MG_7Ag在胃癌细胞系SGC7901及其耐药亚系中的表达及功能

探讨MG_7Ag在胃癌药敏细胞系SGC 790 1及其耐药亚系SGC 790 1/VCR 0 3、SGC 790 1/VCR 0 7、SGC 790 1/VCR 1 0中的表达及功能。采用免疫细胞化学方法及流式细胞仪观察MG7Ag在胃癌药敏细胞及其耐药细胞系的表达 ;用MTT法检测单克隆抗体MG7对药物敏感性的影响 ;以阿霉素作为荧光标记用流式细胞仪观察MG7对细胞内药物浓度的影响。结果表明 ,MG7Ag在耐药细胞系的表达较药敏细胞明显增加 ,且随耐药指数的增加呈逐渐增加的趋势 ;胃癌药敏细胞及其耐药细胞与MG7共同孵育后 ,对长春新碱的药物敏感性减低 ;MG7与耐药细胞共同孵育后 ,细胞内阿霉素的浓度减低。MG7Ag可能作为一个新的与胃癌耐药相关的分子 ,在维持胃癌耐药细胞系SGC 790 1/VCR的耐药表型中起重要作用     

ZNRD1基因的克隆及其反义核酸对胃癌耐药细胞阿霉素蓄积的影响

为获得ZNRD1基因的编友区序列，构建反义真核表达载体，通过检测ZNRD1基因反义核酸转染对胃癌长春新碱耐药细胞SGC7901／VCR阿霉素（ADM）积蓄能力的影响，评价ZNRD1在抗胃癌细胞多药耐药性方面的应用前景。用PCR方法扩增目的基因序列，PCR产物经DNA序列测定证实后，采用分子克隆技术，将所获目的基因全长cDNA片段按反方向克隆入真核表达载体pcDNA3.1^ 的多克隆位点之间，对重组质粒进行酶切鉴定。用脂质体介导法将ZNRD1反义核酸转染SGC7901／VCR，流式细胞仪（FACS）检测SGC7901／VCR细胞内阿霉素的蓄积量。结果应用PCR反应扩增出特异性片段，经DNA序列,下实与文献报道的ZNRD1基因编码区序列一致；构建了反义真核表达载体pcDNA3.1-ZNRD1；转染SGC7901／VCR细胞后，可提高细胞内ADM蓄积量。ZNRD1反义核酸转染后，胃癌多药耐药细胞株SGC7901／VCR对抗肿瘤药物ADM的积蓄作用提高，提示ZNRD1反义核酸具有提高耐药细胞株细胞内药物浓度、恢复其药物敏感性、逆转多药耐药性的作用。     

硫氧化还原蛋白对胃癌细胞化疗敏感性的调节作用

目的 探讨硫氧化还原蛋白(Trx)对胃癌细胞化疗敏感性的调节作用。方法 通过RT-PCR从人胃癌耐药细胞系SGC7901／VCR细胞中克隆Trx全长cDNA,构建Trx正反义真核表达载体,并借助脂质体将正义载体转入胃癌细胞SGC7901、反义载体转入胃癌耐药细胞SGC7901／VCR,利用MTT试验在体外检测基因转染细胞及其对照细胞对化疗药物的敏感性。结果 转染Trx正义载体后,SGC7901细胞对长春新碱、顺铂、阿霉素的敏感性显著降低;转染Trx反义载体后,SGC7901／VCR细胞对长春新碱、顺铂、阿霉素的敏感性显著升高。结论 Trx可能参与了胃癌细胞多药耐药性的形成,改变Trx的表达水平可以调节胃癌细胞的化疗敏感性。     

MG7Ag在胃癌细胞系SGC7901及其耐药亚系中的表达及功能

探讨MG7Ag在胃癌药敏细胞系SGC7901及其耐药亚系SGC7901／VC40．3、SGC7901／VCR0．7、SGC7901／VCR1．0中的表达及功能。采用免疫细胞化学方法及流式细胞仪观察MG7Ag在胃癌药敏细胞及其厕细胞系的一,用MTT法检测单克隆抗体MG7对药物敏感的性的影响,对阿霉素作为荧光标记用流式细胞仪观察,MG7对细胞内药物浓度的 影响,结果表明,MG7Ag在耐药细胞系的表达较药敏细胞明显增加,且随耐药指数的增加呈逐渐增加的趋势,胃癌药敏细胞及其耐药细胞与MG7工同孵育后,对长春新碱的药物敏感性减低;MG7与耐药细胞共同孵育后,细胞内阿霉素的浓度减低。MG7Ag可能作为一个新的与胃癌耐相关的分子,在维持胃癌耐药细胞系SGC7901／VCR的耐药表型中起重要作用。     

凋亡素的克隆及诱导HeLa细胞凋亡

目的：克隆凋亡素（apoptin)的全长基因,在肿瘤细胞HeLa中表达并诱导其凋亡,方法：从CAV病毒基因组TK5803中通过PCR技术扩增凋亡素基因,直接克隆至真核表达载体pCDNA3.1/His/Topo,序列测定证实其正确性,并克隆至pCIneo真核表达载体构建重组表达载体,采用脂质体转染HeLa细胞,转染3d后Honchest33258染色并于荧光显微镜下观察细胞状态,结果与讨论：核酸序列分析证实所克隆的凋亡基因与文献报道的一致,将其成功克隆至真核表达载体,pCDNA3.1/his/Topo和pCIneo,构建了真重组质粒pCIneo-apoptin和pCDNA3.1/His/Topo-apoptin,转染Hela细胞3d后可见明显的细胞凋亡,而只转染空质粒的对照组则较少,表明凋亡素能够有效地诱导HeLa细胞凋亡,本研究为进一步研究凋亡素诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制打下了基础。     

人假想镁离子转运蛋白在胃癌细胞耐药中的生物学作用

目的　制备人假想镁离子转运蛋白(HPT)抗血清并检测其在胃癌耐药细胞中的表达 ,以观察其在胃癌耐药发生中的作用。方法　克隆编码HPT蛋白的cDNA并测序鉴定 ;构建原核表达载体pRSETB HPT ,诱导表达 6×His与HPT的融合蛋白 ;用含融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶颗粒免疫小鼠 ,以Westernblot检测小鼠血清的抗体活性 ;以所制备的抗血清检测HPT蛋白在胃癌各细胞系中的表达。结果　DNA测序结果证实所克隆的基因片段与预计相符 ;利用原核系统表达出 1条约 5 5kD的新生蛋白带 ,Westernblot证实其为与6×His融合的蛋白 ;该融合蛋白免疫血清仅结合SGC790 1细胞中约 5 0kD的单一蛋白带 ;利用该血清检测发现SGC790 1 /ADR中HPT蛋白表达水平高于SGC790 1。结论　成功地制备了鼠抗人HPT蛋白抗血清 ,并发现HPT可能与胃癌细胞的多药耐药性相关     

小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因转染胃癌GC9811细胞的功能研究

通过RT—PCR从BALB／c小鼠腹腔巨噬细胞扩增出编码小鼠α1，3—半乳糖基转移酶基因的全长cDNA并构建其真核表达载体pCDNA3．1／V5—HisAα1，3GT，pCDNA3.1／V5-HisAα1，3GT通过脂质体转染胃癌GC9811细胞，使胃癌细胞表达Galα(1，3)Gal糖表位，G418筛选2个月内的阳性克隆，RT—PCR鉴定转染细胞，间接免疫荧光染色检测转染真核表达载体的癌细胞Galα(1，3)Gal的表达，利用人体血清内针对Galα(1，3)Gal糖表位的天然抗体对癌细胞进行杀伤。结果表明，成功构建了α1，3—半乳糖基转移酶基因真核表达载体，转染α1，3—半乳糖基转移酶基因的癌细胞高表达Galα(1，3)Gal糖表位，人血清对表达该表位的癌细胞具有杀伤作用。     

锌带蛋白基因ZNRD1高表达胃癌细胞模型的建立

为建立高表达ZNRD1胃癌细胞模型，通过分子克隆技术将ZNRD1基因全长cDNA片段克隆入真核表达载体pcDNA3.1^ 的多克隆位点之间，对重组质粒进行酶切鉴定，经显微注射将重组质粒导入人胃癌细胞SGC7901，G418筛选后应用Nothern blot检测ZNRD1基因的表达。结果经酶切鉴定证实正确地构建了真核表达质粒，转染SGC7901细胞后获得有效表达。表明已成功地构建ZNRD1基因真核表达载体，并经显微注射法建立了高表达锌带蛋白基因ZNRD1的胃癌细胞模型，为深入研究ZNRD1的作用和机制奠定了基础。     

RORα miRNA真核表达载体构建及对人胃癌细胞增殖的影响

目的构建RORα（Retinoid acid receptor related orphan receptorα,维甲酸相关孤核受体α）miRNA真核表达载体,分析其对人胃癌MGC803细胞RORα蛋白表达及细胞增殖的影响。方法构建针对设计RORαmiRNA表达的3对miRNA干扰序列,克隆入pcDNATM6.2-GW/EmGFP miRNA真核表达载体,在测序鉴定无误后将含RORαmiRNA转染人胃癌MGC803细胞,用Western blo检测MGC803细胞转染前后RORα蛋白的表达水平变化。MTT法检测对转染MGC803细胞增殖的影响。结果 Western blot结果证实,MGC803细胞转染RORαmiRNA后24h RORα蛋白表达水平明显低于转染阴性组（P〈0.05）。MTT结果显示,转染RORαmiRNA后细胞增殖率（光吸收值）高于转染阴性组（P〈0.05）。结论 miRNA靶向抑制RORα表达后,可促进人胃癌MGC803细胞增殖,提示RORα是一个潜在的胃癌基因及药物治疗的靶点。     

人中性粒细胞多肽1真核表达载体的构建与表达

目的 构建人中性粒细胞多肽1(HNPl)基因真核表达载体,为探讨HNP1基因工程生产的可能性奠定基础。方法 从健康人中性粒细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出HNPl基因cDNA片段,将纯化PCR产物与pMD18-T载体连接,经酶切鉴定及测序确证,将其亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO中．用脂质体转染CA3S-7细胞,用BA-ELISA法检测转染细胞上清中HNP1的表达。结果 从人中性粒细胞中克隆出人HNP1基因,经测序分析与GenBank公布的人HNP1核苷酸序列完全一致,并在COS-7细胞中获高效瞬时表达。结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO／HNP1,为后续哺乳动物工程细胞株的建立奠定了实验基础。     

胃癌MG7-Ag模拟表位与HSP70融合基因疫苗的构建及其诱导小鼠免疫反应的研究

目的　以热休克蛋白 70 (HSP70 )为载体 ,构建胃癌MG7 Ag模拟表位与HSP70融合基因的DNA疫苗 ,并观察该疫苗诱导C5 7BL/ 6小鼠产生MG7 Ag特异性免疫反应的作用。方法　将胃癌MG7 Ag模拟表位 (九肽 )的编码序列设计在HSP70下游引物的 5′末端 ,通过PCR方法获得HSP70与模拟表位的融合基因片段。将PCR产物克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+) ,构建融合基因疫苗。将该融合基因疫苗接种C5 7BL/ 6小鼠股四头肌 ,每隔 3周加强免疫一次 ,共接种 3次。分别在每次接种后 3周收集免疫血清 ,用细胞ELISA法检测小鼠血清中抗MG7 Ag抗体的水平。末次免疫后 3周 ,收集脾细胞 ,用51Cr释放法检测MG7 Ag特异性CTL的杀伤活性。结果　PCR扩增得到大小约 2 .0kb的片段 ,与预期大小一致。将该片段克隆入pcDNA3.1(+) ,DNA序列测定证实MG7 Ag模拟表位的编码序列已成功融合于HSP70cDNA的 3′末端。基因疫苗免疫后 ,融合基因免疫组小鼠于第 9周出现抗MG7 Ag抗体 ,而对照组小鼠无MG7 Ag抗体产生 (P <0 0 5 )。51Cr释放实验结果表明 ,融合基因免疫组小鼠脾细胞对靶细胞的杀伤率与对照组相比无显著差异 (P >0 0 5 )。结论　MG7 Ag模拟表位与HSP70融合基因疫苗构建成功 ;该融合基因疫苗能够诱导MG7 Ag特异性的体液免疫反应     

S100A2全长基因真核表达载体pEGFP-N2-S100A2的构建及其在胃癌细胞系BGC-823中的表达

 目的 克隆S100A2 cDNA,构建pEGFP-N2-S100A2重组表达载体,转染胃癌细胞系BGC-823,为探讨其对胃癌细胞系的影响奠定实验基础.方法 应用RT-PCR 和DNA 重组技术构建pEGFP-N2-S100A2 融合蛋白表达载体,质粒经测序正确后,用脂质体转染BGC-823 细胞.结果 重组质粒经限制性酶切鉴定得到与S100A2全长基因长度一致(294 bp) 的酶切产物; 测序分析证实,重组质粒中含有一与GenBank 上登录的S100A2基因(NM-005978) 序列完全一致的序列,表明成功地完成了表达载体的构建; 荧光显微镜下可见转染的BGC-823 细胞有绿色荧光蛋白的表达.结论 构建完成真核表达载体pEGFP-N2-S100A2,S100A2基因在BGC-823细胞内成功表达.     

PRDX3真核表达载体构建及亚细胞定位

目的：构建带FLAG标签的过氧化物还原酶3（peroxiredoxin3,PRDX3, PRX3）的真核表达载体,并对其在人舌癌SCC15细胞中的定位进行检测。方法以乳腺文库为模板,PCR扩增带有FLAG标签的PRDX3基因片段,并将扩增产物插入到PCDH空载体中,构建成PCDH－FLAG－PRDX3,质粒测序正确后瞬时转染入人胚肾293T细胞, Western免疫印迹检测克隆载体的表达情况,细胞免疫荧光实验检测PRDX3的亚细胞定位。结果双酶切和测序结果表明,PCDH－FLAG－PRDX3真核表达载体构建成功,转染293T细胞后成功表达了FLAG－PRDX3融合蛋白;细胞免疫荧光显示FLAG－PRDX3蛋白定位于舌癌SCC15细胞的细胞质中,不存在于细胞核内。结论成功构建了带FLAG标签的PRDX3真核表达载体,并检测其定位于舌癌SCC15细胞质中,为进一步明确PRDX3在舌癌发生发展中的功能及分子机制奠定基础。     

人血管生成素-1基因的克隆及原核、真核表达载体的构建

血管生成素（angiopoietin）是近年来发现的与血管生成、抑制密切相关的分子。为研究其在肿瘤血管生成及转移中的作用，利用PCR技术从人胎盘组织中得到血管生成素-1基因，并亚克隆至pRSET C原核表达载体及pcDNA3.1-V5-HisC真核表达载体，成功地构建了原核及正反义真核表达载体，为下一步研究其对消化道肿瘤血管生成的影响打下了基础。     

载体介导的siRNA对SGC-7901胃癌细胞中hPOT1表达的抑制作用

目的构建人端粒保护蛋白（hPOT1）基因的短链干扰核糖核酸（siRNA）表达载体，观察其在胃癌细胞中抑制hPOT1基因表达的作用，为进一步研究hPOT1在胃癌细胞生长增殖中的作用打下基础。方法设计并化学合成64nt编码hPOT1 siRNA基因片段的寡核苷酸，退火成双链后将其连接到pSUPER质粒的H1 RNA启动子下游，构建psiRNA-hPOT1重组质粒。经酶切、测序鉴定后，用脂质体介导的基因转染方法，转人SGC-7901胃癌细胞，用半定量RT-PCR检测hPOT1表达水平的变化。结果测序结果表明重组质粒psiRNA-hPOT1 64个碱基成功插人到预定位置，并且序列完全一致。hPOT1 siRNA表达载体psiRNA-hPOT1转入胃癌细胞后，可明显抑制SGC-7901细胞hPOT1的表达。结论构建的hPOT1基因的siRNA表达载体psiRNA-hPOT1重组质粒能显著抑制hPOT1基因在SGC-7901胃癌细胞中的表达。     

凋亡抑素启动子介导肿瘤特异性TRAIL在宫颈癌Hela细胞中的表达

目的:探讨凋亡抑素(survivin,SVV)启动子调控的TRAIL肿瘤细胞内特异表达在宫颈癌治疗中的应用意义。方法:提取人外周血淋巴细胞总RNA,采用RT-PCR方法,用带有IL-2信号肽基因序列的引物扩增TRAIL基因,克隆入真核表达载体pGL-Basic/surp中SVV启动子的下游,构建肿瘤特异性分泌表达TRAIL基因的真核表达载体pGL-Basic/surp/TRAIL。转染宫颈癌Hela细胞及正常人肝细胞(7702),RT-PCR鉴定转染细胞中的TRAIL表达。结果:RT-PCR扩增得到了613bp的cDNA片断,pGL-Basic/surp/TRAIL经酶切及测序鉴定与GenBank中报道的IL-2信号肽和TRAIL凋亡诱导功能区cDNA序列完全一致;转染细胞RT-PCR鉴定结果显示,Hela细胞中可扩增出600bp基因片段,而7702细胞中未见该特异性扩增条带。结论:重组真核表达载体pGL-Basic/surp/TRAIL能够高效、特异性地表达于Hela细胞中,其成功构建为特异性肿瘤基因治疗提供了可行的理想工具。     

天然溶瘤新城疫病毒Italien株HN基因真核表达载体的构建和表达

目的 构建天然溶瘤型新城疫病毒(NDV)Italien株血凝素-神经氨酸酶(HN)基因的真核表达载体并进行产物表达.方法 采用RT-PCR法从病毒RNA中克隆HN cDNA,并构建HN的真核表达载体pcDNA3.1-HN,脂质体法转染CHO-K1,G418筛选稳定表达克隆.用Western blot、免疫荧光法检测HN蛋白的表达.结果 经限制性酶切鉴定及DNA测序分析,证实真核表达载体pcDNA3.1-HN构建正确.Western blot和免疫荧光分析表明HN基因在CHO-K1中成功表达.结论 天然溶瘤型NDV Italien株的HN cDNA被成功克隆,所构建的真核表达载体pcDNA3.1-HN可以在CHO-K1细胞中稳定表达.