和谷氨酸代谢,维持视网膜内能量代谢和营养支持等。在视网膜损伤时,Müller细胞相关功能对RGCs的影响也十分重要。因此,本文就此研究进展进行综述,以期为视网膜中视神经的保护治疗提供新的思路。     

豚鼠近视眼视网膜Müller细胞中TGFβ2、VIP、DA的表达

目的 研究转化生长因子β2(TGFβ2)、血管活性肠肽(VIP)和多巴胺(DA)在原代培养的豚鼠近视眼视网膜Müller细胞中的变化.方法 眼罩遮盖诱导豚鼠近视眼,酶消化法原代培养其视网膜Müller细胞,GFAP、Vimentin免疫组织化学染色进行细胞鉴定.Westren blotting检测TGFβ2、VIP、酪氨酸羟化酶(TH)蛋白在正常对照眼、自身对照眼和近视眼视网膜Müller细胞中的表达情况.高效液相色谱-电化学法测定视网膜Müller细胞分泌DA的质量浓度变化.结果 眼罩遮盖14d后,豚鼠遮盖眼眼轴延长,近视形成.酶消化法成功培养出豚鼠视网膜Müller细胞,95%以上的培养细胞阳性表达GFAP和Vimentin.正常对照眼、自身对照眼和遮盖眼视网膜Müller细胞均阳性表达TGFβ2、VIP、TH蛋白,遮盖眼表达TGFβ2和VIP蛋白上调(P＜0.05)、TH蛋白下调(P＜0.05).与正常对照眼、自身对照眼比较,遮盖眼视网膜Müller细分泌DA减少.结论 Müller细胞是视网膜近视信号因子TGFβ2、VIP和DA的一个重要来源.在近视发生过程中Müller细胞可能通过合成、分泌这些近视信号因子,参与近视发生的调控.     

缺氧对视网膜Müller细胞中谷氨酸转运体及未折叠蛋白相关因子XBP1、CHOP表达的影响

目的研究体外缺氧刺激后视网膜Müller细胞是否存在未折叠蛋白反应(unfol-dedprotein reaction,UPR),及其与L-谷氨酸/L-天门冬氨酸转运体(glutamate-aspartatetrans-porters,GLAST)的关系。方法出生3～7d大鼠视网膜组织采用胰蛋白酶消化法培养视网膜Müller细胞,氯化钴(CoCl2)200μmol·L-1对视网膜Müller细胞进行体外缺氧干预,干预时间为0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h;UPR诱导剂二硫苏糖醇(DTT)2mmol·L-1刺激视网膜Müller细胞为阳性对照,干预时间为0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h。采用实时荧光定量PCR检测GLAST与UPR相关因子X盒结合蛋白1、C/EBP同源蛋白的表达并分析其相关性。结果视网膜Müller细胞鉴定:细胞免疫荧光染色示90%以上细胞GS、GLAST表达阳性;流式细胞仪检测结果:Müller细胞的GLAST表达阳性率为(84.66±3.51)%。缺氧刺激后,GLAST与X盒结合蛋白1、C/EBP同源蛋白在Müller细胞上均有表达,缺氧早期呈上升趋势,干预后24h表达最强,后呈下降趋势。DTT干预组表达趋势与缺氧干预组一致。结论体外缺氧刺激后视网膜Müller细胞存在UPR,其相关因子的变化与GLAST的变化趋势一致,提示UPR可能是调控GLAST变化的原因之一。     

视网膜Müller神经胶质细胞的神经再生潜能

神经胶质细胞具有神经干细胞特性,是近年来发育神经生物学的重大发现之一.M üller细胞是视网膜组织中的主要神经胶质细胞,不仅对神经元起到营养支持作用,在视网膜受到损伤时还会发生增殖、去分化,呈现出神经干细胞特性.而深入了解M üller神经胶质细胞的生物学特性,将有利于开展基于Müller细胞的对视网膜疾病的的未来治疗策略的探索.为此,文中对视网膜Müller神经胶质细胞的增殖及其调节机制和M üller神经胶质细胞的干细胞特性的研究现状作简要的概述.