口腔癌相关成纤维细胞的分离培养及初步鉴定

目的　对口腔癌相关成纤维细胞 (CAFs)进行分离、培养、纯化并作初步鉴定。方法①用组织块培养法获得原代口腔CAFs和口腔黏膜正常成纤维细胞 (NFs) ,0 .2 5 %胰蛋白酶消化传代 ,联合采用机械刮除法和酶消化法纯化细胞 ;②通过形态学观察和多种蛋白的免疫组化染色 ,对口腔CAFs进行初步鉴定。结果　①获得第 3代纯化口腔CAFs;②口腔CAFs呈长梭形 ,胞质突减少 ,细胞大小不一致 ,生长密集 ,排列紊乱。电镜下可见肌丝和电子致密斑等超微结构 ;③口腔CAFs的细胞角蛋白免疫组化染色呈阴性 ,波形蛋白、α 平滑肌动蛋白、基质金属蛋白酶 2染色呈阳性。结论CAFs与NFs相比 ,在形态结构、生长方式、蛋白表达等方面差异均有显著性 ,推测口腔肿瘤 宿主界面微环境可能是其重要的影响因素     

人口腔癌相关成纤维细胞的分离培养及鉴定

目的：分离培养及鉴定口腔癌相关成纤维细胞（ CAFs）,为探究CAFs可能在肿瘤微环境促进口腔癌细胞的侵袭转移中发挥重要作用奠定基础。方法：用组织块培养法和酶消化法分离培养、纯化原代口腔癌相关成纤维细胞CAFs和口腔黏膜正常成纤维细胞（ NFs）;细胞免疫荧光技术及免疫蛋白印迹法对口腔CAFs和NFs进行鉴定。结果：口腔CAFs和NFs分离培养成功,口腔CAFs呈长梭形,达到一定密度时呈多层生长,排列紊乱;NFs呈多胞质突的扁平星状,无重叠生长现象,排列有一定方向性。上皮标志物细胞角蛋白18（ CK18）免疫荧光染色在口腔CAFs和NFs均呈阴性,间质标志物波形蛋白（ Vimentin）染色均呈阳性。α?平滑肌动蛋白（α?SMA）、成纤维细胞特异性蛋白?1（FSP?1）,成纤维细胞激活蛋白（FAP）、血小板衍生生长因子受体α（ PDGFR?α）在CAFs染色呈阳性,而在NFs中染色呈阴性。结蛋白（ Desmin）在CAFs和NFs中染色均呈阳性。蛋白表达水平上,相对于NFs,CAFs中α?SMA、PDGFR?α蛋白表达呈升高趋势,FSP?1呈下降趋势,而FAP、Desmin在 NFs和CAFs中表达无明显差异。结论：CAFs与NFs相比,在形态结构、生长方式、蛋白表达等方面均有明显差异。     

口腔癌相关成纤维细胞对舌癌细胞株侵袭特性的影响

目的 采用重建基底膜细胞侵袭实验,研究直接分离自舌癌组织旁的癌相关成纤维细胞（CAFs）对舌癌细胞株侵袭特性的影响,探讨CAFs在口腔鳞癌发展中的作用。方法 以Matrigel模拟重建基底膜,采用Transwell小室建立口腔CAFs与舌癌细胞株Tca8113的交互作用模型,观测CAFs对Tca8113侵袭特性的影响。结果 与正常成纤维细胞（NFs）相比,CAFs能促使更多的Tca8113细胞穿透Matrigel（P<0.05）。结论 口腔CAFs能促进舌癌细胞株Tca8113
的侵袭,在口腔鳞癌发展中起重要作用。     

口腔癌相关成纤维细胞对舌癌细胞株细胞外信号调节激酶通路的影响

目的研究口腔癌相关成纤维细胞（CAFs）对舌癌细胞株细胞外信号调节激酶（ERK）通路的影响。方法以口腔CAFs条件培养基刺激舌癌细胞株Tca8113和将Tca8113细胞与口腔CAFs共同培养,采用Western杂交检测特定时间Tca8113细胞总ERK和总pERK的表达。结果Tca8113细胞经口腔CAFs条件培养基刺激或与口腔CAFs共同培养后,总pERK的表达迅速增加,总pERK与总ERK的比值增加。结论口腔CAFs对癌细胞ERK通路有活化作用。     

口腔癌相关成纤维细胞的体外生物学行为研究

目的探讨口腔鳞癌中癌相关成纤维细胞(carcinoma associated fibroblasts,CAFs)的体外生物学行为。方法组织块贴壁法培养CAFs及牙龈正常成纤维细胞(normal fibrolasts,NFs);通过形态观察,免疫组化染色,细胞增殖活性、贴壁率、迁移能力等测定,比较两种细胞的生物学行为差异。结果与NFs相比,CAFs特征性表达成纤维激活蛋白(fibroblast activation protein,FAP)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及基质金属蛋白酶-2(matrix metalloprotease-2,MMP-2),具有更高的增殖活性、贴壁率及迁移能力(P<0.05)。结论口腔癌CAFs特征性表达相关蛋白,体外增殖、粘附、迁移能力均高于NFs。     

口腔癌相关成纤维细胞的特殊体外行为研究

目的 探讨口腔颊癌中癌相关成纤维细胞(Carcinoma Associated Fibroblasts,CAFs)的特殊体外生物学行为。方法 组织块贴壁法培养CAFs及正常颊黏膜成纤维细胞(Normal Fibrolasts,NFs);通过体外生长形态观察,增殖、粘附行为差异的区别,比较两种细胞的生物学行为差别。结果 与NFs相比,CAFs均具有更高的增殖活性、贴壁率及迁移能力(P<0.05)。结论口腔癌CAFs的体外增殖、粘附能力均高于NFs,这或许提示其在口腔癌的侵袭、转移中发挥了重要的作用。     

肿瘤相关成纤维细胞对口腔鳞癌细胞生长和迁移的影响

目的：研究肿瘤相关成纤维细胞（ cancer associated fibroblasts, CAFs）对口腔鳞癌细胞生物学行为的影响,初步探讨CAFs在口腔鳞癌发生发展中的作用。方法采用原代培养的方法,培养口腔鳞癌相关成纤维细胞,光学显微镜观察其形态,免疫组化和免疫印迹实验进行鉴定,CCK-8法检测细胞的增殖能力。 transwell迁移实验检测CAFs诱导口腔鳞癌细胞迁移的能力;萤火虫荧光素酶报告系统检测CAFs对肿瘤细胞增殖能力的影响;平板克隆形成实验评价 CAFs对肿瘤细胞克隆形成能力的影响。结果成功分离培养出口腔鳞癌来源的 CAFs。CAFs能促进口腔鳞细胞的迁移、增殖和克隆形成等生物学行为。结论 CAFs能显著影响口腔鳞癌的增殖和迁移,表明其在口腔鳞癌的发生发展中发挥着一定的作用。     

口腔癌相关成纤维细胞对人淋巴管内皮细胞增殖、迁移、侵袭、成管的影响

目的 研究口腔癌相关成纤维细胞（CAFs）在口腔鳞状细胞癌淋巴管生成过程中的作用。方法 通过组织块法分离、培养口腔鳞状细胞癌患者的CAFs和正常成纤维细胞（NFs）,免疫组织化学染色鉴定CAFs和NFs。利用24孔的transwell细胞培养室分别将CAFs（实验A组）、NFs（实验B组）与人淋巴管内皮细胞（HLEC）共培养,以DMEM高糖培养基作为空白对照组,在倒置相差显微镜下观察各组HLEC的增殖、迁移、侵袭、成管能力。结果 培养96、144、192 h,实验A组HLEC的数目均多于实验B组和空白对照组,实验B组多于空白对照组（P<0.01）。培养96 h后,实验A组HLEC的迁移和侵袭数目均多于实验B组和空白对照组,实验B组多于空白对照组（P<0.01）。培养24 h后,实验A组HLEC的成管数目多于实验B组和空白对照组,实验B组多于空白对照组（P<0.01）。结论 口腔CAFs促进了HLEC的增殖、迁移、侵袭和成管作用,并且CAFs的促进作用大于NFs。     

口腔鳞癌细胞系KB和Tca8113中的SP细胞含量分析

目的探讨两种口腔鳞状细胞癌细胞系KB和Tca8113中的侧群细胞的含量,寻找口腔鳞癌肿瘤干细胞存在的依据。方法采用有限稀释法对口腔鳞癌细胞系KB和Tca8113细胞株经Hoechst 33342/碘化丙啶（propidium iodide,PI）双染色后,采用流式细胞仪测定,分析两细胞株中侧群细胞的含量。结果口腔鳞癌细胞系KB和Tca8113中具有不同的表型,即侧群细胞和非侧群细胞。在体外培养中,KB和Tca8113细胞株中侧群细胞含量分别为0.6%和2.3%。经维拉帕米阻断后,侧群细胞含量均明显降低,分别降为0和0.1%。结论 KB和Tca8113细胞株中均存在侧群细胞,但含量较少。     

高迁移率族蛋白N2抑制口腔鳞状细胞癌增殖作用的体外研究

目的 以人口腔鳞状细胞癌细胞株Tca8113为实验模型,初步探讨高迁移率族蛋白N2（HMGN2）抗口腔鳞状细胞癌的作用。方法 大量培养重组人HMGN2表达载体大肠杆菌BL21,用异丙基-1-硫代-β-呋喃半乳糖苷（IPTG） 诱导HMGN2的表达,产物用B-PER GST Fusion Protein Purification Kit进行纯化。在细胞培养基中加入不同质量浓度的HMGN2,通过MTT、Hoechst 33342荧光染色、流式细胞术和Western-blot法检测其凋亡效果及抗凋亡的分子机制。结果 经MTT检测证明HMGN2能显著抑制Tca8113细胞的生长,通过Hoechst 33342荧光染色、流式细胞术和 Western-blot检测证明HMGN2能使Tca8113的细胞形态发生改变,并且能使Tca8113细胞阻滞于细胞周期的S期,促进Tca8113细胞凋亡。结论 HMGN2可以促进人口腔鳞状细胞癌细胞的凋亡。     

癌相关成纤维细胞对人舌鳞状细胞癌上皮-间质转化的影响

目的:探讨癌相关成纤维细胞(CAFs)对舌鳞癌细胞侵袭、转移的作用及可能机制。方法:应用胶原酶消化法原代分离舌癌相关成纤维细胞及对应正常成纤维细胞(NFs),采用Western免疫印迹、ELISA、激光共聚焦和实时定量PCR分别检测vimentin、cytokeratin、α-SAM和SDF1蛋白质及mRNA水平表达差异。以舌鳞状细胞癌SCC9为研究对象,建立共培养体系,采用Western免疫印迹、激光共聚焦和实时定量PCR检测SCC9中上皮-间质转化标志蛋白E-cadherin、vimentin和fibronectin及其mRNA水平的变化,Transwell实验检测细胞侵袭、迁移能力。采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析。结果:胶原酶消化法成功获取CAFs及对应NFs,CAFS和NFs均表达vimentin,不表达cytokeratin。其中,CAFs高表达α-SAM并分泌SDF1(P<0.01)。与SCC9共培养2周后,SCC9呈梭形改变,E-cadherin表达降低,vimentin和fibronectin升高(P<0.01),同时其迁移能力增强。结论:胶原酶消化法能成功获取原代CAFs。CAFs可通过诱导SCC9上皮-间质转化进而促进其侵袭、转移。     

肿瘤相关成纤维细胞促进舌鳞癌细胞上皮间质转化

目的：检测舌鳞癌组织中肿瘤相关成纤维细胞是否诱导舌癌细胞的上皮间质转化。方法：通过体外原代培养舌鳞癌组织肿瘤相关成纤维细胞的培养上清作用于舌鳞癌细胞系Tca8113,通过检测细胞形态确认肿瘤细胞是否发生上皮间质转化。利用实时定量PCR及免疫印迹检测舌鳞癌细胞上皮标志及间质标志物表达。利用TGF-β/Smad信号通路阻断剂探究TGF-β在此过程的作用。结果：肿瘤相关成纤维细胞促进Tca8113的上皮间质转化。利用实时定量PCR检测及免疫印迹发现肿瘤相关成纤维细胞可以明显促进Tca8113细胞的Vimentin的表达。SB431542,TGF-β/Smad信号通路特异性阻断剂可明显阻断肿瘤相关成纤维细胞条件培养基对Tca8113上皮间质转化的诱导作用。结论：舌鳞癌组织中的肿瘤成纤维细胞可通过诱导舌鳞癌细胞的上皮间质转化促进舌鳞癌细胞的迁移及侵袭,可能在肿瘤发展过程发挥重要作用。     

Separation, cultivation and biological characteristics of oral carcinoma-associated fibroblasts

OBJECTIVES: Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) have been suggested to regulate the initiation and progression of many types of solid tumors. The aim of the study was to separate, cultivate, identify oral CAFs, and to investigate their biological characteristics. MATERIALS AND METHODS: The primary CAFs and normal fibroblasts (NFs) of the tongue were obtained by tissue culture. Then cells were dissociated by 0.25% trypsin and purified by curettage method combining with trypsinization. The cells were verified according to morphological observation and immunohistochemical staining of certain proteins. Multiple proliferation indexes and karyotype of the cells were assayed. RESULTS: Third passage purified oral CAFs and NFs were attained successfully. The morphological characteristics of the CAFs changed significantly comparing to the NFs. The CAFs showed positive staining for vimentin, alpha-smooth muscle actin and matrix metalloproteinases-2. The proliferation and mitosis ability of the CAFs were significantly increased compared with the NFs (P < 0.05). No karyotypic abnormalities were found in the CAFs. CONCLUSIONS: There were obvious differences in the biological characteristics between oral CAFs and NFs. The results may provide us an experimental foundation for further studies on the roles of CAFs in the initiation and progression of oral cancer.     

小鼠口腔癌淋巴道转移模型骨髓播散肿瘤细胞的检测

目的：检测小鼠口腔癌淋巴道转移模型癌变过程不同时期的骨髓播散肿瘤细胞（disseminated tumor cell,DTC）,探讨小鼠口腔癌变过程与骨髓DTC的关系.方法：病理检查明确诊断为正常舌黏膜、舌单纯性增生的小鼠各10只,舌轻中度异常增生、舌重度异常增生、舌鳞癌的小鼠各20只.采用Ficoll密度梯度离心法提取小鼠股骨骨髓里单个核细胞并制成细胞涂片,免疫细胞化学（Immunocytochemistry,ICC）检测骨髓DTC,比较其数目差异.结果：舌重度异常增生8只、舌鳞癌组13只发现DTC,阳性率分别为40％（8/20）和65 ％（13/20）,每100个单核细胞中DTC数分别为3.03±0.75个和5.20±0.74个,差异均有统计学意义（P＜0.05）.其余各组均未发现DTC（0/10）.结论：小鼠舌黏膜恶变过程中,舌重度异常增生时已出现DTC,并随病变程度加重,骨髓DTC的发生率及其细胞数量增加.     

口腔基底样鳞状细胞癌的临床病理及免疫组织化学特点

目的研究口腔基底样鳞状细胞癌的临床病理学特点。方法用ＨＥ染色、病理学观察及免疫组织化学染色法对１４例基底样鳞状细胞癌进行了分析。结果口腔基底样鳞状细胞癌占口腔鳞状细胞癌的１％，男性多于女性，可发生在口腔粘膜任何部位，临床表现主要为肿物和溃疡。肿瘤由基底样细胞和鳞状细胞构成，以基底样细胞为主，常形成粉刺样坏死，核分裂较多，邻近上皮常有异常增生。肿瘤细胞角蛋白ＡＥ１／３、ＣＫ１３阳性，Ｓ１００阴性，增殖细胞核抗原（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇｃｅｌｎｕｃｌｅａｒａｎｔｉｇｅｎ，ＰＣＮＡ）阳性细胞多，ｐ５３阳性率为５０％。３５．７％的病例初次手术时已有淋巴结转移。结论口腔基底样鳞状细胞癌较普通鳞状细胞癌恶性程度高，具有独特的组织学特点，临床及病理上应予重视。     

波形蛋白在舌黏膜鳞状细胞癌中的表达及其与临床预后的关系

目的：研究舌黏膜鳞状细胞癌（舌癌）中波形蛋白的表达,探讨其在舌癌复发转移中的意义。方法：采用免疫组化方法检测30例舌癌患者组织中波形蛋白的表达,并分析其表达水平与临床病理及预后之间的关系。结果：正常口腔黏膜中不表达波形蛋白。在舌癌病例,约33%（10/30）患者的癌组织中波形蛋白呈高表达;67%（20/30）患者的癌组织中波形蛋白呈阴性或低表达。波形蛋白表达水平与患者的性别、年龄、肿瘤分化程度、临床分期之间无统计学意义;波形蛋白的表达水平与肿瘤大小（P=0.007）、淋巴结转移（P=0.007）及复发（P=0.007）之间在统计学上有显著性差异。结论：舌癌组织中波形蛋白的高表达与肿瘤复发、转移之间密切相关,有可能作为舌癌患者预后的预测指标。     

大鼠颊黏膜鳞状细胞癌单克隆细胞系Rca-B的建立及其生物学特性研究

目的：建立大鼠颊黏膜鳞癌单克隆细胞系，并观察其生物学特性，为口腔癌的研究提供大鼠来源的恶性肿瘤细胞系、移植瘤和转移动物模型。方法：将4-硝基喹啉-1-氧化物诱发的SD大鼠颊黏膜鳞癌组织标本进行体外传代培养，利用有限稀释法获得单克隆细胞。光学和电子显微镜观察该细胞的形态变化，细胞计数和四唑盐比色法观察细胞的增殖能力，染色体分析确定细胞核型特点，流式细胞仪检测其细胞周期；动物实验观察细胞裸鼠皮下接种成瘤率及实验性肺转移能力。结果：成功得到单克隆细胞系，细胞形态和生物学观察结果表明，该细胞系符合鳞癌细胞的基本特征，65代细胞群体倍增时间为25．44h，平板克隆形成率为56．30％。细胞周期分布S期占20．13％；染色体为四倍体核型。角质蛋白和波形蛋白免疫组织化学染色均为阳性。细胞系裸鼠皮下接种成瘤为16／16；细胞系行裸鼠尾静脉注射后，其实验性肺转移为10／10；该单克隆细胞系SD大鼠同种异体皮下接种不能成瘤。结论：成功建立SD大鼠颊黏膜鳞癌细胞系Rca—B，细胞系具有高转移鳞癌细胞的典型生物学特征；该细胞系是研究口腔鳞癌分子发生机制和防治策略的又一理想模型。     

VEGF、MMP-9、TIMP-2在口腔颌面部鳞癌中的表达研究

目的：研究口腔鳞癌中VEGF、MMP-9和TIMP-2基因的表达与临床病理因素之间的关系及意义。方法：应用免疫组织化学Envision法检测VEGF、MMP-9和TIMP-2在50例口腔鳞癌中的表达,分析其与口腔鳞癌的临床及病理参数之间的关系。结果：VEGF在口腔鳞癌中阳性表达率与其有无淋巴结转移相关,有淋巴结转移者VEGF的表达量较无淋巴结转移者明显增加（P〈0.05）。MMP-9的表达率与其临床分期及有无淋巴结转移相关;临床分期越高,MMP-9的表达越高（P〈0.05）;有淋巴结转移者MMP-9的表达量较无淋巴结转移者明显增加（P〈0.05）。TIMP-2的阳性表达率与T分类、临床分期和有、无淋巴结转移转移有关。随着T分类、临床分期的增高,TIMP-2的表达率明显降低（P〈0.05）;有淋巴结转移者TIMP-2的表达较无淋巴结转移者明显降低（P〈0.05）。结论：VEGF、MMP-9的高表达和TIMP-2的低表达与口腔鳞癌淋巴结转移明显相关。MMP-9的高表达和TIMP-2的低表达与口腔鳞癌的临床分期和疾病进展有一定关系。