EGF与bFGF单独及联合应用对原代培养的兔角膜缘干细胞克隆形成率的影响

目的了解单独及联合应用表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(b-fibroblast growth factor, bFGF)对原代培养的兔角膜缘干细胞体外增殖的促进作用.方法进行兔角膜缘干细胞原代培养,用克隆形成率和蛋白质免疫印迹方法检测单独及联合应用不同质量浓度EGF与bFGF对干细胞增殖力的影响.结果角膜缘干细胞在本培养条件下能够正常生长.单独应用时,质量浓度为10 ng/ml的EGF和20 ng/ml的bFGF对干细胞的促增殖作用最强(P<0.01),10 ng/ml的EGF与20 ng/ml的bFGF联合应用可达到最佳的促干细胞增殖作用.蛋白质免疫印迹检测也得到了相符的结果.结论体外单独及联合应用EGF与bFGF对原代培养的兔角膜缘干细胞的增殖能力有明显的促进作用,为提供大量的角膜缘干细胞以治疗眼表疾病提供了实验基础.     

EGF和bFGF对成年大鼠神经干细胞增殖和分化的影响

目的 :探索能获得较多成年大鼠神经干细胞克隆及其分化后产生较多神经元的方法。方法 :取成年SD大鼠前脑室下区(SVZ)组织 ,接种于 2 4孔培养板中 ,实验分成EGF、bFGF和EGF +bFGF三组 ,观察克隆球的形成情况。 7天后一部分克隆球消化成单细胞悬液后进行BrdU标记及免疫荧光检测 ;另一部分克隆球在含血清的培养液中进行贴壁分化 ,14天后 ,分别用MAP -2和GFAP的单克隆抗体进行免疫荧光标记。结果 :原代培养EGF组培养液中克隆球的数量少 ,克隆球直径也小 ;bFGF组和EGF +bFGF组培养液中克隆球的数量多 ,克隆球也较大。bFGF组和EGF +bFGF组MAP -2阳性神经元的数量明显多于EGF组 ,而EGF组中可见到能产生较多的GFAP阳性细胞。结论 :bFGF较EGF更能促进神经干细胞增殖 ,并可诱导神经干细胞较多地向神经元分化     

外源性基因在兔角膜缘干细胞中的表达及意义

目的 探讨外源性bFGF(fibronlast growth factor,bFGF)基因转染体外培养的兔角膜缘干细胞(human limbal stem cells,LSCs)的可行性.方法 体外培养兔LSCs并用AE5作鉴定.通过脂质体将重组质粒pEGFP-bFGF转染兔LSCs,观察转染结果 ,表达情况及对靶细胞活力的影响.结果 体外成功培养并用AE5鉴定原代免LSCs,基因转染48h后荧光显微镜下可见特异性的绿色荧光,没有发现明显的细胞毒性作用及对细胞活力的显著影响.结论 采用真核质粒可以介导外源性基因转染兔LSCs,为将来采用基因增强组织工程方法 治疗难治性眼表疾病提供初步的实验基础.     

兔角膜缘干细胞的体外原代培养和生物学鉴定

目的 建立兔角膜缘干细胞体外培养方法,观察其生物学特性。方法 用含20％胎牛血清1640培养液对兔角膜缘干细胞进行体外培养,倒置显微镜观察培养细胞体外生长的形态,电镜观察培养细胞的超微结构并进行免疫细胞化学和间接免疫荧光鉴定。结果 植块48～72h细胞开始贴壁生长,7～10d形成良好的单层,细胞呈圆形、卵圆形或多边形,类似角膜上皮细胞;电镜下,可见细胞表面有许多微绒毛,细胞间有桥粒连接,胞质丰富,胞质细胞器较多,含有线粒体等结构;免疫细胞化学和间接免疫荧光染色显示,培养第8天少量细胞角蛋白K3(AE5)免疫反应呈阳性,细胞质被染色,培养第14天和第21天,较多细胞．AE5免疫反应阳性。结论 含20％胎牛血清1640培养液能作为角膜缘干细胞培养的基础液。应用组织培养方法获得的原代培养细胞具有与正常角膜缘干细胞相一致的生物学特性。     

深低温保存兔角膜缘干细胞的体外培养

目的 探寻深低温保存兔角膜缘干细胞的体外培养方法。方法 将2mm宽的兔角巩膜组织通过程序降温仪降温后置于-196℃液氮中深低温保存。1年后复温，应用消化培养法分别对冻存及新鲜的兔角膜缘干细胞进行体外培养，观察并记录细胞生长情况，HE染色观察培养细胞的形态特征。结果 经过深低温保存的兔角膜缘干细胞可以在体外被成功培养并传代，其在原代培养48h后开始贴壁生长，5d后生长较旺盛，但可见部分破裂和死亡细胞，约12d基本形成单层；传代培养时次日贴壁，7d形成单层。新鲜兔角膜缘干细胞原代培养时细胞形态相似，但破碎死亡细胞少见，且于7d左右即基本形成单层，传代时两者无明显差别。结论 深低温保存的角膜缘干细胞能被成功地进行体外培养，培养后细胞具有与培养的新鲜角膜缘干细胞基本相似的特性，为深低温保存的角膜缘干细胞培养后移植治疗临床眼表疾病提供了实验依据，并为眼库技术的发挥开辟了新的应用途径。     

兔角膜缘干细胞的体外培养和生物学特性观察

目的 探讨兔角膜缘干细胞的体外培养方法并观察其生物学特性。方法 采用消化培养法，分2组培养，1组为消化并过滤后的角膜缘干细胞培养组，另1组为消化后未过滤的带组织块培养组，均用含20％胎牛血清的培养液培养，待细胞长成良好单层后消化传代，分别观察记录细胞在原代和传代培养时的生长特性并行HE染色观察。结果 过滤组角膜缘干细胞在培养24h后开始贴壁生长，7～10d形成良好单层，细胞以圆形或椭圆形为主，核较大，呈原始细胞特征，传代培养时见细胞体积逐渐增大，核变小，成纤维细胞少见；带组织块培养组原代培养时与过滤组无明显差异，传代时则见成纤维细胞渐增多，至第3代时占主导并抑制了角膜缘干细胞的生长。结论 采用消化培养法可成功培养出兔角膜缘干细胞，培养时应滤除组织块以减少成纤维细胞的影响。     

角膜缘干细胞分布变化对角膜曲率的影响

目的　研究上下方角膜缘上皮非对称性损害对角膜曲率的影响。方法　将兔的 11 1点方位的角膜缘上皮保留 ,其他方位角膜缘在外围保留 0 2mm宽的上皮带 ,其余上皮全部刮除 ,造成角膜上下方干细胞储备的差异。采取角膜地形图测量、组织学等方法观察角膜形态变化。结果　角膜中央区出现锥形凸起 ,锥形凸起处屈光值 (5 7 2 5± 2 73屈光度 )比术前角膜对应点屈光值 (5 2 2 3± 1.91屈光度 )明显增大 ,差异有显著意义 (P <0 0 1) ,组织学观察角膜锥形凸起处有代偿性增生的上皮细胞团。结论　角膜中央代偿性上皮增生可以显著地改变角膜曲率 ,角膜缘干细胞的分布异常是造成角膜中央上皮代偿性增生的原因之一。     

羊膜联合角膜缘干细胞移植治疗角膜缘缺陷症42例

眼烧伤、复发性翼状胬肉等眼表疾病常导致眼表层完整性破坏,表现为持续性角膜上皮缺损,异常角膜上皮愈合,胬肉复发、睑球粘连等．称为角膜缘缺陷症。1999年6月至2002年6月我们以羊膜联合角膜缘干细胞移植治疗角膜缘缺陷症42例42眼,效果良好．现报告如下。     

兔角膜缘干细胞的体外培养、鉴定及形态学特点

目的 体外培养兔角膜缘干细胞(limbal stem cells,LSCs),观察其生物学特性.方法 用含20%胎牛血清DMEM:F12(1:1)培养基对兔LSCs进行体外培养,倒置显微镜及HE染色观察培养细胞体外生长的形态,免疫细胞化学AE5和P63染色鉴定并进行图像分析,透射电镜观察超微结构特点.结果 培养2～3 d细胞从组织块游出,6～8 d形成良好的单层,细胞多呈圆形或卵圆形.电镜观察,培养7 d LSCs呈卵圆形,表面有少量微绒毛突起;胞质内细胞器少,核大,核仁明显,核浆比例大,部分细胞可见双核现象.免疫组化观察,培养第7天,大量细胞AE5免疫反应染色呈阴性,阳性细胞数量较少,大量细胞P63免疫反应染色呈阳性;培养第14天,AE5阳性细胞数明显增多,免疫反应染色增强,阳性细胞的平均灰度值显著降低(7 d:184.30±9.85,14 d:133.36±25.00,P<0.01).P63免疫反应阳性细胞数第14天与第7天相比明显减少,而阳性细胞的平均灰度值显著增高(7 d:108.13±17.96,14 d:177.59±7.86,P<0.01).结论 应用组织培养方法获得的原始细胞具有与体内正常LSCs相一致的形态特征;培养第7天为LSCs生长的峰值期.     

角膜缘干细胞移植治疗翼状胬肉疗效的初步观察

目的观察胬肉切除联合角膜缘干细胞移植术治疗翼状胬肉的疗效,探讨降低翼状胬肉术后复发率的方法.方法选择翼状胬肉患者共24例28眼,按原发性胬肉和复发性胬肉分为两组,行胬肉切除联合自体角膜缘干细胞移植术.观察术后效果.结果角膜上皮修复时间为(3.1±0.3)d,原发性胬肉组与复发性胬肉组分别为(3.1±0.2) d和(3.3±0.5) d,P＞0.05,总复发率为3.57%,原发性胬肉组0眼复发,复发性胬肉组1眼复发,P＞0.05.22眼(78.6%)术后视力较术前有不同程度的提高,原发性胬肉组与复发性胬肉组视力提高分别为20眼和2眼,P＜0.01.结论胬肉切除联合角膜缘干细胞移植术是一种治疗翼状胬肉较好的方法.     

表皮生长因子与碱性成纤维生长因子对人牙髓干细胞增殖的影响

目的：探讨表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)增殖能力的影响。方法：采用噻唑蓝（MTT）比色法分别测定不同浓度EGF和bFGF在不同时间,单独或联合应用对hDPSCs增殖能力的影响。结果：50 ng/ml EGF和20 ng/ml bFGF促hDPSCs增殖能力最强。以50ng/ml EGF、20ng/ml bFGF单独或联合作用,其促hDPSCs增殖能力均具有时间依赖性,第3 d、5 d、7 d, EGF、bFGF促hDPSCs增殖作用显著增强,二种生长因子联合作用,促增殖作用显著高于其单独作用效果,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：生长因子EGF和bFGF最大效应浓度分别为：50 ng/ml、20 ng/ml。EGF和bFGF单独作用均能显著促进hDPSCs的增殖,二者联合作用对hDPSCs的增殖有一定的协同作用。     

自体角膜缘干细胞移植联合丝裂霉素C治疗翼状胬肉

目的研究自体角膜缘干细胞移植联合丝裂霉素C治疗翼状胬肉的疗效。方法将58例翼状胬肉患者的胬肉组织切除后用含2mg/ml MMC棉片置于手术区球结膜及巩膜之间2～3 min,再取上方自体角膜缘干细胞及其邻近球结膜植片移植、修复创面。结果随访期内无翼状胬肉复发,未见严重并发症。结论自体角膜缘干细胞移植联合丝裂霉素C治疗翼状胬肉可以显著降低翼状胬肉的复发率。     

兔健眼角膜缘干细胞取材安全范围的实验研究

目的 确定自体角膜缘干细胞移植健眼取材的安全范围,为临床治疗提供实验依据.方法 兔眼角膜按30°、60°、90°等依次递增至210°分组切取角膜缘干细胞组织,术后不同时间点裂隙灯下动态观察每组角膜混浊、角膜上皮染色、新生血管3项临床指标,角膜上皮印迹细胞学检查及HE染色观察角膜上皮的细胞表型和病理学改变.结果 兔眼角膜缘切取范围大于150°时,出现角膜混浊,上皮持续缺损及新生血管长入,临床指标评分比较,差异有统计学意义(P＜0.01).印迹细胞学检查显示PAS阳性的结膜细胞.组织病理学可见角膜缘上皮细胞层次减少和新生血管.结论 自体角膜缘干细胞移植健眼的取材范围≤150°(相当于5个钟点位)是安全的.切取范围＞150°时角膜缘干细胞可能出现不可逆的失代偿.印迹细胞学检查是诊断角膜缘干细胞缺乏简单有效的方法.     

自体角膜缘干细胞移植术治疗翼状胬肉疗效观察

目的: 探讨自体角膜缘干细胞移植术治疗翼状胬肉的临床疗效。方法: 选取84例(98眼)翼状胬肉患者, 随机分为A、B 2组。A组42例(50眼)予以常规单纯翼状胬肉切除术治疗, B组42例(48眼)予以翼状胬肉切除联合自体角膜缘干细胞移植术治疗, 比较2组患者术后复发率、治愈率、角膜创面上皮愈合时间及术后不良反应。结果: B组复发率4.2%, 低于A组的20.0%(P<0.05), B组角膜创面上皮愈合时间(4.1±1.9)d, 少于A组的(6.9±2.3)d(P<0.01);B组患者术后明显不适者2例(4.2%), 少于A组的13例(26.0%)(P<0.01)。结论: 翼状胬肉切除联合自体角膜缘干细胞移植术治疗翼状胬肉可有效提高治愈率并促进角膜创面上皮愈合, 降低复发率, 患者术后不良反应轻, 值得临床应用推广。     

兔角膜缘干细胞的形态学研究

目的 探讨兔角膜缘干细胞(1imbal stem cells,LSCs)的形态学特征、数量及分布.方法 健康成年新西兰大耳兔30只,体质量2.0～2.5 kg,雌雄不分,取双侧眼球,常规石蜡切片,HE染色及免疫组化p63染色显示角膜缘一般特征及LSCs的分布,并用BioMias图像分析软件对LSCs进行计数.另外取3只兔眼角膜缘制作超薄切片,透射电镜观察.结果 ①角膜缘上皮细胞排列紧密,层数较多,基底层细胞呈矮柱状或立方形,核大而圆,位于细胞中央,着色较深.LSCs(p63阳性细胞)呈矮柱状或立方形,多位于角膜缘上皮基底层,在角膜缘浅层及角膜边缘有少量分布,在角膜中央上皮未见LSCs出现.②透射电镜观察LSCs核较大,形状不规则,核内常染色质较多,异染色质散在分布,未凝集成块.细胞质少,含较丰富的游离核糖体,其他细胞器少,细胞间可见较多的缝隙连接.③图像分析显示高倍镜视野下角膜缘上皮LSCs数量为(35.25±8.93)个.结论 ①LSCs具有原始细胞的超微结构特征,与其他干细胞形态相似.②LSCs主要位于角膜缘上皮基底层,在角膜缘浅层上皮及角膜边缘上皮内也有少量LSCs存在,在中央角膜上皮未见LSCs分布.     

高浓度葡萄糖对培养兔角膜上皮细胞增殖活性的影响

目的 研究高浓度葡萄糖对体外培养兔角膜上皮细胞增殖活性的影响,建立糖尿病性兔角膜上皮细胞培养模型.方法 按照析因设计方法将葡萄糖浓度(25、40、60 mmol/L)和培养时间(24、48、72 h)进行全面组合,应用SunBioTM Am-Blue细胞增殖与活性检测试剂检测兔角膜上皮细胞增殖活性,倒置显微镜观察细胞形...     

生长因子(EGF和PDGF-BB)对小鼠骨髓基质干细胞增殖的作用及其意义

目的探讨表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和血小板源生长因子(platet-derived growth factor,PDGF-BB)对体外培养的小鼠骨髓基质干细胞(murine bone marrow stromal stem cells,mMSCs)增殖的作用,探索小鼠骨髓基质干细胞体外快速增殖的条件和方法.方法将小鼠骨髓基质干细胞进行分离和纯化培养后,加入EGF和PDGF-BB,利用3H胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入反映细胞增殖效果,倒置显微镜下观察细胞增殖及分化状态.结果EGF和PDGF-BB干预后,3H-TdR掺入(11456.14±968.86)dpm较对照组(3271.88±420.91)dpm明显增高,说明EGF和PDGF-BB可促进小鼠骨髓基质干细胞的增殖;倒置显微镜下观察可见EGF和PDGF-BB处理组mMSCs具有增殖优势,分化相对延迟,而对照组提前显示出自然分化现象.结论生长因子(EGF和PDGF-BB)可促进小鼠骨髓基质干细胞的增殖,是小鼠骨髓基质干细胞体外大量培养和快速增殖的有效刺激因子.     

翼状胬肉切除联合角膜缘干细胞移植术治疗翼状胬肉疗效观察

目的观察翼状胬肉切除联合角膜缘干细胞移植术治疗翼状胬肉患者的临床疗效。方法选择2010年5月-2012年5月间进行诊治的108例（108只眼）翼状胬肉惠者,其治疗方式采用翼状胬肉切除联合角膜缘干细胞移植术,同时对其进行随访观察。结果所有患者进行手术1-2d后,角膜透明、上皮增长、覆盖创面,直至6-12d后,逐渐消退了充血症状。拆线时间为6-7d。巩膜术区自体角膜缘结膜干细胞在拆线后,有着良好的覆盖,同时未出现其他并发症状,对其进行5～16个月的随访,平均随访时间为为9．5个月,其中有2例患者（2只眼）出现了复发症状;有17例（17只眼）有云翳出现在角膜浸润区,同时右纤维样组织没有出现增生症状,邵分结膜也无充血现象发生。结论翼状胬肉运用翼状胬肉切除联合角膜缘干细胞移植术治疗是一种有效、安全的治疗措施,作为一个宝贵的经验,为基层医院提供临床借鉴。