EGF与bFGF单独及联合应用对原代培养的兔角膜缘干细胞克隆形成率的影响

目的了解单独及联合应用表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(b-fibroblast growth factor, bFGF)对原代培养的兔角膜缘干细胞体外增殖的促进作用.方法进行兔角膜缘干细胞原代培养,用克隆形成率和蛋白质免疫印迹方法检测单独及联合应用不同质量浓度EGF与bFGF对干细胞增殖力的影响.结果角膜缘干细胞在本培养条件下能够正常生长.单独应用时,质量浓度为10 ng/ml的EGF和20 ng/ml的bFGF对干细胞的促增殖作用最强(P<0.01),10 ng/ml的EGF与20 ng/ml的bFGF联合应用可达到最佳的促干细胞增殖作用.蛋白质免疫印迹检测也得到了相符的结果.结论体外单独及联合应用EGF与bFGF对原代培养的兔角膜缘干细胞的增殖能力有明显的促进作用,为提供大量的角膜缘干细胞以治疗眼表疾病提供了实验基础.     

表皮生长因子与碱性成纤维生长因子对人牙髓干细胞增殖的影响

目的：探讨表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)增殖能力的影响。方法：采用噻唑蓝（MTT）比色法分别测定不同浓度EGF和bFGF在不同时间,单独或联合应用对hDPSCs增殖能力的影响。结果：50 ng/ml EGF和20 ng/ml bFGF促hDPSCs增殖能力最强。以50ng/ml EGF、20ng/ml bFGF单独或联合作用,其促hDPSCs增殖能力均具有时间依赖性,第3 d、5 d、7 d, EGF、bFGF促hDPSCs增殖作用显著增强,二种生长因子联合作用,促增殖作用显著高于其单独作用效果,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：生长因子EGF和bFGF最大效应浓度分别为：50 ng/ml、20 ng/ml。EGF和bFGF单独作用均能显著促进hDPSCs的增殖,二者联合作用对hDPSCs的增殖有一定的协同作用。     

碱性成纤维细胞生长因子对体外培养人羊膜间充质干细胞增殖的影响

目的观察不同浓度碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对体外培养人羊膜间充质干细胞(HAMSCs)增殖的影响,以探索体外培养HAMSCs的最适条件。方法分离、培养HAMSCs,选取第3代细胞进行鉴定及检测。实验组将bFGF分为0.1、0.5、1、5、10、20、40、80ng/ml共8个浓度组;阴性对照组只加HAMSCs,不加bFGF;空白对照组只加培养基。各组孵育48h后加入Am-Blue试剂,继续孵育,待培养基由靛青蓝色开始变成粉红色时取出用酶标仪测量各组的吸光度(OD),重复3次实验。结果 0.5、1、5、10、20、40、80ng/ml浓度组与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05);10ng/ml组与0.5、1、5ng/ml组相比,差异均有统计学意义(P<0.05);10ng/ml组与40、80ng/ml组相比,差异无统计学意义(P=0.067),表明bFGF促增殖作用最强的最小浓度为10ng/ml。结论 bFGF能够促进HAMSCs增殖,且促增殖作用最强的最小浓度为10ng/ml。     

bFGF对人牙周膜细胞增殖的影响

目的 检测碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对体外培养人牙周膜细胞的增殖效应,探讨bFGF参与正畸牙移动的作用机制。方法 体外培养人牙周膜细胞,将第5代细胞按细胞数约为4×10<'3>/孔接种在96孔培养板的50孔中,每5孔为一组,共分为10组。根据每组bFGF浓度不同,分为无bFGF组、0.5 ng/mL bFGF组、1.0 ng/mL bFGF组、2.0 ng/mL bFGF组、4.0 ng/mL bFGF组、8.0 ng/mL bFGF组、16.0 ng/mL bFGF组、32.0 ng/mL bFGF组、64.0 ng/mL bFGF组及128.0 ng/mL bFGF组。显微镜下观察各组细胞均进入对数生长期时,用噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法染色,在酶联免疫检测仪上测出各孔吸光度(opficM density,OD)值,并计算各组OD均值。结果 与对照组OD均值比较：实验组OD值随bFGF浓度(0.5～16.0 ng/mL)的增加先逐渐增加(P<0.05,0.01),达到峰值(16.0 ng/mL)后,又随bFGF浓度(32.0～128.0 ng/mL)的增加而逐渐减少(P<0.05,0.01)。结论 bFGF可能参与了正畸牙移动中牙周组织的改建,bFGF较低浓度时有促进人牙周膜细胞增殖的作用,而较高浓度时有抑制人牙周膜细胞增殖的作用。     

生长因子浓度和添加方式对兔间充质干细胞生长的影响

目的探讨不同浓度bFGF和TGF-β1、bFGF不同添加方式对间充质干细胞增殖的影响。方法取兔间充质干细胞(MSCs),梯度离心,分离培养。取第4代细胞,分别添加不同浓度bFGF(0、10、50、80、100ng/ml)及序贯或同时加入TGF-β1、bFGF。观察细胞形态变化,MTT法测定各组细胞吸光值。结果各组细胞形态无显著差异。高浓度bFGF及序贯加入TGF-β1、bFGF,吸光值测定高于其他各组(P<0.05)。结论bFGF浓度增加,促增殖作用加强。序贯添加TGF-β1、bFGF,小剂量可明显促进细胞增殖。     

不同浓度EGF对人脐血间充质干细胞增殖的研究

目的探索不同浓度表皮生长因子（EGF）对人脐血间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）增殖的影响。方法无菌条件下来集正常人脐血，密度梯度离心法分离脐血单个核细胞，用Mesencult培养基进行纯化和扩增培养，通过MTT法检测不同浓度的EGF的促人脐血MSCs增殖作用。结果EGF的5—100ng／ml各浓度组增殖效应均明显大于对照组（P〈0．05），10ng／ml组明显大于其它各浓度组（P〈0．01）。结论EGF对体外培养的人脐血MSCs有促进增殖的作用，此作用呈剂量依赖性。     

EGF与bFGF对体外大鼠巩膜成纤维细胞增殖的影响

目的研究表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维生长因子（bFGF）在体外对大鼠巩膜成纤维细胞生长的影响。为进一步了解近视发生的分子机制提供依据。方法采用植块法培养大鼠巩膜成纤维细胞。细胞经传代纯化鉴定后，取第3～4代细胞加入不同浓度的EGF（0．1～200ng／mL）、bFGF（0．1～50ng／mL）。分别培养24、48、72h用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞的增殖密度。观察不同浓度、时间下细胞增殖情况。结果发现0．1～100ng／mL的EGF和0．1～50ng／mL的bFGF对大鼠巩膜成纤维细胞均有明显的促增殖作用，且呈剂量相关性。结论一定浓度的EGF、bFGF对体外培养的大鼠巩膜成纤维细胞的生长具有促进作用。     

人表皮生长因子对牛角膜内皮细胞增殖和细胞周期的影响

目的 观察表皮生长因子(EGF)对牛角膜内皮细胞增殖和细胞周期的影响.方法 采用体外培养的牛角膜内皮细胞,在培养液中分别添加不同浓度的人表皮生长因子(hEGF),加药后第3、7天采用MTT法,在酶标仪492 nm波长处测定吸光度值观测细胞增殖,并记录细胞形态变化.将体外培养的牛角膜内皮细胞分为二组,常规DMEM培养液组和含50 ng/mL EGF的DMEM培养液组,培养3、7天后,应用流式细胞仪检测细胞周期各阶段G1、S、G2期分布.结果 与对照组相比,不同浓度EGF组对牛角膜内皮细胞增殖有促进作用且与浓度相关,其中10 ng/mL和100 ng/mL组作用强于1 ng/mL组.EGF加入后3 d,对照组S期细胞24.5%,G2-M期细胞0.08%,加药组S期细胞24.6%,G2-M期细胞0.06%.与对照组相比较,各期细胞分布大致相等,无显著差异.加入7 d后对照组S期细胞20.8%,G2-M期细胞0.41%,加药组S期细胞18.2%,G2-M期细胞1.55%,细胞分布发生明显变化.结论 EGF促进体外培养的牛角膜内皮细胞增殖,并使体外培养的牛角膜内皮细胞的细胞周期发生变化,S期细胞比例下降.     

人表皮生长因子对牛角膜内皮细胞增殖和细胞周期的影响

目的观察表皮生长因子(EGF)对牛角膜内皮细胞增殖和细胞周期的影响。方法采用体外培养的牛角膜内皮细胞,在培养液中分别添加不同浓度的人表皮生长因子(hEGF),加药后第3、7天采用MTT法,在酶标仪492nm波长处测定吸光度值观测细胞增殖,并记录细胞形态变化。将体外培养的牛角膜内皮细胞分为二组,常规DMEM培养液组和含50ng/mLEGF的DMEM培养液组,培养3、7天后,应用流式细胞仪检测细胞周期各阶段G1、S、G2期分布。结果与对照组相比,不同浓度EGF组对牛角膜内皮细胞增殖有促进作用且与浓度相关,其中10ng/mL和100ng/mL组作用强于1ng/mL组。EGF加入后3d,对照组S期细胞24.5%,G2-M期细胞0.08%,加药组S期细胞24.6%,G2-M期细胞0.06%。与对照组相比较,各期细胞分布大致相等,无显著差异。加入7d后对照组S期细胞20.8%,G2-M期细胞0.41%,加药组S期细胞18.2%,G2-M期细胞1.55%,细胞分布发生明显变化。结论EGF促进体外培养的牛角膜内皮细胞增殖,并使体外培养的牛角膜内皮细胞的细胞周期发生变化,S期细胞比例下降。     

肉苁蓉多糖的促淋巴细胞增殖作用

目的研究肝细胞生长因子（HGF）和表皮生长因子（EGF）对体外培养的SD大鼠肝脏干细胞增殖的时间和剂量效应,为肝脏疾病的基础和临床研究奠定基础。方法肝干细胞用无血清培养基培养,观察不同浓度和不同时间HGF、EGF及HGF和EGF联合对大鼠肝脏干细胞增殖的影响。结果从成体大鼠肝脏分离的肝干细胞体积小、外形及胞核为圆形或椭圆形。EGF组5-160ng／ml各浓度组、HGF组10～160ng／ml各浓度组增殖效应均明显大于对照组（P〈0．05）,且当HGF浓度为20ng／ml时,增殖效应明显大于与其它各组（P〈0．01）;HGF组加10ng／mlEGF组中,除1、5ng／ml外,其余各组增殖效应均明显大于对照组（P〈0．01）。20ng／mlHGF的时间效应实验结果表明,随着作用时间的延长,对干细胞有明显的增殖效应,于第5天达到高峰,第7天较第5天略有降低。10ng／mlEGF的时间增殖效应结果显示,随着时间的延长,于第7天达到高峰,但第7天与第5天相比没有显著差异。20ng／mlHGF和10ng／mlEGF联合对细胞的增殖效应结果显示,第1天作用不明显,于第3天达到高峰。结论EGF和HGF具有明显改善SD大鼠肝脏干细胞体外无血清培养条件的作用,对离体培养的大鼠肝脏干细胞增殖具有协同促进作用。     

ET-1、rhEGF、bFGF对培养的兔角膜内皮细胞的影响

目的 研究内皮素-1(ET-1)、重组人表皮生长因子(rhEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对培养的兔角膜内皮细胞增殖能力的影响及其相互作用。方法 在体外培养的兔角膜内皮细胞中单独使用或联合应用ET-1、rhEGF、bFGF，采用MTT方法观察对细胞增殖的影响，免疫组化染色法和计算机图像分析系统检测对细胞增殖细胞核抗原(PcNA)表达的影响。结果 一定浓度ET-1促进培养的兔角膜内皮细胞的增殖，且呈剂量相关性。10pmol／L时起作用，200pmol／L时发挥最大作用。10ng／ml rhEGF、2ng／mlbFGF也促进培养的兔角膜内皮细胞的增殖。联合应用ET-1 rhEGF、ET-1 bFGF、ET-1 rhEGF bFGF，细胞吸光度(A)值明显高于单独使用相应药物时A值之和。ET-1、rhEGF、bFGF单独使用可促进培养的兔角膜内皮细胞PCNA表达，联合应用时PCNA表达平均吸光度A值明显强于单独使用相应药物时表达强度之和。结论 ET-1可作为一种生长因子，它和rhEGF、bFGF单独使用可促进培养的兔角膜内皮细胞增殖能力，联合应用时具有协同作用。     

以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜的构建及移植

目的进行体外分离和培养兔角膜缘干细胞,使之成为一种上皮组织,以便进行角膜移植。方法组织块法体外培养兔角膜缘干细胞：角膜缘组织块作为外植体,在脱细胞猪角膜基质上培养;获得的复合角膜上皮组织移植于兔眼,观察并记录兔角膜组织生长情况,待角膜组织生长良好后做免疫组织化学鉴定。结果兔角膜缘组织应用组织块法在脱细胞角膜基质上生长9~10 d后达到80%汇合状态,显微镜下动态观察细胞生长良好,增殖能力较高,将组织工程化角膜上皮作异体板层角膜移植于兔眼后,4~5 d角膜上皮光滑,20~21 d角膜变为透明,荧光素染色只见缝线处少许着色,期间未见角膜移植排斥反应。术后30 d HE染色显示角膜组织与宿主角膜组织结合良好,上皮细胞可见4~5层结构,可见角膜缘干细胞多呈卵圆形;免疫荧光染色可见培养的细胞P63、CK3单克隆抗体呈阳性表达。结论以组织块法生长的以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜可在角膜缘干细胞缺乏的兔眼上生长良好。     

低氧对人骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的影响

目的 探讨低氧对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)向神经细胞分化的影响.方法 将第2代hBM-SCs进行传代、纯化,取第4代hBMSCs进行流式细胞仪检测鉴定;以含1％ FBS的α-MEM为基础诱导培养基,根据处理条件不同分为4组:常氧对照组、低氧对照组(3％氧浓度)、常氧诱导组[添加20 ng/mL表皮生长因子(E GF)及20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)]、低氧诱导组(3％氧浓度下添加20 ng/mL EGF及20 ng/mL bFGF).连续诱导3d后,采用RT-PCR及Western blot技术检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白2(MAP-2)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)在基因及蛋白水平表达变化.结果 第4代hBMSCs流式鉴定结果示:骨髓基质标志CD105、CD90、CD29表达分别为95.8％、98.2％、95.1％,而造血细胞标志CD19表达为0.2％;与常氧对照组比较,低氧对照组NSE、MAP-2、GFAP在基因及蛋白水平表达均无明显改变(P＞0.05),而常氧诱导组及低氧诱导组相应表达均升高(P＜0.05),且低氧诱导组表达高于常氧诱导组(P＜0.05).结论 低氧促进EGF联合bFGF对hBMSCs向神经元细胞及神经胶质细胞分化的诱导作用.     

RCE1 corneal epithelial cell line: its variability on phenotype expression and differential response to growth factors

BACKGROUND: By serial transfer of rabbit corneal epithelial cells, the spontaneous RCE1 cell line was previously established. These cells mimic the stage-dependent differentiation of the corresponding cell type. METHODS: RCE1 cells were cultured either on plastic culture dishes or on collagen rafts to compare the epithelial ultrastructure after growth on these substrata. Phenotypic variability was studied after subcloning of cells. The differentiation ability of each subclone was determined by Western blot with antibodies against the differentiation-linked keratin pair K3/K12 and by measuring LDH activity and LDH isozymes in cytosolic extracts. The proliferative response of RCE1 cells to EGF, TGFalpha, amphiregulin, bFGF or IL-6 was determined under serum-free culture conditions. RESULTS: Cells grown on collagen rafts formed 5- to 7-layered epithelia with characteristics closer to those found in normal corneal epithelium than cells cultivated on plastic substrata, which formed 3- to 5-layered epithelia. Subcloning experiments demonstrated that every proliferative cell is able to grow and constitute stratified epithelia expressing K3/K12 keratins. LDH levels in RCE1 epithelia were similar to those of cultured or freshly harvested corneal epithelia; however, they showed a slightly altered LDH isozyme set, with prevalence of LDH-3 isoform. Whereas EGF and TGF-alpha were equipotent, amphiregulin elicited a 4-fold lower proliferative response. Also, bFGF was 10-fold less mitogenic than EGF, and IL-6 had the lowest effect with an ED(50) 20-fold lower than EGF. CONCLUSIONS: The results demonstrate that every RCE1 proliferative cell has the ability to generate epithelial sheets. We conclude that EGF and TGF-alpha are the major effectors of RCE1 cell proliferation.     

兔眼翼状胬肉模型建立的预实验分析

目的:建立兔眼翼状胬肉模型。方法:切除颞上象限LSCs+1.25%盐酸点眼刺激以建立兔眼翼状胬肉模型,每周观察角膜上皮缺损、结膜充血、新生组织生长情况。于第14周末取LSCs缺损的角膜缘标本(实验组)及同眼对侧角膜缘标本(对照组),共8个标本,行HE染色分析。结果:兔眼翼状胬肉模型未造成功,观察14周未见角膜缘新生组织,仅2眼穹窿结膜处少许增生。HE染色示:实验组角膜缘处上皮不平整、细胞大量增生,基底层组织疏松,有炎细胞;而对照组角膜缘结构几乎完整。结论:翼状胬肉模型失败有两种解释:首先翼状胬肉发病机制复杂,仅切除角膜缘+慢性盐酸刺激可能不足以导致翼状胬肉的发生;其次切除角膜缘+慢性盐酸刺激可以导致翼状胬肉的发生,而本实验所得结果为假阴性。翼状胬肉动物模型尚不成熟,待进一步探索研究。     

水杨酸钠对新生小鼠下丘核区神经干细胞分化的影响

目的　在体外培养新生小鼠下丘核区NSCs的基础上 ,研究水杨酸钠对NSCs分化的影响。方法　分离、收集新生昆明小鼠下丘核区脑组织 ,体外经EGF和bFGF刺激下培养 ;通过免疫细胞化学方法染色鉴定神经干细胞及其子代细胞的分化方向和水杨酸钠给药后分化为神经元的细胞的GABA和Glu蛋白表达。结果　培养的部分细胞在特定生长因子的作用下可分裂、增殖 ,同时表达神经干细胞特异性抗原nestin ,并在撤除生长因子后向神经元和胶质细胞分化。干细胞分化的神经元中的GABA和Glu蛋白表达位于细胞质和细胞核。在无水杨酸钠组两类递质阳性着色细胞数没有明显差异 ;水杨酸钠给药后Glu阳性着色细胞数较GABA阳性着色细胞数明显增加 ,吸光度值比较有显著性差异 (P <0 0 1)。结论　①小鼠下丘核区存在着具有多向分化潜能的神经干细胞。②水杨酸钠具有促进NSCs分化为Glu阳性神经元的作用。     

牛磺酸对角膜基质细胞增殖和移行的影响

目的:观察牛磺酸(taurine)对体外培养的兔角膜基质细胞增殖和移行的影响。方法:将原代培养的兔角膜基质细胞传至2代～3代用于实验,分别加入不同浓度的牛磺酸,用细胞计数法和MTT法检测牛磺酸对角膜基质细胞增殖的影响;用缺损闭合法观察牛磺酸对角膜基质细胞移行的影响。结果:细胞计数法和MTT法均显示牛磺酸浓度≥100 mmol/L时对兔角膜基质细胞增殖均有明显的抑制作用,其抑制作用呈剂量依赖性。缺损闭合法显示牛磺酸对角膜基质细胞移行具有抑制作用。牛磺酸浓度低于100 mmol/L时对兔角膜基质细胞抑制作用不明显。结论牛磺酸具有抑制兔角膜基质细胞增殖和移行的作用,对于防治角膜创伤修复后瘢痕形成,特别是准分子激光术后角膜上皮下雾状混浊的形成具有十分重要的意义。