经癌胚抗原重组痘苗病毒转染的树突状细胞体外诱导特异性T细胞免疫

目的研究人癌胚抗原重组痘苗病毒(rV-CEA)转染外周血树突状细胞(DC)后能否在体外诱导CEA特异性细胞毒性T淋巴细胞免疫。方法将rV-CEA转染外周血单核细胞来源的DC后用于激发同源的T细胞,检测其对T细胞的增殖作用以及对CEA分泌性肿瘤细胞的杀伤活性,并与未经rV-CEA转染的DC激发的T细胞进行比较。结果经rV-CEA转染的DC激活的T细胞对CEA分泌性肿瘤细胞具特异性杀伤作用。结论rV-CEA转染的DC可以诱导CEA特异性T细胞活性。     

RT-PCR检测癌胚抗原基因转染树突状细胞的表达

目的 :通过向人DCs转染含人CEA真核表达质粒 ,使DCs特异性的表达和提呈CEA。方法 :RT -PCR检测转染人CEA真核表达质粒DCs的表达。结果 :转染CEA质粒的DCs,RT -PCR检测有一特异性扩增带。结论 :用脂质体能成功将人CEA真核表达质粒转入DCs并表达     

表达人癌胚抗原重组痘苗病毒的构建

用痘苗病毒作载体，成功构建了高效表达人癌胚抗原（ＣＥＡ）的ＣＥＡ－重组痘苗病毒，用１４３ＴＫ－细胞作主宿主细胞，表达的蛋白质只在细胞膜上的能检测到，而胞质内和细胞上清液中均未能检测到，可见所表达的蛋白保持了其原有特性，再次证实痘苗病毒是真核表达扔效载体，本结果为进一步研究ＣＥＡ－重组痘苗病毒能否激活机体的免疫系统杀伤表达ＣＥＡ的肿瘤提供了物质基础。     

携带突变k-ras基因的重组腺病毒转染树突状细胞体外诱导的抗肿瘤免疫

近年来，肿瘤疫苗的研究已成为肿瘤免疫治疗的热点之一。肿瘤抗原的发现及确认为肿瘤的免疫治疗尤其是主动性免疫治疗提供了新的手段。有研究证实突变的ras蛋白质产物可被特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)所识别。由于ras基因突变发生在多种类型肿瘤的实质部分，相对应的抗原决定簇也被发现存在于多种肿瘤组织中，有较为一致的突变热点(密码子12，13，61)。许多研究已经证明肺腺癌中k-ras基因12位密码子点突变是频发、常见的，且与患者的预后有关。因此以ras为靶目标，     

表达人癌胚抗原重组痘苗病毒的构建

用痘苗病毒作载体，成功构建了高效表达人癌胚抗原（ＣＥＡ）的ＣＥＡ－重组痘苗病毒，用１４３ＴＫ－细胞作为宿主细胞，表达的蛋白质只在细胞膜上能检测到，而胞质内和细胞上清液中均未能检测到，可见所表达的蛋白质保持了其原有特性，再次证实痘苗病毒是真核表达的有效载体。本结果为进一步研究ＣＥＡ－重组痘苗病毒能否激活机体的免疫系统杀伤表达ＣＥＡ的肿瘤提供了物质基础。     

基因修饰树突状细胞诱导前列腺癌患者外周血T细胞亚群重排的研究

目的探讨以腺相关病毒(AAV)为载体,前列腺特异性抗原(PSA)基因转染树突状细胞(DC)诱导前列腺癌患者外周血T细胞亚群变化特点及临床意义。方法抽取30例前列腺癌患者外周血,采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,以rAAV/PSA感染DC前体细胞,采用系列细胞因子诱导DC前体细胞成熟。第6天收集成熟DC并与T细胞按比例混合培养,诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。分别于DC与T细胞混合培养前后应用流式细胞术分析外周血T细胞亚群及调节性T细胞(CD4+CD25+FoxP3+Treg)的表达水平。结果 PSA基因转染DC刺激T淋巴细胞爆发增殖,与培养前比较,混合培养6d后CD8+、CD8+CD69+、CD8+CD28+T细胞的比例和CD8+/CD4+比值均明显增高,差异有统计学意义(P<0.01);而CD8+CD28-T细胞和Treg细胞的比例均显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。CD4+T细胞比例较前略有升高,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论 PSA基因转染DC能够有效地激活CD8+抗原特异性CTL,下调免疫抑制性T细胞,提高患者的细胞免疫功能,为前列腺癌的免疫治疗提供新的有效策略。     

痘苗病毒载体介导爱泼斯坦-巴尔病毒潜伏期膜蛋白2A基因转染树突状细胞对其功能的影响

目的：探讨痘苗病毒载体介导爱泼斯坦－巴尔病毒（EBV）潜伏期膜蛋白2A（LMP2A）基因转染树突状细胞（DC）对DC的表型和功能的影响，以及EBV相关肿瘤免疫治疗性疫苗的可行性，方法：用EBV－LMP2A基因重组痘苗病毒（Vac-LMP2A)转染成熟的DC，流式细胞术（FACS）检测转染前后DC表面分子CD1a,CD83,CD40,CD80,HLA-DR变化，3H－TdR掺入法检测转染前后DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖等功能的改变。结果：转染后LMP2A蛋白在DC细胞内高表达，Vac-LMP2A转染成熟DC前后对其表面共刺激分子及特征性表面标志无影响，转染后的DC仍具有较强的刺激同种异体TI林巴细胞增殖的能力。结论：痘苗病毒载体是介导外源基因LMP2A转染DC的有效载体，Vac-LMP2A转染成熟DC对DC表型和功能无明显影响，是EBV相关肿瘤如鼻咽癌免疫治疗的理想载体。     

CEA重组痘苗病毒对实验性CEA阳性肝癌的预防和治疗作用

目的：探讨CEA重组痘苗病毒(CEA—rV)对小鼠CEA阳性肿瘤的预防和治疗作用。方法：①预防作用观察：将实验小鼠分为4组，第1、2组和第3、4组分别皮下接种野生型痘苗病毒(W—VV)和CEA—rV3次，末次接种后，第1、3组皮下注射同源鼠CEA阴性肝癌细胞(Hepa—CEA)，第2，4组接种Hepa—CEA^ 。肿瘤细胞接种后每周测量肿瘤体积，共6周。②治疗作用观察：第1、2组先皮下注射Hepa—CEA^-，3、4组接种Hepa-CEA^ ，7d后1、3组皮下接种W—VV，2，4组接种CEA—rV。肿瘤细胞接种后每周测肿瘤体积，共6周。结果：①预防作用：接种CEA—rV和Hepa—CEA^ 组(第4组)小鼠在观察期内无肿瘤形成，其他小鼠皮下均有肿瘤形成，并且以相近速度增长。②治疗作用：接种Hepa—CEA^ 和CEA—rV组(第4组)小鼠皮下肿瘤生长缓慢，瘤块较小，其他3组肿瘤生长迅速，瘤块较大。整个实验过程中各组小鼠均未表现出其他任何不良反应。结论：CEA—rV对实验性CEA阳性肿瘤具有良好的预防和治疗作用，而且预防作用更佳。     

人癌胚抗原cDNA-重组痘苗病毒接种动物的研究

将构建的表达人癌胚抗原（ＣＥＡ）的重组痘苗病毒接种于纯种新西兰兔，在兔血清中测到高水平的ＣＥＡ以及高滴度抗ＣＥＡ抗体，而在兔的非淋巴组织器官中未检测到ＣＥＡ的表达及免疫复合物的沉积，接种后的兔也没有明显的毒副反应，显示痘苗病毒作载体在体内应用是安全可行的。     

mRNA疫苗冲击树突状细胞诱导抗肿瘤免疫反应的研究

目的：以消化道肿瘤组织mRNA冲击自体DC，诱导特异性免疫应答。方法：20例消化道肿瘤患者外周血分离PBMC(外周血单核细胞)，在IL-4、GM-CSF联合作用下诱导DC，从消化道肿瘤组织中提取mRNA并分别在有脂质体或无脂质体介导下冲击DC，与未经纯化的T细胞混合培养，诱导CTL(细胞毒性T淋巴细胞)。以CTL作为效应细胞，以胃癌细胞系803为靶细胞，LDH释放实验检测杀伤活性。结果：细胞表面标记检测显示诱导前后CD3、CD4、CD14显著下降，CD40、CD86、CD1a、CD83、HLA-DR显著升高，表明IL-4、GM-CSF、联合作用下有效诱导出DC，混合淋巴细胞增殖实验表明该DC具有抗原递呈，刺激淋巴细胞增殖的功能。经脂质体介导的mRNA冲击DC诱导的特异性杀伤反应与未经脂质体介导的mRNA冲击DC诱导的特异性杀伤反应比较，其杀伤率经统计学分析无显著性差异。而二者与单纯经IL-2诱导的未经纯化的T细胞产生的非特异性杀伤比较均有显著性差异。结论：以肿瘤细胞mRNA冲击DC诱导CTL可有效杀伤肿瘤细胞，有可能成为一独特的免疫治疗方法。     

携带不同 HBV抗原基因片段的重组腺相关病毒转染树突状细胞诱导CTL的效应研究

目的：了解携带不同HBV抗原基因片段的重组腺相关病毒（rAAV‐HBV‐S、C、E、X）转染慢性乙型肝炎患者来源的树突状细胞（DC）诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的效应。方法采用携带不同HBV抗原基因片段的rAAV‐HBV‐S、C、E、X转染慢性乙型肝炎患者外周血中分离出的单核细胞,并在GM‐CSF、IL‐4和TNF‐α作用下继续培养7 d获得成熟的DC。通过观察DC的状态和流式细胞仪（FACS）检测各段 HBV转染后DC分化抗原（CD）的表达,评价其成熟与功能。将同一个体的DC与T细胞混合培养制备CTL ,通过四甲基偶氮唑盐（MTS）细胞杀伤实验研究被激活的CTL对HBV感染的靶细胞HepG2．2．15特异性的细胞毒作用。结果不同 HBV 抗原基因 rAAV‐HBV‐S、C、E、X 转染DC后 CD14、CD80、CD83、CD86的表型表达中, CD80、CD83差异有统计学意义（P＜0．05）;rAAV／HBV‐X转染的DC其CD80表达最高,rAAV／HBV‐S转染的DC其CD83表达最高。转染不同 HBV 抗原基因片段 rAAV（S、C、E、X）的 DC 诱导的 CTL 对 MHC‐Ⅰ类抗原阳性且有 HBV 的靶细胞（HepG2．2．15）的特异性杀伤效率显著高于对无 HBV的靶细胞（HepG2）的非特异性杀伤效应（P＜0．01）,但不同rAAV‐HBV组间差异无统计学意义（P＞0．05）。结论 rAAV‐HBV‐S、C、E、X转染DC均可诱导CTL引起M HC‐Ⅰ依赖的特异性细胞毒效应。     

Demethylating agent decitabine induces autologous cancer testis antigen specific cytotoxic T lymphocytes in vivo

Background Cancer testis antigens （CTAs） are a novel group of tumor associated antigens.Demethylating agent decitabine was reported to be able to up-regulate CTAs through its hypomethylation mechanism,thus enhance the immunogenicity of leukemia cells.However,few researches have ever focused on the questions that whether this immunostimulatory effect of decitabine could induce autologous CTA specific cytotoxic T lymphocytes （CTLs） in vivo,and if so,whether this effect contributes to disease control.In this study,we aimed to show that decitabine could induce specific autologous CTLs against some mouse CTAs in leukemia cells in vitro and in vivo.Methods Several mouse CTAs were screened by RT-PCR.CTL specific to one of the CTAs named P1A was detected and sorted by P1A specific dimer by flow cytometry.The activity of specific CTLs was measured by real time RT-PCR.Results We firstly screened expression of some CTAs in mouse leukemia cells before and after decitabine treatment and found that decitabine treatment did up-regulate expression of many CTAs.Then we measured the CTLs＇ activity specific to a mouse CTA P1A in vivo and showed that this activity increased after decitabine treatment.Finally,we sorted these in vivo induced P1A specific CTLs by flow cytometry and demonstrated their cytotoxicity against decitabine treated leukemia cells.Conclusions Our study showed the autologous immune response induced by decitabine in vivo.And more importantly,we firstly proved that this response may contribute to disease control.We believe that this immunostimulatory effect is another anti-cancer mechanism of decitabine,and this special effect would inspire new applications of decitabine in the field of leukemia treatment in the future.     

In Vitro Anti-tumor Immune Response Induced by Dendritic Cells Transfected with Recombinant Adenovirus Carrying Mutant K-ras Genes

Summary： The specific anti-tumor immune response induced by mouse bone marrow dendritic cells （DCs） lransfected with recombinant adenovirus carrying mutant k-ras genes was investighted. DCs were generated from mouse bone marrow in the presence of rmGM-CSF （3.3 ng/mL） and rmIL-4 （1.3 ng/mL） and detected by FACS, and then transfecled with the recombinant adenovirus encoding mutant k ras gene. The efficacy of transfection and T cell stimulating activity of DCs were detected. CTL activity of the mice vaccinated with DCs was observed. The resuhs showed thai DCs had dendritic veiled morphology. BmDCs highly expressed B7-1（80%）, B7-2（77%）, MHC Ⅱ （70%）, CDllc （65%）, CD40 （70%） and CD54 （96%） with FACS, and no significant difference in the expression was observed before and after the transfection （P〈0.05）. The DCs transfeeled by mutant k-ras gene could significantly stimulate lymphoeytes proliferation as compared with those transfeeted by Ad e or non-modified DCs （P〈0.05）. DC vaccine transfected by mutant k-ras gene could induce CTL activity against Lewis lung cancer, but not against B16. The specific eytotoxicity against Lewis lung cancer in Ad-k-ras/12-transdueed DC group was signifieantly higher than those in the control, vector and non transfeeted DCs groups （P〈0.05）. It was concluded that special antitumor response could be induced by DCs transfected with recombinant adenovirus carrying mutant k-ras genes.     

人DC与黑色素瘤细胞融合疫苗体外诱导特异性抗肿瘤CTL

目的：探讨HLA-A2-的黑色素瘤细胞与HLA-A2＋的树突状细胞（DC）融合后体外诱导Me-lan-A特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的作用及交叉抗原递呈的能力。方法：用PEG法将黑色素瘤细胞与DC融合,在含GM-CSF的RPMI1640完全培养基条件下继续培养24～48h,然后将融合细胞与Me-lan-A特异性T细胞共同培养,用细胞内细胞素染色法检测其诱导CTL的活性,流式细胞术分析T细胞的活化率。结果：从异体外周血分离的单核细胞在GM-CSF及IL-4条件下培养6d后,未成熟的DC能表达一定的CD80,CD83,CD86,HLA-DR和HLA-ABC等共刺激分子,而经TNF-浕,PGE-2及CD40L诱导成熟的DC,则这些分子的表达进一步上调。融合细胞体外活化Melan-A特异性T细胞的效率为16.72%&#177;4.26%,阴性对照为0.21%&#177;1.84%,阳性对照为28.60%&#177;5.67%。融合细胞活化的CTL能有效地溶解HLA-A2的黑色素瘤细胞。结论：HLA-A2-的黑色素瘤细胞与HLA-A2＋阳性的DC融合肿瘤疫苗,能在体外有效地交叉递呈MHC-I限制性肿瘤抗原,并诱导Melan-A特异性的CTL和有效地杀伤黑色素肿瘤细胞。     

弱酸洗脱肽负载的树突状细胞激活T细胞的实验研究

目的采用弱酸洗脱提取人卵巢癌细胞膜表面的肿瘤抗原肽,用于负载脐血树突状细胞(DCs),观察其对混合T淋巴细胞的体外激活效应。方法以淋巴细胞分离液分离脐血中的单个核细胞(CBMNC),将其中贴壁的细胞在细胞因子重组人粒巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组白介素(rhIL)-4及重组肿瘤坏死因子(rhTNF-α)的配伍作用下诱导分化为DCs。室温下以pH为3．3的枸橼酸-磷酸盐缓冲液处理人卵巢癌细胞,洗脱液经Oasis HLB小柱提取纯化后负载DCs。以3H-TdR掺入法测定负载抗原的DCs对混合T淋巴细胞的体外活化效应。结果贴壁的CBMNC在细胞因子2 000 U／mL rhGM-CSF、500 U／mL rhIL-4及100 U／mL rhTNF-α的配伍作用下体外诱导分化为具有典型形态和表型的DCs。人卵巢癌细胞弱酸洗脱肽负载的DCs与混合T淋巴细胞体外共培养后,T细胞增殖加快。结论CBMNC可以在GM-CSF、IL-4和TNF-α的作用下体外诱导分化为功能性DCs。pH为3.3的枸橼酸-磷酸盐缓冲液洗脱法可得到卵巢癌细胞的弱酸洗脱肽,用其负载脐血DCs,体外可激活细胞毒T淋巴细胞。     

肿瘤热休克蛋白70-多肽复合物诱导特异性细胞毒T淋巴细胞产生的实验研究

目的　研究肿瘤细胞的热休克蛋白 70多肽复合物 (heatshockprotein 70peptide complexes ,HSP PC70 )诱导活化肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞 (cytotoxicTlymphocytes,CTL)的作用及该CTL的杀瘤效应。方法　利用细胞培养 ,流式细胞技术 ,蛋白质的分离纯化技术 ,电泳技术 ,Western blot检测方法 ,T淋巴细胞的诱导及体外扩增 ,酶标技术等 ,测定肿瘤HSP70 多肽复合物诱导活化小鼠体内CTL产生的作用。结果　HcaF细胞HSP PC70的自然表达率为 6 3.5 % ,热诱导后为 75 .5 % ;HcaF细胞的HSP PC70能够诱导活化肿瘤特异性的CTL ,该CTL在效靶比例为 5 0∶1、2 5∶1、12 .5∶1时于体外对HcaF细胞的杀伤效率分别为 84.2 %± 3.2 %、47.9%± 2 .6 %和 14.8%± 3.0 % ;该CTLCD3、CD8的阳性率分别为 93%± 7% ,92 %± 8% ;将活化的CTL注入荷瘤小鼠体内可见明显的治疗作用 ,注入 10 7CTL 4次后 ,10 0 %的小鼠获长期生存。结论　肿瘤来源的HSP PC70具有强大的免疫原性 ,可活化CD8 T淋巴细胞成为肿瘤特异性的CTL ,该CTL具有较高的体外杀瘤活性和良好的治疗作用。     

2型重组腺相关病毒转染新西兰兔关节软骨细胞的体外研究

目的为进一步研究腺相关病毒重组体在体内间接和直接基因治疗的效果提供依据。方法应用AAVMaxTM包装系统,复制和包装2型腺相关病毒重组体,进行纯化和滴度检测后,按照不同的转染指数(MOI)转染体外培养的新西兰兔关节软骨细胞,观察转染效果与及转染效果与时间的关系。倒置荧光显微镜观察证实表转染成功,流式细胞仪检测转染效果,包括表达绿色荧光信号细胞的百分比和平均荧光强度,将未转染的软骨细胞自发表达的绿色荧光信号百分比的最大值4·76%和荧光信号强度的最大值1·04设定为空白对照。结果当MOI值在1×105v·g·/cell以下时,MOI值(v·g·/cell)与转染率之间的剂量-反应曲线为正相关的线性关系,在MOI超过105v·g·/cell时,转染率不会再有显著的提高。在转染第7天,绿色荧光信号表达达到了峰值,随着转染时间的延长和传代次数的增加,表达绿色荧光信号的软骨细胞百分比和荧光强度均呈现降低趋势,但在转染后第56天仍可检测到绿色荧光蛋白的表达。结论2型腺相关病毒重组体在体外对新西兰兔关节软骨的转染效果良好;增强绿色荧光蛋白是观察2型腺相关病毒重组体转染关节软骨细胞效果一种良好的报告基因。     

EBV特异性细胞毒淋巴细胞的体外诱导和对鼻咽癌细胞的杀伤活性

目的 探索体外诱导和扩增EBV特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)的方法,探讨其应用于鼻咽癌(NPC)治疗的可能性.方法 用EB病毒转化的B淋巴细胞系为抗原递呈细胞及抗原刺激剂,经照射灭活后刺激自体外周血单个核细胞(PBMC),产生EBV特异性CTL,以抗人CD3抗体OKT-3/同种异体PBMC法扩增.并检测其对NPC细胞的特异性杀伤.结果 在体外有效诱导和扩增了EBV特异性的CTL.扩增前CTL对自体BLCL的杀伤率为76%,对同种异体BLCL的杀伤率为13%,对自体肿瘤细胞的杀伤率为51%,对CNE鼻咽癌细胞的杀伤率为27%.扩增后的杀伤率分别为63%、25%、49%、33%.扩增后CTL对肿瘤杀伤力没有明显下降.结论 EBV特异性CTL能在体外有效地诱导,对NPC细胞有特异性的杀伤力,能在体外大量地扩增,且扩增后对肿瘤的杀伤力没有明显下降,有望成为NPC患者有效的过继免疫治疗方法.