胞外信号调节激酶在大鼠肝纤维化形成中的作用机制研究

目的 研究胞外信号调节激酶（ERK）在大鼠肝纤维化形成中的表达及作用机制。方法 对32只雄性SD大鼠皮下注射四氯化碳（CCl4）,制备大鼠肝纤维化模型,分别于注射后1、4、8周处理动物,采用免疫组化、RT-PCR等方法对大鼠肝组织中ERK1表达进行检测。结果 免疫组化显示,ERK1主要表达于肝星状细胞（HSC）中。注射CCl4诱导后,大鼠肝组织中ERK1表达较正常对照组明显增强（P〈0．01,〈0．05）,且1、4、8周肝组织中ERK1的表达强度呈明显递增趋势（P〈0．01,〈0．05）。RT-PCR检测结果显示,ERK1mRNA表达与其酶蛋白改变一致。结论 ERK激活促进HSC活化增殖,参与了肝纤维化的发生发展过程。     

结缔组织生长因子基因表达与大鼠肝纤维化关系初步研究

目的探讨结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）基因在肝纤维化大鼠肝组织中的表达及其在肝纤维化发展中的作用。方法采用四氯化碳（CCl4）皮下注射制备肝纤维化模型，并于注射后1、4、8周取大鼠肝组织，免疫组化检测CTGF的表达，RT—PCR检测肝组织结缔组织生长因子和I型胶原α2[COL Ⅰ（α2）]基因的转录，并作图像扫描和统计学分析。结果CTGF免疫组化显示正常大鼠肝组织未见明显阳性着色，模型组大鼠注射CCl4 1周后，肝窦周和汇管区细胞出现阳性染色，随着CCl4注射时间的延长，其表达逐渐增强趋势。正常大鼠肝组织COLⅠ（α2）无表达，注射CCl4 1周后有弱表达，注射CCl4 4周后表达增强，8周时达到高峰。CTGF基因的表达与Ⅰ型胶原（α2）的表达呈正相关。结论CTGF作为TGF-β1的下游细胞因子在肝纤维化的发生和发展中可能发挥重要作用。     

Smad3、Smad7基因表达与肝纤维化发病关系研究

目的：探讨Smad3和Smad7编码基因在肝纤维化大鼠肝星状细胞（HSC）中的表达及意义。方法：注射四氯化碳（CCl4)制备大鼠肝纤维模型，按诱导时间将动物随机分为1、4、8周及正常对照组4例，行肝组织胶原VG染色，转化生产因子（TGF）β1免疫组化检测，同时分别以RT－PCR、Western blot检测原工分离HSC的Smad3、Smad7mRNA和蛋白表达。结果：肝纤维化形成过程中肝组织胶原生成逐渐增多，TGFβ表达增强。与正常对照相比，各期肝纤维化大HSC中Smad3mRNA表达增加（P＜0．05），注射CCl4后1周，Smad7mRNA较正常一过性升高（P＜0．05）。第4周和第8周表达水平则持续下降（P＜0．01），Smad3和Smad7的蛋白表达与其mRNA基本一致。结论：Smad3和Smad7在肝纤维化发生，发展中起不同的介导作用，提示通过靶向性阻断HSC Smad3信号和（或）加强Smad信号有望成为治疗肝纤维化的新手段。     

加味桃核承气汤对四氯化碳所致肝纤维化模型大鼠TIMP-1蛋白表达的影响

目的：观察加味桃核承气汤对四氯化碳（CCl4）肝纤维化的治疗作用，从分子生物学水平探讨其对金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）的影响。方法：用CCl4诱导大鼠肝纤维化，将实验动物随机分为正常对照组、模型对照组、加味桃核承气汤高、中、低剂量治疗组和秋水仙碱对照组；采用灌胃给药，疗程8周；用苦味酸-天狼红胶原染色方法观察肝纤维化积分（SSS）的变化；用免疫组化技术半定量检测肝组织TIMP-1的蛋白表达水平。结果：模型对照组SSS显著高于正常对照组，经加味桃核承气汤治疗后SSS显著减轻；模型对照组大鼠肝组织TIMP-1的蛋白表达水平增加。各治疗组的TIMP-1的蛋白表达水平均显著下降。结论：①加味桃核承气汤对CCl4诱导的肝纤维化有治疗作用。②加味桃核承气汤抗实验性肝纤维化作用机制与抑制肝星状细胞（HSC）的活化，调控TIMP-1的蛋白表达水平有关。     

肌细胞增强因子2A与肝星状细胞活化关系的体内实验研究

背景：转录调控在肝星状细胞（HSC）活化过程中起重要作用,研究显示转录因子肌细胞增强因子2（MEF2）参与了HSC的活化过程。目的：探讨肝纤维化形成过程中MEF2家族成员MEF2A与HSC活化的关系。方法：实验开始时处死6只大鼠作为0周对照组,64只大鼠随机分为正常对照组和肝纤维化模型组。模型组大鼠皮下注射60％CCL（0．3ml／100g,每周2次）复制肝纤维化模型;正常对照组大鼠与模型组于相同条件下饲养,不予任何处理。造模开始后3、6、9、12周分批处死大鼠,取肝组织,实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测MEF2AmRNA表达．蛋白质印迹法检测MEF2A蛋白和HSC活化标记物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达,VanGieson染色定量分析肝内胶原含量。结果：正常肝组织中仅有少量MEF2AmRNA和蛋白表达;随着肝纤维化的形成,肝组织MEF2AmRNA和蛋白表达量逐渐增加（P〈0．05）,MEF2A与Q—SMA蛋白表达呈正相关（r=0．88,P〈0．05）。肝内胶原含量随肝纤维化的形成呈递增趋势（P〈0．01）。结论：MEF2A参与了CCl4。诱导的大鼠肝纤维化形成过程中HSC的活化和增殖。     

沉默结缔组织生长因子对大鼠肝纤维化的影响

目的 研究结缔组织生长因子(CTGF)小干扰RNA(siRNA)在CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型中的抗肝纤维化作用及其对肝星状细胞(HSC)激活的影响.方法 雄性SD大鼠24只,随机分成4组.模型组:皮下注射CCl4及经门静脉注射等渗盐水,每3 d 1次,连续6周(给药频率与时间,下同);CTGF siRNA干预组:皮下注射CCl4及经门静脉注射CTGF siRNA ;对照siRNA干预组:皮下注射CCl4及经门静脉注射对照siRNA;正常对照组:经门静脉注射等渗盐水.用HE染色和Sirius red染色评估大鼠肝组织学变化,Western blot检测肝组织CTGF及α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,免疫组织化学染色评估肝组织α-SMA阳性细胞数量.对实验数据用单因素方差分析或Kruskal-Wallis检验分析.结果 模型组及对照siRNA组大鼠肝组织CTGF及α-SMA蛋白表达显著上调,α-SMA染色阳性细胞数量明显增加.与模型组相比,CTGF siRNA组CTGF及α-SMA蛋白表达分别下调95%±2%和86%±11%(F值分别为21.234和12.473,P值均＜0.01);肝组织α-SMA染色阳性细胞数减少76%±9%(F=9.179,P＜0.01);组织学检查显示肝纤维化程度明显减轻.结论 siRNA沉默CTGF基因能显著减轻大鼠实验性肝纤维化,减少活化HSC数量可能是其改善肝纤维化的主要机制之一.     

参七内金散对肝纤维化模型大鼠肝组织转化生长因子-β1表达的影响

目的：探讨参七内金散抗大鼠肝纤维化的作用机制。方法：雄性SD大鼠32只随机分为3组：正常组、模型组、参七内金散组。除正常组外所有大鼠以CCl4皮下注射造模,首次注射100％CCl4 5ml／kg体重,之后40％CCl4-橄榄油溶液3ml／kg皮下注射,2次／周,连续注射6周。造模成功后参七内金散组以0．8g／kg的参七内金散灌胃大鼠,正常组与模型组大鼠则予以等量生理盐水灌胃,共2周。以盐酸水解法测定3组大鼠肝组织羟脯氨酸（Hyp）含量,分别以HE、天狼猩红染色观察大鼠肝组织的炎症与纤维化病理;以Real-time PCR及免疫印迹法检测大鼠肝组织TGF（转化生长因子）-β1 mRNA及蛋白表达。结果：与正常组比较,模型组大鼠肝组织可见大量肝组织脂肪变性及胶原病理沉积,并可见纤维间隔形成;参七内金散能显著改善模型大鼠肝组织脂肪变性与胶原病理沉积,降低肝组织Hyp含量;正常组大鼠肝组织可见少量TGF-β1mRNA及蛋白表达,模型组大鼠肝组织TGF-β1表达在mRNA和蛋白水平均显著性升高（P〈0．01）,参七内金散组大鼠肝组织TGF-β1mRNA及蛋白表达明显下调（P〈0．01）。结论：参七内金散具有抗肝纤维化作用;下调TGF-β1的表达可能是参七内金散抗肝纤维化的机理之一。     

银杏叶提取物对大鼠肝纤维化Activin A表达的影响

目的研究银杏叶提取物（EGB）对肝纤维化大鼠Activin A表达的影响及抗纤维化作用。方法2004-10-2005-4武汉大学人民医院消化内科将30只雄性大鼠随机分为3组：正常组、模型组及EGB干预组。模型组及EGB干预组给予四氯化碳（CCl4）腹腔注射造模，干预组同时每天给予EGB灌胃。8周后处死动物，取肝脏液氮冻存及甲醛固定，行HE染色，免疫组化及RT-PCR检测Activin A的表达。结果光镜下组织学检查纤维化分级EGB干预组低于模型组（P〈0．05），免疫组化及RT-PCR检测Activin A的表达EGB干预组低于模型组（P〈0．01）。结论EGB对CCl4诱导的大鼠肝纤维化有良好的防治作用，作用机制可能与肝组织Activin A表达减少有关。     

瘦素在实验性大鼠肝纤维化发生中的作用机制初探

目的通过检测肝纤维化大鼠血清及肝组织中瘦素（Leptin）的表达水平，初步探讨瘦素在大鼠肝纤维化发生中的作用机制。方法32只雄性SD大鼠，皮下注射四氯化碳（CCl4）油剂制备肝纤维化模型。分别于注射后1、4、8周处理动物。抽取血清并留取肝组织，采用放射免疫学方法检测血清中瘦素的表达水平。应用免疫组化方法检测肝组织中瘦素及转化生长因子β1（Transforming growth factor β1，TGF—β1）的表达。结果放免及免疫组化结果均显示，与正常对照组相比，注射CCl4诱导后，肝纤维化大鼠血清及肝组织中瘦素的表达水平明显升高（P〈0．01．〈0．05），且1，4，8周组瘦素的表达强度呈明显递增趋势（P〈0．01，〈0．05）。瘦素主要表达于肝星状细胞胞质中。结论瘦素主要表达于肝星状细胞，并可能通过窦内皮细胞发挥重要的促纤维化作用。     

结缔组织生长因子在大鼠肝纤维化形成中的作用

目的 研究结缔组织生长因子（CTGF）在大鼠肝纤维化形成中的表达及作用机制。方法 雄性SD大鼠32只,体重250～300g,皮下注射四氯化碳（CCl4）制备大鼠肝纤维化模型,分别于注射后1、4、8周处理动物．采用免疫组化、RT—PCR等方法对肝组织中CTGF的表达进行检测。结果 CCl4注射诱导后,大鼠肝组织中CTGF的表达较正常对照明显增强（P〈0．01）．且注射1、4、8周组肝组织中CTGF的表达强度呈逐级递增的趋势（P〈0．01,〈0．05）。CTGF主要表达于肝星状细胞胞质中．CTGF mRNA的表达与其蛋白质水平的改变相一致。结论 CTGF作为一种致纤维化因子,其过表达促进肝星状细胞的活化增殖及细胞外基质的形成,从而促进了大鼠肝纤维化的发生、发展。     

银杏叶提取物对大鼠肝组织TGF—β1mRNA表达及胶原沉积的影响

目的：研究银杏叶提取物（GbE)对CCl4大鼠肝组织TGF－β1mRNA表达及胶原沉积的影响。方法：Wistar大鼠40只随机分成正常组10只。四氯化碳（CCl4)组15只和GbE组（CCl4 GbE)组15只。12W后,观察各组大鼠肝纤维化程度;逆转录PCR法测定TGFβ1mRNA表达;测定肝组织丙二醛（MDA）及血浆血小板活化因子（PAF）含量。结果：CCl4组8只大鼠肝脏内形成假小叶,GbE组中3只大鼠肝脏有假小叶形成。GbE组大鼠TGFβ1mRNA表达、肝组织中MDA及血浆PAF含量明显低于CCl4组（P＜0．05）。结论：GbE能下调CCl4大鼠肝组织TGFβ1mRNA表达并抑制胶原沉积。     

扶正化瘀方对肝纤维化大鼠不同病理阶段肝组织蛋白质组变化的影响

目的探讨四氯化碳（CCl4）大鼠肝纤维化形成及消减不同时期肝组织蛋白质组的动态变化及扶正化瘀方的干预作用。方法40％CCl4-橄榄油溶液皮下注射法制备CCl4大鼠肝纤维化模型，治疗组给予扶正化瘀方灌胃，在第4、8、12和第16周末分批处死大鼠，观察各组大鼠肝组织病理学、羟脯氨酸（Hyp）含量变化，并提取肝组织蛋白质进行二维电泳，运用PDQUEST 2-DE软件对蛋白质图谱进行分析，以MALDI—TOF—MS鉴定差异表达的蛋白质。结果（1）二维电泳结果：模型大鼠特有蛋白质和表达量差异的蛋白质从第4周始出现，第12周达顶峰，（2）质谱鉴定的蛋白质多数在第4周出现，四个时间段均出现的有10个，其中有8个是正常组所没有的，（3）扶正化瘀方对表达差异的蛋白质调节表现在：第4、8周对上调的蛋白质降低作用显著，在第8、12、16周对下调的蛋白质的升高作用较显著，模型大鼠特有的蛋白质经扶正化瘀方干预后，通过降解、下调表达量等形式，趋向正常表达。结论（1）蛋白质表达改变是肝纤维化整体病变的物质基础。表达异常的蛋白质涉及机体的物质代谢、神经内分泌、细胞增殖凋亡等系统，（2）扶正化瘀方在抗细胞增生、促进正常蛋白质合成等方面有综合优势，通过对多个蛋白质、多途径的综合调节达到抗肝纤维化的效果。     

姜黄素对肝纤维化大鼠瘦素及瘦素受体表达的影响

目的：探讨姜黄素对实验性肝纤维化大鼠肝脏组织中瘦素（leptin）以及瘦素受体（leptin receptor）表达的影响。方法：将22只雄性SD大鼠随机分为3组：正常对照组、模型组、姜黄素治疗组。采用四氯化碳（CCl4）皮下注射制作大鼠肝纤维化模型。制备肝组织切片，行常规HE染色、Masson染色，观察各组大鼠肝脏病理学变化，采用肝纤维化病理分期进行病理学疗效评估；应用免疫组织化学法检测肝组织中瘦素以及瘦素受体的表达。结果：姜黄素对肝纤维化大鼠的肝脏病理分期具有明显的改善作用。并且免疫组织化学检测显示姜黄素能显著减少瘦素与瘦素受体的阳性表达。结论：姜黄素能明显改善实验性大鼠肝纤维化，同时下调肝纤维化大鼠肝脏中瘦素以及瘦素受体的水平，这可能是姜黄素抗肝纤维化作用的机制之一。     

沉默结缔组织生长因子对大鼠肝纤维化及细胞外基质积聚的影响

目的 研究结缔组织生长因子(CTGF)小干扰RNA(siRNA)在CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型中的抗肝纤维化作用及其对细胞外基质积聚的影响.方法 雄性SD大鼠30只,随机分成5组.模型组:皮下注射CCl4及经门静脉注射等渗盐水,3 d 1次,连续6周;预防组:皮下注射CCl4及经门静脉注射CTGF siRNA,连续6周;治疗组:皮下注射CCl4 2周,随后给予CTGF siRNA及CCl4 4周;对照siRNA干预组:皮下注射CCl4及经门静脉注射对照siRNA,连续6周;空白对照组:经门静脉注射等渗盐水6周.用HE和Sirius red染色评估大鼠肝组织学变化,RTPCR或(和)Western blot检测肝组织CTGF、Ⅰ与Ⅲ型胶原及层黏连蛋白的表达,放射免疫法检测外周血Ⅲ型前胶原及透明质酸含量.结果 模型组及对照siRNA组大鼠肝组织CTGF、Ⅰ与Ⅲ型胶原及层黏连蛋白基因表达显著上调;与模型组相比,预防组及治疗组由CCl4诱导的CTGF mRNA和蛋白表达及Ⅰ与Ⅲ型胶原、层黏连蛋白mRNA表达分别下调76%±8%、95%±2%、74%±8%、78%±8%、31%±7%和80%±3%、93%±3%、57%±6%、59%±10%、43%±9%(F值分别为68.630,21.234,24.219,16.315和9.716,P值均＜0.01),肝纤维化程度明显减轻,大鼠外周血Ⅲ型前胶原和透明质酸含量也显著降低.结论 经门静脉注射CTGF siRNA能显著抑制实验大鼠肝CTGF基因表达,由此通过阻止细胞外基质积聚而缓解肝纤维化.     

养肝软坚方抗大鼠肝纤维化的实验研究

目的：探讨中药复方养肝软坚方对四氯化碳（CCl4）诱导的实验大鼠肝纤维化的治疗作用。方法：60只雄性SD大鼠随机分为：正常对照组、模型组及治疗组,除正常对照组外所有大鼠均给予皮下注射40%CCl4（每3天1次,共11周）。造模3周后治疗组大鼠给予养肝软坚方10ml.kg-1.d-1,正常对照组及模型组大鼠给予等量生理盐水,1次/d,共8周。实验结束时检测大鼠肝功能、血清透明质酸（HA）、层黏连蛋白（LN）、Ⅲ型前胶原（PCⅢ）和肝脏羟脯氨酸（Hyp）,采用光镜观察肝脏病理组织学改变。结果：养肝软坚方能改善肝纤维化大鼠的肝功能,可显著降低血清HA、LN、PCⅢ水平和肝组织中过高的Hyp,病理组织学观察表明其能显著改善肝纤维化程度。结论：养肝软坚方对CCl4诱导的大鼠具有较好的抗肝纤维化作用。     

β胡萝卜素对实验性大鼠肝纤维化的影响

目的：研究β胡萝卜素对四氯化碳（CCl4）诱导的实验性大鼠肝纤维化的影响,并探讨其作用机制。方法：（1）在CCl4诱导实验性大鼠肝纤维化3周后,同时给予β胡萝卜素250000U/kg体重,每周2次灌胃,同时设正常及CCl4对照组(2) 脏组织学及超微结构改变,检测大鼠肝组织羟脯氨酸含量（生化法）、α2Ⅰ型胶原RNA（点杂交法）和转化生长因子β1（TGFβ1,免疫组化法）的表达。结果：β胡萝卜素防治组中,肝纤维化程度计分显著低于CCl4组（P＜0．05）,肝星形细胞中的脂滴数量少于正常对照组,但多于CCl4对照组β胡萝卜素防治组中,肝组织羟脯氨酸含量显著低于CCl4组（P＜0．05）;肝脏α2（Ⅰ）型前胶原RNA和TGFβ1表达显著低于CCl4组（P＜0．05）。结论上述剂量的β胡萝卜素,能显著降低由CCl4诱导的大鼠肝纤维化的程度,其作用机制可能与抑制TGFβ1在肝组织中的表达和减少肝脏星形细胞中的视黄醇脂滴的丢失有关。     

地龙2号对肝纤维化大鼠uPA和PAI-1蛋白表达的影响

目的研究蚯蚓提取物地龙2号对实验性大鼠肝纤维化的uPA和PAI-1蛋白表达的影响。方法52只雄性Wistar大鼠,随机分成6组:正常大鼠组(N);秋水仙碱对照组(CC);造模同时用秋水仙碱0.1mg.Kg-1.d-1灌胃,假模型组(NC):皮下注射花生油(CCl4),灌单蒸水;模型组对照组(MC):皮下注射CCl4花生油混合物,每日单蒸水灌胃;地龙大剂量组(Eh):造模同时用地龙2号50mg.Kg-1.d-1灌胃;地龙小剂量组(El):造模同时用地龙2号25mg.Kg-1.d-1灌胃。8周末处死大鼠,用免疫组化法检测各组大鼠肝脏组织中uPA和PAI-1的表达情况。结果地龙2号大、小剂量组与模型组相比,uPA和PAI-1的表达均显著降低,且uPA与PAI-1的表达下降呈明显的正相关。结论地龙2号可能通过抑制肝纤维化大鼠肝组织中肝星状细胞(HSC)的活化及抑制uPA、PAI-1的表达发挥抗肝纤维化作用。     

姜黄素治疗肝纤维化与肝星状细胞的关系

目的观察姜黄素治疗大鼠肝纤维化中活化肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的数目、分布、凋亡等变化,探讨两者间的关系。方法以四氯化碳(CCl4)腹腔注射的方法制作大鼠肝纤维化模型,姜黄素治疗组于第9周起分别予姜黄素10、20、40 mg/100 g体质量灌胃,设立正常组、溶剂组、模型组和丹参组,14周后处死大鼠,留取肝左叶行HE和Masson胶原染色,光镜下观察病理学改变,并按SSS计分系统进行肝纤维化程度评分,免疫组化方法检测α-SMA,TUNEL与Desmin免疫组化双染法检测HSC凋亡。结果与模型组比较,姜黄素组能明显改善CCl4所致大鼠肝纤维化的病理学改变,肝纤维化评分明显降低(P0.05),接近正常组。与正常组比较,模型组活化HSC明显增多,而极少发生凋亡,姜黄素可以明显减少活化HSC数量并增加其凋亡率(P0.05);上述作用随姜黄素剂量的增加而增强。结论姜黄素可抑制HSC活化、增殖,诱导HSC凋亡,姜黄素可能通过上述机制发挥治疗肝纤维化的作用。     

软肝冲剂对肝纤维化大鼠组织金属蛋白酶抑制剂的影响

目的：探讨软肝冲剂治疗肝纤维化和肝硬化的机制是否与抑制TIMP-1的表达有关。方法：用CCl4诱导大鼠的肝纤维化模型（病理分期为0-Ⅴ期），将大鼠随机分成两组，分别用软肝冲剂和生理盐水治疗2个月后。对肝组织TIMP-1mRNA的表达进行分析，并检测羟脯氨酸（Hyp）的量，同时检测血清中TIMP-1和TGF-β1的浓度。结果：软肝冲剂能够降低大鼠肝组织中TIMP-1mRNA的表达和胶原蛋白的含量，同时血清中TIMP-1和TGF-β1较CCl4诱导的模型组和生理盐水治疗组显著降低（P〈0．05）。结论：软肝冲剂治疗肝纤维化可能通过阻止TIMP-1的表达起作用。     

自拟中药对CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝组织Smad3表达的影响

目的研究自拟中药对CCl4诱导的大鼠肝纤维化肝脏Smad3表达的影响，探讨其抗纤维化的作用机制。方法Wistar大鼠40只，随机分成正常对照组、模型组、自拟中药组、鳖甲软肝片组，采用CCl4背部皮下注射构建肝纤维化模型，行HE和VG染色，光镜下观察肝组织肝纤维化程度。同时免疫组化SABC方法检测各组Smad3的表达。结果与正常对照组比，模型组Smad3表达明显增强，自拟中药组大鼠肝脏Smad3的表达（0．279±0．085对0．885±0．904，P〈0．05）显著下调。另外，自拟中药组大鼠肝脏肝纤维化病理变化显著改善。结论自拟中药对CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型肝脏Smad3表达有明显的下调作用，可能是其抗肝纤维化的主要作用机制之一。