PTEN基因增强卵巢癌A2780细胞对紫杉醇敏感性的研究

背景与目的:近来的研究表明PTEN基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,第10号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源缺失的基因)失活在肿瘤化疗耐药发挥了重要作用。本文研究外源性PTEN基因稳定转染人卵巢癌A2780细胞后对紫杉醇敏感性的影响。方法:将野生型PTEN基因真核表达质粒在脂质体介导下转染人卵巢癌A2780细胞,同时以转染空载体和未转染细胞作为对照(3组细胞分别命名为WT-PTEN/A2780,GFP/A2780和A2780),分别应用RT-PCR和蛋白印迹技术检测各组细胞PTEN mRNA转录和蛋白表达的变化;四甲基偶氮唑蓝实验观察转染PTEN基因对肿瘤细胞生长的抑制作用和A2780细胞对紫杉醇药物敏感性的影响,流式细胞仪(FACS)分析细胞凋亡情况。结果:与对照组相比,转染野生型PTEN基因能明显增加A2780细胞PTENmRNA转录和蛋白的表达,差异有显著性(P<0.05);MTT法显示,WT-PTEN/A2780细胞生长明显慢于GFP/A2780和A2780细胞;紫杉醇对WT-PTEN/A2780,GFP/A2780和A2780的IC50值分别为(7.6±0.40)nmol/l、(22.5±0.9)nmol/l和(22.7±0.8)nmol/l,WT-PTEN/A2780细胞对紫杉醇药物敏感性显著增加(P<0.05);FACS分析显示,紫杉醇作用24h后,WT-PTEN/A2780,GFP/A2780和A2780的凋亡率分别为(34.6±1.6)%、(13.5±0.9)%和(12.7±1.0)%,差异有显著性(P<0.05)。结论:转染野生型PTEN重组质粒能有效提高A2780细胞内PTEN的表达,诱导A2780细胞凋亡,显著增加A2780细胞对紫杉醇杀伤的敏感性。     

沉默S100A10基因对卵巢癌SKOV-3和A2780细胞周期的影响

目的 探讨沉默S100钙结合蛋白A10(S100A10)对卵巢癌SKOV-3和A2780细胞周期的影响及其相关分子机制.方法 将针对S100A10基因的shRNA转染至SKOV-3和A2780细胞中,获S100A10敲降稳转SKOV-3和A2780细胞系,采用CCK8方法检测细胞增殖能力,采用流式细胞技术检测细胞周期变...     

PTEN基因及其在卵巢癌中的研究进展

PTEN基因是目前发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因,可通过基因突变、DNA甲基化等方式失活,主要表现为基因缺失、蛋白表达减少.PTEN作用于PI3K/AKT信号途径和选择性抑制MAPK途径,调控细胞增殖;通过发挥蛋白磷酸酶功能,使FAK和SHC去磷酸化,抑制细胞迁移.PTEN在卵巢癌的发生、发展中发挥着重要作用.     

PTEN基因转染对人膀胱癌细胞系BIU87增殖及侵袭活性的影响

背景与目的:PTEN(phosphataseandtensinhomologuedeletedfromchromosome10)是迄今为止发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因,在多种原发性恶性肿瘤和肿瘤细胞株中均存在有较高频率的缺失或突变,其失活与肿瘤的进程和预后相关。本实验研究外源性PTEN转染后,人膀胱癌细胞系BIU87增殖和侵袭活性的改变。方法:将携有PTEN基因的重组真核表达质粒pBp-PTEN转化大肠杆菌DH5α并扩增,抽提纯化质粒并进行酶切鉴定,pBp-PTEN体外转染BIU87细胞(pBp-PTEN-BIU87),筛选稳定转染的细胞并扩增培养,以转染了空质粒pBp的BIU87细胞(pBp-BIU87)和正常BIU87细胞为对照,用RT-PCR检测PTEN的表达情况,并用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)和细胞侵袭实验分别检测PTEN基因转染前、后BIU87细胞增殖和侵袭活性的变化。结果:pBp-PTEN的酶切鉴定证实含有目的基因PTEN;pBp-PTEN-BIU87细胞的RT-PCR产物经凝胶电泳有明显的阳性条带,而对照组则无;MTT发现,pBp-PTEN-BIU87细胞在第2、3和4天的吸光度(A值)明显低于两对照组(P<0.05),以正常BIU87细胞为对照,PTEN基因在第1、2、3、4天的细胞生长抑制率分别为4.27%、18.92%、19.54%、17.69%。细胞侵袭试验显示,各组细胞浸润穿透ECM膜的数目:pBp-PTEN-BIU8为39.3±7.7,BIU87和pBp-BIU87分别为48.1±13.2和48.9±11.0,pBp-PTEN-BIU87细胞明显少于两对照组(P<0.05)。结论:抑癌基因PTEN转染能降低膀胱癌细胞的增殖和侵袭活性。     

PTEN与VEGF165 基因mRNA在卵巢癌中表达及相关性研究

目的探讨PTEN和VEGF165 基因mRNA表达在卵巢癌发生和演进中的作用.方法利用RT-PCR方法检测正常卵巢(n=5)、卵巢囊肿(n=5)、卵巢交界性肿瘤(n=9)、上皮性卵巢癌(n=60)和卵巢癌细胞系CAOV-3中PTEN和VEGF 165 基因mRNA表达.结果PTEN基因mRNA在卵巢交界性肿瘤和卵巢癌中的表达水平低于正常卵巢和卵巢囊肿,P<0.05,与卵巢癌的临床病理分期呈负相关,P<0. 05,而与组织分化程度呈正相关,P<0.05.在卵巢内膜样癌中PTEN基因mRNA表达水平显著低于浆液性或黏液性卵巢囊腺癌,P<0.05.VEGF165 基因mRNA在卵巢癌中的表达水平高于正常卵巢和卵巢囊肿,P<0.05,与卵巢癌的临床病理分期呈正相关,P<0. 05,而与组织分化程度呈负相关,P<0.05;浆液性卵巢癌中VEGF165 基因mRNA 表达水平显著高于其他上皮性卵巢癌,P<0.05.VEGF165 基因mRNA随PTEN基因mRNA表达的降低而升高,r=0.728,P<0.05.结论在卵巢癌中PTEN基因mRNA表达下调和VEGF165 基因mRNA表达上调,2个指标分别与卵巢内膜样癌和浆液性囊腺癌的发生和病理生物学行为关系密切;PTEN基因mRNA表达降低原因可能为通过上调VEGF基因mRNA表达促进新生血管形成,进而参与卵巢癌的发生和演进.     

HDAC抑制剂TSA增强卵巢癌细胞株A2780对腺病毒基因转染效率的体外研究

背景与目的:腺病毒感染依赖于靶细胞表面柯萨奇-腺病毒受体(Coxsackie and adenovirus receptor,CAR)的表达,肿瘤细胞CAR表达的缺失和下调是造成腺病毒为载体基因治疗效果不佳的根本原因。本研究通过观察组氨酸去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)抑制剂TrichostatinA(TSA)对卵巢癌细胞株A2780CAR表达水平的影响,探讨HDAC抑制剂在腺病毒载体基因治疗中应用的可能性。方法:分别在TSA作用A2780细胞前后检测CARmRNA和蛋白水平的表达,同时采用流式细胞术测定病毒转染效率,MTT实验评价腺病毒携带的胸苷激酶(ADV/TK)的体外抗瘤效应。结果:TSA处理后,A2780细胞内CARmRNA和蛋白表达明显增高。通过流式细胞仪分析GFP/ADV转染后GFP的表达发现,未处理组细胞转染率为(1.24±0.14)%;5nmol/L和100nmol/LTSA处理48h后,细胞的转染效率分别为(7.58±0.32)%和(7.94±0.28)%。MTT结果表明,ADV/TK介导的体外杀伤作用在5nmol/L和100nmol/LTSA处理组较未处理组增强了4～10倍。结论:TSA可以增强针对卵巢癌细胞的腺病毒基因转染效率,为增强卵巢癌基因治疗效果提供可能的方法。     

肝癌缺失基因1对人卵巢癌细胞OVCAR-3增殖和迁移的影响

目的:初步探讨肝癌缺失基因1(deleted in livercancer 1,DLC1)对人卵巢癌细胞株OVCAR-3增殖和迁移的影响。方法:采用脂质体介导重组质粒pEGFP-C3-DLC1转染人卵巢癌OVCAR-3细胞后,RT-PCR及蛋白质印迹法检测DLC1mRNA和蛋白的表达。MTT法、FCM法和Transwell小室法分别评价DLC1基因转染前后细胞增殖、细胞周期和细胞迁移能力的变化,蛋白质印迹法检测黏着斑激酶(focaladhesionkinase,FAK)和c-Jun氨基末端蛋白激酶(c-Jun NH2-terminalprotein kinase,JNK)蛋白及其磷酸化水平的变化。结果:成功转染pEGFP-C3-DLC1后,OVCAR-3细胞中可检测到DLC1mRNA和蛋白的稳定表达。稳定转染DLC1基因后,OVCAR-3细胞的增殖和迁移能力受到明显抑制,而且停滞于G0/G1期的细胞比例增加,差异均有统计学意义(均为P<0.01)。转染DLC1基因后的OVCAR-3细胞中p-FAK(Y925)和p-JNK(Thr183/Tyr185)蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:DLC1基因转染OVCAR-3细胞后可能通过下调p-FAK(Y925)和p-JNK(Thr183/Tyr185)蛋白表达水平,使OVCAR-3细胞停滞于G0/G1期,从而抑制OVCAR-3细胞的体外增殖和迁移能力。     

canstatin基因转染对肺癌A549细胞和血管内皮细胞增殖与凋亡的影响

背景与目的　肿瘤的生长和转移需要大量新血管的生成,人血管能抑素(canstatin)是新近发现的高效内源性血管生成抑制剂,其抑制血管内皮细胞的作用已引起人们广泛关注。本研究的目的是探讨can statin基因在人肺癌A549细胞和人脐静脉内皮细胞HUV ECC中的表达及意义。方法　将canstatin基因通过电穿孔的方法转染人肺癌细胞A549和人脐静脉内皮细胞HUV ECC,行G418筛选获得转基因细胞克隆。用SDS PAGE电泳检测canstatin蛋白在转基因细胞培养上清液中的表达,以流式细胞仪分析细胞周期,并比较转基因和未转基因细胞的生长特性。结果　canstatin在转染组A549 细胞和ECC细胞表达并分泌至上清液中。canstatin基因转染组ECC的凋亡率(16.04%)显著高于空载体组(0.43%)和亲代细胞组(2.92%)(P<0.01),转染细胞生长明显受抑(P<0.01)。而转染组A549细胞的凋亡率(0.19%)与空载体组(0.13%)及亲代细胞组(0.07%)比较无显著性差异(P>0.05),细胞生长也未受明显影响。结论　canstatin能特异地抑制内皮细胞增殖,并诱导内皮细胞凋亡。     

第10号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源缺失的基因对人卵巢癌A2780细胞侵袭和迁移能力的影响及相关机制

目的 探讨第10号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源缺失的基因(PTEN)对人卵巢癌A2780细胞侵袭和迁移能力的影响及相关机制.方法 将携带外源性人PTEN基因的野生型质粒(WT-PTEN)和磷酸酶域突变型质粒(C124A-PTEN)转入人卵巢癌细胞株A2780中,利用Transwell小室法和划痕愈合实验检测转染前后细胞侵袭和迁移能力的变化,应用Western blot检测各组细胞PTEN及其下游相关蛋白表达的变化.以空载体质粒和未转染细胞作为对照.结果 细胞侵袭实验显示,WT-PTEN/A2780、C124A-PTEN/A2780、GFP/A2780和A2780细胞穿透Matrigel胶的细胞数,分别为(24.3±2.5)个、(43.7±3.8)个、(44.7±2.1)个和(45.0±3.0)个,WT-PTEN/A2780细胞的穿膜数明显少于其他各组(P＜0.05).划痕愈合实验显示,WT-PTEN/A2780、C124A-PTEN/A2780、GFP/A2780和A2780细胞的迁移距离分别为(54.1±3.7)μm、(78.7±3.4)μm、(78.1±3.1)μm和(76.8±3.5)μm,WT-PTEN/A2780细胞的迁移速度明显慢于C124A-PTEN/A2780、GFP/A2780和A2780细胞(P＜0.05).WT-PTEN/A2780细胞中基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白的表达明显低于C124A-PTEN/A2780、GFP/A2780和A2780细胞(P＜0.05).结论 野生型PTEN可有效抑制A2780细胞的侵袭和迁移,该抑制作用与A2780细胞中MMP-9表达下调有关.

Abstract：

Objectiye To evaluate the effects of PTEN on invasive and migration ability of human ovarian cancer cell line A2780 and related mechanisms. Methods The plasmid including WT-PTEN and mutant PTEN were transferred into A2780 cells. The invasive and migration ability were measured before and after transfection by transwell chamber and wound-healing assays. The expression of PTEN protein and related proteins in the cells were detected by Western blot analysis. Empty plasmid-transfected A2780 and normal A2780 cells were used as control (the different four groups were named as WT-PTEN/A2780,C124A-PTEN/A2780, GFP/A2780 and A2780 ). Results The number of penetrating cells was significantly less in WT-PTEN/A2780 cells(24.3 ± 2.5 ) than those in C124A-PTEN/A2780, GFP/A2780 and A2780 cells (43.7 ± 3.8, 44.7 ± 2. 1 and 45.0 ± 3.0 ) ( P ＜ 0.05 ). The migration distance was markedly shorter in WT-PTEN/A2780 cells (54.1 ± 3.7) than those in C124A-PTEN/A2780, GFP/A2780 and A2780 cells (78.7 ± 3.4, 78.1 ± 3.1 and 76.8 ± 3.5 ) ( P ＜ 0. 05 ). Conclusions Transfection with PTEN may suppress the invasive and migration ability of ovarian cancer cell line A2780 depending on its phosphatase activity, and the suppressive effect may be due to the down-regulation of MMP-9 in the cancer cells.     

抑癌基因PTEN对肝癌细胞增殖的抑制及作用机制

目的探讨抑癌基因PTEN对肝癌细胞增殖和细胞周期的调控作用。方法构建野生型PTEN基因和突变型PTEN基因的真核表达载体pEGFP—WT—PTEN和pEGFP—PTEN;G129R。采用脂质体介导的基因转染法,分别将上述载体转染不表达PTEN蛋白的人肝细胞肝癌细胞系HHCC,经G418筛选,获得稳定表达PTEN蛋白的细胞克隆。以流式细胞仪测定细胞周期,以Western blot法分析稳定表达PTEN蛋白的肝癌细胞内源性的磷酸化AKT表达水平,同时与未进行基因转染和转染空载体pEGFP-C1的HHCC细胞进行对照。结果稳定表达野生型PTEN蛋白的肝癌细胞,细胞生长受到明显抑制,与转染空载体的HHCC细胞比较,G1期细胞比例显著增高,G2期和S期细胞比例显著降低,且差异有统计学意义（P〈0．05）;而转染突变型PTEN基因的HHCC细胞,与转染空载体的HHCC细胞比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。与转染空载体的HHCC细胞比较,稳定表达野生型PTEN蛋白的HHCC细胞,其内源性磷酸化AKT水平明显减低;而转染突变型PTEN基因的HHCC细胞,其AKT水平无明显变化。结论野生型PTEN基因对肝癌细胞周期具有调控作用,而突变型PTEN基因丧失对肝癌细胞周期的调控作用;野生型PTEN基因可能通过降低AKT的活化而实现对肝癌细胞周期的调控。     

丹皮酚对人卵巢癌细胞A2780s增殖的影响

目的:探讨丹皮酚(paeonol,Pae)在体外对人卵巢癌A2780s细胞增殖的影响。方法:将不同浓度的Pae作用于人卵巢癌A2780s细胞,应用MTT法检测Pae对细胞增殖的抑制作用,FCM法检测Pae对细胞周期分布及细胞凋亡率的影响。结果:7.81～250.00mg/LPae对A2780s细胞的增殖均有抑制作用,且随着Pae浓度的增加和作用时间的延长,其增殖抑制作用增强。FCM检测结果显示,31.25～250.00mg/LPae作用48h后,G0/G1期和G2/M期细胞比率下降,S期细胞比率上升;细胞出现凋亡,凋亡率随着Pae浓度的增加而上升。结论:一定浓度的Pae具有抑制人卵巢癌细胞增殖和诱导其凋亡的作用。     

RNAi沉默RABGEF1基因对人卵巢癌细胞增殖的影响

目的:探讨沉默RABGEF1基因对人卵巢癌细胞(SK-OV-3细胞)增殖的影响.方法:通过小干扰RNA技术沉默SK-OV-3细胞的RABGEF1基因表达,用实时荧光定量RT-PCR法鉴定细胞内RABGEF1基因的表达水平,培养RABGEF1基因被沉默的SK-OV-3细胞,计数不同时间点的细胞数,分析RABGEF1基因对人卵巢癌细胞增殖的影响.结果:实时荧光定量RT-PCR法检测显示所构建的4个siRNA表达载体对RABGEF1基因表达的沉默率分别为52.5％、58.1％、76.2％和87.7％.将RABGEF1基因表达沉默率为87.7％的SK-OV-3细胞继续培养,计数显示细胞数目较未沉默基因减少(P＜0.05).结论:应用RNAi技术沉默RABGEF1基因可抑制SK-OV-3细胞的增殖,提示RABGEF1基因可能参与卵巢癌的发生发展.     

Chk1/2基因沉默对人胃癌MGC803细胞增殖及周期的影响

目的:观察Chk1/2基因沉默对人胃癌MGC803细胞增殖及周期的影响.方法:采用RNAi技术在MGC803细胞中分别将Chk1和Chk2基因沉默,运用蛋白质印变法验证,然后采用MTT实验、流式细胞术分析Chk1和Chk2基因沉默对人胃癌MGC803细胞增殖及周期的影响.结果:蛋白质印迹法结果显示,转染靶向Chk1和Chk2 siRNA 24 h的Chk1、Chk2蛋白相对灰度值分别为0.09±0.04和0.12±0.01,明显弱于未转染对照组(0.39±0.09)和脂质体转染组(0.38±0.17),P均<0.05,而未转染对照组和脂质体转染组之间比较差异无统计学意义,P=0.458.转染Chk1、Chk2 siRNA的MGC803细胞Chk1和Chk2蛋白表达分别下降85.0%和83.4%.MTT实验证明,Chk1蛋白表达缺失导致MGC803细胞增殖活性下降,其增殖抑制率为38.0%(t=26.797,P<0.05);Chk2蛋白表达缺失对细胞增殖无明显抑制作用(t=6.098,P>0.05).Chk1基因沉默后细胞周期在G0/G1期发生停滞,但并不引发凋亡,而Chk2基因沉默后对细胞周期影响不明显.结论:Chk1基因沉默可明显抑制人胃癌细胞增殖,且其抑制增殖作用与诱导G0/G1期阻滞有关.     

短发卡状RNA抑制人Bubl基因表达及其对人卵巢癌A2780细胞药物敏感性和周期的影响

背景与目的:既往研究提示,紫杉醇类药物作用的发挥有赖于功能完整的纺锤体检查点,而Bubl是纺锤体检查点的重要组成部分.本研究旨在探讨Bubl短发卡状RNA真核表达载体稳定转染对人卵巢癌A2780细胞紫杉醇敏感性及细胞周期的影响.方法:构建Bubl基因短发卡状RNA真核表达载体pEGFP-Bubl-shRNA,以脂质体Lipofectamine~(TM)2000包裹空质粒转染体外培养的人卵巢癌细胞株A2780后进行稳定筛选.应用RT-PCR、Western印迹法分析目的基因mRNA及其蛋白水平的表达情况:MTT法、流式细胞术等方法检测转染前后,A2780细胞对紫杉醇敏感性及其细胞周期的变化;Hoechst33342染色法检测细胞分裂指数.结果:与对照组pEGFP-Cl/A2780及A2780组相比,pEGFP-Bubl-ShRNA/A2780组细胞中mRNA和蛋白水平的表达均明显下降,其差异具有统计学意义(P＜0.05);MTT检测结果提示,转染pEGFP-Bubl-shRNA质粒后细胞对紫杉醇的敏感性明显降低,与对照组相比,差异具有统计学意义(P＜0.05);流式细胞术检测结果显示,紫杉醇1 μ mol/L处理细胞24及48 h后,与pEGFP-Cl/A2780及A2780组相比,该组细胞凋亡率明显降低(P＜0.05),G_2/M期细胞比例下降,差异具有统计学意义(P＜0.05);Hoechst33342染色提示,与对照组相比,pEGFP-Bubl-shRNA/A2780组的分裂指数(MI)明显降低,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:Bubl基因的下调可导致人卵巢癌A2780细胞对紫杉醇敏感性及G_2/M期细胞比例下降.pEGFP-Cl-shBubl质粒的成功构建,为研究Bubl基因的功能及定位的研究提供了进一步的实验条件.     

miR－300对人卵巢癌细胞增殖、周期及凋亡的影响

目的：研究 miR－300对人卵巢癌细胞增殖、凋亡和周期的影响。方法：通过荧光实时定量 PCR （qRT－PCR）检测卵巢正常上皮细胞及卵巢癌细胞中miR－300的表达水平和miR－300 siRNA的沉默效果;CCK－8法检测沉默miR－300对卵巢癌细胞增殖的影响;流式细胞术检测沉默miR－300对卵巢癌细胞凋亡和周期的影响。结果：miR－300在卵巢癌细胞中的表达显著高于卵巢正常上皮细胞;miR－300 siRNA可有效沉默卵巢癌细胞中miR－300的表达;沉默miR－300的表达可以明显抑制卵巢癌细胞的增殖能力,增强卵巢癌细胞的凋亡能力,并使卵巢癌细胞的周期阻滞于G1期。结论：miR－300在卵巢癌细胞的增殖、凋亡和周期过程中起着重要的调控作用。