慢病毒介导的RNA干扰沉默Wip1基因对人脑胶质母细胞瘤细胞生长的影响

目的 构建人Wip1基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,有效沉默人胶质瘤U251细胞的Wip1基因并观察其对细胞生长的影响.方法 设计并合成3条Wip1基因特异性RNAi靶序列,构建到慢病毒pFU-GW-iRNA载体中.慢病毒包装转染HEK293T细胞,获得病毒上清并测定其滴度;感染U251细胞,实时定量聚合酶链反应(PCR)及Western blot鉴定RNA干扰效率;筛选出基因沉默效率最高的慢病毒感染U251细胞,CCK-8法检测细胞的增殖,Western blot检测RNA干扰后的bcl-2蛋白表达.结果 PCR扩增和测序表明成功构建Wip1慢病毒干扰载体,病毒载体包装获得的病毒上清滴度在3×10~8～8×10~8 TU/ml.可以有效地沉默U251细胞中Wip1基因的表达,构建的RNAi慢病毒载体感染U251细胞后Wip1基因的mRNA表达量同对照组比较分别为36.3%、32.9%、23.8%.稳定Wip1 RNA干扰后的U251细胞4 d后细胞增殖能力下降35.1%.结论 慢病毒介导的RNA干扰可以高效稳定地沉默基因表达,Wip1基因促进了U251细胞的增殖.     

分化抑制因子1基因对BMP-2促进兔椎间盘软骨终板细胞软骨特性基因表达的影响

目的探讨通过慢病毒干扰细胞分化抑制因子1(inhibitor of differentiation 1,Id1)基因表达,对BMP-2促进兔椎间盘软骨终板细胞软骨特异性基因Ⅱ型胶原、蛋白多糖表达的影响。方法取新西兰大白兔椎间盘软骨终板组织分离培养软骨终板细胞,取第2代细胞进行实验。使用绿色荧光蛋白慢病毒、高表达Id1基因慢病毒及RNA干扰(RNA interference,RNAi)Id1基因慢病毒转染椎间盘软骨终板细胞,采用荧光显微镜、实时荧光定量PCR及Western blot法观察慢病毒转染情况以及对细胞Id1基因和蛋白表达的影响。使用上述慢病毒与BMP-2慢病毒共同转染软骨终板细胞,并设置BMP-2慢病毒转染对照,通过实时荧光定量PCR、ELISA法观察Id1基因表达差异对BMP-2促进椎间盘终板软骨细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白多糖的影响。结果慢病毒转染对细胞形态无明显影响,高表达Id1基因和RNAi Id1基因慢病毒能有效转染软骨终板细胞,并干扰内源性Id1基因的表达。BMP-2慢病毒和高表达Id1基因慢病毒共同转染软骨终板细胞后,Ⅱ型胶原、蛋白多糖基因表达和蛋白合成均显著高于BMP-2慢病毒、高表达Id1基因慢病毒单独转染,差异有统计学意义(P0.05)。Id1基因表达下降后,软骨终板细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖合成明显下调(P0.05)。结论 Id1基因表达上调能协同BMP-2促进软骨终板细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖表达。     

重组抗基因RNA与铁蛋白基因双启动子慢病毒表达载体的构建

目的 构建共表达抗基因RNA与铁蛋白基因的双启动子慢病毒载体.方法 将铁蛋白重链基因构建入线性化的慢病毒载体pGC-FU,以获得中间质粒pGC-FU-HF;进而将具有基因沉默效应的β-arrestin2抗基因RNA构建人中间质粒,以获得目的质粒pGC- agRNA- HF;通过病毒的包装和浓缩,应用Realtime PCR法检测重组慢病毒的滴度,应用NG108-15细胞,采用Western blot和实时定量PCR检测抗基因RNA的基因沉默效应和铁蛋白的表达.结果 抗基因RNA与铁蛋白均成功构建入慢病毒表达载体,病毒滴度2.00×109 TU/ml,该病毒转染NG108-15细胞后,β-arrestin2表达下调,铁蛋白表达上调.结论 成功构建了表达抗基因RNA与铁蛋白基因的双启动子慢病毒载体.     

人生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1基因重组慢病毒RNA干扰载体的构建及鉴定

目的 探讨构建人类生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1(Gab1)基因重组慢病毒RNA干扰载体的方法,研究其对人脐静脉血管内皮细胞株EA.hy926的沉默效率.方法 针对人类Gab1基因设计5个靶点的小干扰RNA (siRNA)序列,并分别合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Hpa I和Xho I限制性内切酶双酶切后的GV118载体连接,产生Gab1-RNA干扰(RNAi)转化子,聚合酶链反应(PCR)筛选阳性克隆并进行测序鉴定.将测序正确的Gab1-RNAi、pHelper 1.0和pHelper 2.0质粒共转染239T细胞,包装产生LV-Gab1-RNAi慢病毒并测定其滴度.将获得的慢病毒分别转染EA.hy926细胞,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,测定其转染效率;通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后的EA.hy926细胞中Gab1 mRNA表达水平来验证慢病毒干扰载体的基因沉默效率.结果 经PCR分析和测序证实,成功构建LV-Gab1-RNAi慢病毒载体;病毒滴度为3×109 TU/ml;荧光显微镜下转染组细胞GFP荧光表达强烈,转染效率达70％以上;RT-PCR证实干扰组细胞Gab1 mRNA表达水平(0.088 ±0.003)较对照(0.947±0.087)组和空白组(0.999±0.067)显著降低(P＜0.01).结论 成功构建人Gab1基因RNAi慢病毒载体并能在293T细胞中扩增获得足够的病毒滴度,能明显抑制Gab1基因在EA.hy926细胞株中的表达.     

慢病毒介导的NOB1基因沉默对人结肠癌细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨RNA干扰技术沉默人NOB1基因对人结肠癌RKO细胞增殖和凋亡的影响。方法设计靶向NOB1基因的小干扰RNA（siRNA）,构建NOB1基因特异性的RNA干扰慢病毒载体,感染RKO细胞,并设置阴性对照组。实时定量PCR和Westemblot分别检测两组细胞NOB1mRNA及蛋白的表达情况;CellomicsArrayScanVTIHCS高内涵分析仪检测感染细胞的增殖和克隆形成能力;流式细胞术检测细胞周期及凋亡的变化：裸鼠成瘤实验检测0NOB1-siRNA对肿瘤的抑制作用。结果NOB1-shRNA慢病毒感染RKO细胞3d后．与阴性对照组比较．NOB1mRNA和蛋白的表达明显降低,克隆形成数减少,而细胞凋亡数增加（均P〈0．05）。裸鼠成瘤实验结果显示,NOB1．shRNA感染组裸鼠移植瘤体积为（405±102）mm3,小于阴性对照组的（870±165）mm3（P〈0．05）。结论通过RNA干扰方式沉默NOB1基因的表达．有望作为抑制结肠癌发展的有效手段。     

人胸腺素β4 RNA干扰载体的构建及其对293T细胞目的基因表达的影响

目的探讨人胸腺素β4（thymosin β4,TMSB4）基因RNA干扰慢病毒载体的构建,观察病毒感染293T细胞后TMSB4 mRNA和蛋白表达,为进一步研究TMSB4基因的功能提供基础。方法设计特异性干扰人TMSB4基因的小发卡RNA序列,合成含有干扰序列的双链DNAoligo,与经AgeI和EcoRI双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生慢病毒载体。转化感受态大肠杆菌DH5a并对阳性克隆进行PCR扩增测序鉴定。慢病毒载体、包装系统质粒共转染包装细胞293T细胞,产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度。将获得的慢病毒感染293T细胞,分别采用实时定量PCR和免疫细胞化学染色方法观察TMSB4 mRNA和蛋白的表达情况,利用生成的TMSB4 shRNA慢病毒感染原代成纤维细胞。结果感染重组慢病毒的293T细胞与空病毒转染阴性对照细胞的TMSB4 mRNA表达分别为0.56±0.11和1.00±0.06（P=0.0006）,实验组细胞的敲减率为44%。实验组TMSB4蛋白表达水平0.042±0.007比阴性对照组细胞0.093±0.009的表达降低55%（H=461.342,P〈0.001）。感染重组慢病毒的原代培养的成纤维细胞与空病毒转染的对照细胞相比,TMSB4蛋白表达水平亦明显降低。结论TMSB4基因干扰慢病毒构建成功并能显著降低TMSB4基因和蛋白在293T细胞中的表达,成功感染原代成纤维细胞使其目的基因蛋白减少,为进一步研究TMSB4基因的功能奠定研究基础。     

siRNA沉默HER2对人胰腺癌细胞PANC-1侵袭能力的影响

目的:探讨慢病毒介导的siRNA沉默HER2对人胰腺癌细胞株PANC-1侵袭能力的影响。方法:运用HER2基因小干扰RNA(siRNA)的重组慢病毒稳定转染PANC-1细胞,荧光定量RT-PCR和Western blotting观察HER2 mRNA和蛋白表达的改变,体外侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化。结果:HER2基因小干扰RNA的重组慢病毒稳定转染PANC-1细胞可显著抑制HER2 mRNA和蛋白表达;体外侵袭实验显示siRNA沉默HER2后,PANC-1细胞侵袭能力明显下降。结论:HER2基因小干扰RNA的重组慢病毒能有效抑制HER2的表达,抑制胰腺癌细胞体外侵袭能力。siRNA沉默HER2可能为预防和治疗胰腺癌的侵袭转移提供一种新的策略。     

人CCL5基因RNA干扰慢病毒载体的构建

目的 构建人CCL5基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体.方法 根据人CCL5基因信息,构建4个携带RNAi序列的pGCSIL-GFP质粒,与pHelper 1.0、Helper 2.0质粒一起利用293T细胞进行慢病毒包装.用CCL5 RNAi慢病毒载体感染人宫颈癌细胞(Hela),使用RT-PCR方法验证其干扰效率.结果 4个靶点中有3个靶点(a1、a2、a3)在Hela细胞上对CCL5基因的表达都有非常显著的敲减效果,敲减效率均达到95%以上.结论 构建的CCL5 RNAi慢病毒载体在Hela细胞中有较高的敲减效率,提示RNAi技术能够使细胞CCL5基因沉默.     

介导大鼠Ppif基因沉默的慢病毒载体转移质粒的构建及鉴定

目的：构建介导大鼠Ppif基因沉默的慢病毒载体转移质粒pGCL-Ppif,为进一步包装慢病毒载体奠定基础.方法：以大鼠Ppif基因为靶基因,根据RNA干扰（RNAi）序列设计原则,设计4对有小发夹结构的RNAi靶点序列,退火形成双链DNA,双酶切后定向克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-Ppif中,构建4个含靶基因片段的重组慢病毒载体转移质粒pGCL-Ppif,并对质粒进行PCR及测序鉴定.结果：Ppif的短发夹RNA（shR-NA）片段被成功克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-GFP中,4对插入序列与设计的靶基因片段完全一致.结论：构建了能够表达4个含Ppif靶基因片段的慢病毒载体转移质粒,为进一步包装介导Ppif基因沉默的慢病毒载体奠定了基础.     

慢病毒介导的Clusterin基因沉默抑制膀胱癌EJ细胞增殖及转移

目的探讨慢病毒介导的Clusterin(CLU)基因沉默的RNA干扰效果及其对膀胱癌EJ细胞增殖和转移的影响。方法构建靶向CLU基因的慢病毒干扰载体,用Westernblot检测其对膀胱尿路上皮癌细胞株EJ的干扰效果,用MTT、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验等方法分别检测CLU沉默后膀胱癌EJ细胞在增殖、侵袭和转移等方面的细胞生物学改变。结果靶向CLU基因的慢病毒干扰载体感染膀胱癌EJ细胞后,CLU基因在蛋白水平的表达明显下降。EJ细胞的增殖、侵袭和转移能力均受到抑制。结论 CLU慢病毒干扰载体可有效沉默膀胱癌EJ细胞内源性CLU基因,抑制膀胱癌EJ细胞的增殖、侵袭和转移。     

携带ROCK2基因siRNA有效片段的慢病毒载体的筛选

目的:筛选能够显著抑制自发性高血压大鼠(SHR)阴茎海绵体平滑肌细胞内ROCK2基因表达的携带ROCK2基因siRNA的慢病毒载体。方法:设计并合成4个靶向ROCK2的siRNA片段,构建并包装成慢病毒载体。随机将5只SHR阴茎海绵体平滑肌细胞分为6组,每组每个样本3×104个细胞,每组5个样本,分别为:A组(未转染对照组)、B组(携带慢病毒转染组)、C~F组(分别携带靶向ROCK2基因siRNA 1~4号靶点的慢病毒转染组),以感染复(MOI)=80转染SHR阴茎海绵体平滑肌细胞,转染后48 h荧光显微镜下观察细胞GFP表达情况,并用RT-PCR检测各组被转染细胞ROCK2 mRNA的表达。结果:荧光显微镜下观察各组细胞转染效率均50%。与A组相比,B组ROCK2 mRNA的表达无明显改变(P﹥0.05);C、D、F组SHR阴茎海绵体平滑肌细胞ROCK2基因mRNA的表达较A组极显著下降(P0.01),抑制效率分别达到(43.91±8.19)%、(47.15±6.64)%、(25.7±6.03)%;E组SHR阴茎海绵体平滑肌细胞ROCK2基因mRNA的表达较A组显著下降(P0.05),抑制效率为(16.81±5.94)%。结论:本研究构建的4种携带ROCK2基因的siRNA慢病毒载体均能够显著抑制SHR阴茎海绵体平滑肌细胞内ROCK2基因的表达,其中有1种慢病毒载体抑制作用最强。     

联合转染Livin和Survivin shRNA表达载体对肝癌HepG2细胞生物学行为的影响

目的:分别构建Livin、Survivin基因短发夹RNA(shRNA)真核表达载体,探究联合转染Livin和Survivin真核表达载体对肝癌HepG2细胞生物学行为的影响。方法:分别设计并构建针对Livin、Sur-vivin基因shRNA真核表达载体pSD11-Livin和pSD11-Survivin,脂质体法单独或联合转染肝癌HepG2细胞,分空白对照组、质粒对照组、Survivin组、Livin组和共转染组。荧光定量PCR、Western blot分别检测Livin、Survivin mRNA及蛋白的相对表达量,MTT法检测细胞增殖的变化,TUNEL法检测细胞凋亡率。结果:针对Livin、Survivin基因的shRNA真核表达载体构建成功。共转染组Livin、SurvivinmRNA相对表达量分别为0.120±0.022、0.325±0.125,与单独转染组相比显著降低(P<0.05);共转染组Livin、Survivin蛋白相对表达量分别为0.412±0.099、0.473±0.051,与单独转染组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。共转染组转染后48、60、72 h细胞生长抑制率均显著高于单独转染组(P<0.05),转染后48 h细胞凋亡率明显上升(P<0.05)。结论:针对Livin、Survivin基因的shRNA真核表达载体构建成功。联合转染pSD11-Livin和pSD11-Survivin更有效地降低了Livin和Survivin基因在HepG2细胞中的表达,更显著地抑制了肝癌细胞的增殖,促进了肝癌细胞的凋亡。     

前列腺癌组织中分化抑制蛋白1相互结合蛋白的分离

目的:分离前列腺癌组织中细胞分化抑制蛋白1(Id1)的相互结合蛋白,以探讨Id1在前列腺癌中的作用途径和机制。方法:首先构建PolyHis-Id1的表达载体pET-28a/Id1,并在大肠埃希菌BL21中进行诱导表达,然后采用牵出试验钓取前列腺癌组织中的Id1相互结合蛋白。结果:蛋白电泳并染色后发现一清晰蛋白条带,用活化转录因子3抗体经Western印迹尝试检测发现其确为活化转录因子3。结论:在人前列腺癌组织中,Id1可能与活化转录因子3相互结合发挥效应。     

大鼠树突状细胞CD86分子小干扰RNA慢病毒载体构建及鉴定

目的 筛选构建针对大鼠树突状细胞表面共刺激分子CD86的小干扰RNA(siRNA)慢病毒载体.方法 设计针对CD86基因的4条siRNA序列及1条阴性对照序列,分别构建慢病毒载体,与包含CD86基因序列的质粒共转染293T细胞,Western blot检测CD86分子表达,确定最佳siRNA序列.结果 Western blot方法显示,在所选4条siRNA序列中以2号序列抑制效果最为明显,且成功构建了siRNA慢病毒载体.结论 成功构建了针对CD86分子的siRNA慢病毒载体,为该病毒的功能研究及体内实验奠定了基础.     

EphA3通过调控VEGF参与肝癌细胞侵袭的机制

目的探讨促红细胞生成素肝细胞受体A3（EphA3）参与肝癌细胞侵袭的作用机制。方法培养人肝细胞HL-7702和肝癌细胞株HepG2和NHCC97H。采用siRNA干扰的方法抑制肝癌细胞中EphA3的表达。设立未处理组（未处理肝癌细胞）,对照组（加入对照siRNA）和siRNA干扰组（加入siRNA干扰EphA3）。用RT-PCR和Westernblot法检测EphA3的表达;用Transwell小室检测不同处理后的HepG2和MHCC97H细胞的侵袭能力;采用Westernblot和ELISA法检测VEGF蛋白表达和活力的变化情况。多组比较采用单因素方差分析,组间比较采用LSD—f检验。结果HL-7702、HepG2和MHCC97H中EphA3mRNA的相对表达量分别为0．94±0．13、1．76±0．16和3．62±0．14;EphA3蛋白的相对表达量分别为0．96±0．12、1．59±0．11和3．82±0．11,非肿瘤细胞与肝癌细胞中EphA3表达比较,差异有统计学意义（t=2．511,6．437;2．321,6．895,P〈0．05）。RT—PCR法检测HepG2细胞系中未处理组、对照组、siRNA干扰组EphA3mRNA的相对表达量分别为0．95±0．11、0．96±0．12和0．31±0．15,siRNA干扰组与对照组比较,差异有统计学意义（t=4．051,P〈0．05）;MHCC97H细胞中EphA3mRNA的相对表达量分别为0．97±0．16、0．95±0．14和0．40±0．11,siRNA干扰组与对照组比较,差异有统计学意义（t=5．237,P〈0．05）;Westernblot法检测3组HepG2细胞中EphA3蛋白的相对表达量分别为0．97±0．16、0．95±0．15和0．32±0．17,siRNA干扰组与对照组比较,差异有统计学意义（t=4．145,P〈0．05）;MHCC97I-I细胞中EphA3蛋白的相对表达量分别为0．95±0．11、0．96±0．12和0．38±0．17,siRNA干扰组与对照组比较,差异有统计学意义（t=4．327,P〈0．05）。采用体外侵袭实验,检测3组穿透的细胞数量,HepG2细胞系细胞数量分别为（111±4）个／10HPF、（109±5）个／10HPF和（51±3）个／IOHPF,siRNA干扰组与对照组比较,差异有统计学意义（t=7．582,P〈0．05）;MHCC97H细胞系细胞数量分别为（402±6）个／10HPF、（397±7）个／10HPF和（152±7）个／10HPF,siRNA干扰组与对照组比较,差异有统计学意义（t=9．479,P〈0．05）。Westernblot法检测HepG2细胞系中3组VEGF蛋白的相对表达量分别为0．98±0．11、0．96±0．13和0．57±0．11,siRNA干扰组与对照组比较,差异有统计学意义（t=3．167,P〈0．05）;Westernblot法检测MHCC97H细胞系中3组VEGF蛋白的相对表达量分别为0．97±0．14、0．98±0．12和0．34±0．15,siRNA干扰组与对照组比较,差异有统计学意义（t=4．278,P〈0．05）。ELISA法检测HepG2细胞系中3组VEGF蛋白的相对活力OD值分别为0．96±0．15、0．94±0．11和0．47±0．13,siRNA干扰组与对照组比较,差异有统计学意义（t=3．981,P〈0．05）;NHCC97H细胞中VEGF蛋白的相对活力OD值分别为n98±0．12、0．97±0．12和0．38±0．14,siRNA干扰组与对照组比较,差异有统计学意义（t=4．059,P〈0．05）。结论EphA3可能是通过调控VEGF蛋白表达和活性来实现肝癌细胞的侵袭,提示EphA3可作为肝癌治疗的新靶点。     

人膀胱癌bcl-2-siRNA慢病毒载体的构建及稳定转染细胞株的建立

目的 构建表达人膀胱癌bcl-2基因的小分子RNA(siRNA)的慢病毒载体并建立稳定转染细胞株.方法 根据GenBank提供的bcl-2 cDNA序列,设计3条针对bcl-2 siRNA序列,分别构建pSIH1-H1-copGFP重组质粒.筛选出最有效沉默靶基因的siRNA后,将携带目的 序列的慢病毒载体转染到293T细胞中,感染膀胱癌细胞株T24,建立稳定转染细胞株.结果 设计的针对bcl-2的序列中第3条的抑制效果最好,下调59.0%.以此目的 序列构建稳定转染细胞株,对bcl-2 mRNA抑制率达65.6%,对bcl-2蛋白的抑制率高达74.5%.结论 成功构建表达人膀胱癌bcl-2-siRNA的慢病毒载体,它能有效沉默bcl-2基因在膀胱癌细胞株T24中的表达并建立了稳定转染细胞株.

Abstract：

Objective To obtain small interfering RNA (siRNA) sequences that can stably block the expression of bcl-2 in the bladder cancer cells, construct the bcl-2-siRNA lentiviral vector and establish a stably transfected cell line. Methods According to genetic information, 3 siRNA targeting bcl-2 were designed. The corresponding pSIH1-H1-copGFP recombinant plasmids were constructed. After the most effective siRNA was achieved, the shuttle plasmid pSIH-bcl-2-siRNA with lentiviral packaging plasmid was mixed, and 293T cells were transfected. Virus solution was collected to infect T24 cells and a stably transfected cell line was established. Results The third siRNA sequence, located in bcl-2 1210-1228, showed the best gene silencing effect as 59. 0%. The lentiviral vector was constructed successfully and the inhibition ratio was 65. 6% for bcl-2 mRNA and 74. 5% for bcl-2 protein. Conclusion It is successful to obtain bcl-2-siRNA lentiviral vector that can stably block the expression of bcl-2 in the bladder cancer cell line T24 and establish a stably transfected cell line which provides foundation for further experimental studies on the function of bcl-2.     

RNA干扰阻断OX40/OX40L共刺激通路对CD4+CD25+T调节细胞的影响

目的 探讨慢病毒介导的RNA干扰技术诱导小鼠树突状细胞OX40L基因沉默对调节性T细胞的影响. 方法 设计针对小鼠OX40L基因的RNA于扰序列,通过外源筛靶筛选出干扰效果最佳的序列.以293T为包装细胞,制备含OX40L的siRNA序列的慢病毒载体OX40L-RNAi-LV和阴性对照载体NC-GFP-LV.采用磁式分选器分离培养骨髓来源的小鼠树突状细胞(DCs),以MOI为25进行转染,分别将转染OX40L-RNAi-LV(实验组)、转染NC-GFP-LV(阴性对照组)和未转染(空白对照组)的DCs与磁式分选器分选得到的CD4+CD25+T调节细胞共培养,6 d后通过流式细胞仪检测T调节细胞的增殖和凋亡情况. 结果外源筛靶筛选出干扰效果最佳的RNA干扰序列(靶序列为GCTCATACAAGAATGAGTA),OX40L蛋白表达的抑制率为73.1%.感染复数为25时,慢病毒载体感染DCs的效率为86.4%.DCs与CD4+CD25+T调节细胞共培养后,实验组的凋亡细胞比例为8.7%,显著低于阴性对照组(20.1%)和空白对照组(19.8%),F=244.22,P=0.000;而增殖细胞前体频率为38.3%,明显高于阴性对照组(24.5%)和空白对照组(22.9%),F=95.40,P=0.000.结论 小鼠OX40L的siRNA慢病毒载体可以有效降低树突状细胞OX40L的表达,对体外培养的CD4+CD25+T调节细胞具有显著地促进增殖、减少凋亡的作用.     

人VEGF基因慢病毒介导RNA干扰有效靶点的设计及筛选

目的:设计并筛选人血管内皮生长因子(VEGF)有效RNA干扰片段,构建VEGF慢病毒表达载体。方法:对人VEGF基因编码区分析,筛选序列3条,阴性对照序列l条,通过连接线性化的plenti6.3-MIR载体,构建miRNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5α,进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒,测定其滴度。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L,用Real-time PCR检测干扰效果。结果:测序证实3个VEGF基因RNAi慢病毒载体质粒构建成功。慢病毒载体经293T细胞包装成功,测定病毒的滴度分别为3.23×109、3.30×109、3.73×109TU/mL。3个慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L后,VEGF基因在mRNA水平受到抑制,其中miR-200序列效果最佳,对VEGF基因表达的干扰效率可达72%。结论:成功构建并筛选了人VEGF基因RNAi慢病毒载体及有效靶点,为进一步深入研究VEGF基因与抗肿瘤药物药效关系提供实验基础。     

大鼠树突状细胞CD86分子小干扰RNA慢病毒载体构建及其功能

目的 观察针对大鼠树突状细胞(DCs)表面共刺激分子CD86的小干扰RNA(siRNA)慢病毒载体转染骨髓来源大鼠DCs后,CD86分子mRNA水平变化及DC刺激T淋巴细胞增殖能力的变化.方法 将针对大鼠DCs表面共刺激分子CD86的siRNA慢病毒载体转染骨髓来源大鼠DCs,逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)方法 检测CD86分子mRNA水平,MLR检测转染后的树突状细胞刺激T淋巴细胞增殖能力的变化.结果 转染组CD86分子mRNA水平较未转染组及阴性对照组有明显下降.MLR中各实验组DC与细胞1:1、1:10、1:50混合72 h后492 nm吸光度值分别为,未转染组:0.876±0.117、0.582±0.085、0.472±0.034;阴性对照组:0.870±0.140、0.541±0.066、0.438±0.067;转染组:0.394±0.143、0.294±0.032、0.218±0.015.表明转染后的DCs刺激T淋巴细胞增殖的能力较未转染组及阴性对照组显著降低.结论 实验所用针对CD86分子的siRNA慢病毒载体,可以特异性的抑制大鼠树突状细胞CD86基因的表达,降低树突状细胞对T淋巴细胞的刺激增殖能力.