人骨髓来源内皮前体细胞体外培养和鉴定的研究

目的:明确人骨髓单个核细胞中是否存在内皮前体细胞(EPCs),探讨从人骨髓中分离、培养EPCs的方法及体外进行EPCs的鉴定。方法:采集正常人骨髓单个核细胞进行体外培养,应用流式细胞术进行内皮细胞表面标记物检测,应用免疫荧光术对培养细胞进行内皮细胞功能特性检测。结果:人骨髓单个核细胞经体外培养,收获细胞可以表达内皮细胞的特异性抗原,包括CD34、VWF、KDR等,并显示出能摄取乙酰化低密度脂蛋白(ac-LDL),结合荆豆凝集素(UEA-1)等内皮细胞的特性。结论:人骨髓中存在具有内皮细胞潜能的EPCs,其具有内皮细胞的表型特征和功能,有希望作为种子细胞用于冠心病的血管新生治疗。     

大鼠骨髓基质干细胞体外分离、纯化、培养的实验研究

目的：探讨Wistar大鼠骨髓基质干细胞（ BMSCs）体外分离、纯化、培养的方法。方法对5周龄Wistar大鼠予1%戊巴比妥钠（0.006 ml/g）行腹腔麻醉,成功后于大鼠双侧后肢股骨、胫骨提取BMSCs,用贴壁培养法分离、纯化、培养BMSCs,观察细胞形态变化及绘制细胞生长曲线了解其生长、传代、扩增特性,并应用流式细胞仪检测细胞表面标志物行细胞鉴定。结果应用贴壁培养法分离、纯化、培养的大鼠BMSCs增殖迅速、生长曲线良好,经细胞表面标志物检测证实为BMSCs,且细胞具有很好的均一性（96.36%）。结论贴壁培养法能够很好地分离、纯化、培养大鼠BMSCs,并且获得的细胞具有很强的增殖能力,取第3~6代细胞用于实验研究最为合适。     

骨髓内皮祖细胞在假孕大鼠黄体向血管内皮细胞分化的实验研究

目的:探讨骨髓内皮祖细胞是否可以迁移至假孕大鼠黄体组织,并观察其表达。方法:雌性大鼠经137Cs全身照射后,从尾静脉移植已标记DAPI的雄性大鼠骨髓内皮祖细胞,受鼠造血重建后,制备假孕模型,于假孕后第7天应用荧光显微镜、原位杂交技术观察受鼠骨髓、外周血及黄体微血管内皮祖细胞的分布及分化情况。结果:受鼠骨髓、外周血及黄体中均有DAPI阳性细胞分布,黄体微血管可见SRY阳性内皮细胞。结论:骨髓内皮祖细胞可以迁移至假孕大鼠黄体,并向血管内皮细胞分化,参与黄体血管发生。     

骨髓间充质干细胞移植促进大鼠脊髓损伤后行为功能恢复的研究

目的:探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)移植促进大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后行为功能恢复的机制并评价其疗效.方法:利用NYU Impactor-Ⅱ打击器制作大鼠TIO SCI模型,细胞移植预实验证实BMSCs在体内定植后,分别于损伤后3 d(Ⅱ组)和1周(Ⅲ组)移植在体外稳定传10代的BMSCs,以DMEM作为阴性对照(Ⅰ组),术后用BBB评分和脚印分析进行大鼠行为功能的评价.3个月后处死动物,取出损伤处脊髓做10 mm快速冰冻切片后,行HE,NF和ED1免疫组化染色,根据各组间阳性反应面积百分比进行比较.结果:BMSCs倍增周期约为2～3 d,术后第4周各组间BBB评分差异开始有统计学意义(P<0.05或P<0.01),术后第6周起Ⅱ组和Ⅲ组之间脚印分析结果差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01). NF和ED1染色阳性反应面积百分比各组间差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01).结论:BMSCs可以改善脊髓损伤后局部的微环境,促进轴突的再生和大鼠运动功能的恢复.     

大鼠外周血内皮祖细胞分离培养与鉴定

目的 获得大鼠外周血内皮祖细胞（EPCs）并进行鉴定。方法 首先采用密度梯度离心法获得大鼠外周血单个核细胞，然后用EGM-2完全培养基体外培养条件下诱导单个核细胞分化为靶标细胞，最后分别用EPCs特异性标记物CD133和Flk-1检测及内吞乙酰低密度脂蛋白（ac-LDL）和荆豆凝集素-1（UEA-1）的能力，识别和鉴定靶标细胞。结果 靶标细胞培养至第6天呈纺锤形，梭状排列，具有与典型EPCs形态一致的生物学特征，CD133及FLK-1双抗体荧光检测结果阳性，内吞ac-LDL及UEA-1的能力实验结果阳性，证明该纺锤形细胞为EPCs。结论 通过密度梯度离心法及多细胞因子诱导大鼠外周血单个核细胞获得EPCs的方法可行，该方法可为EPCs的基础研究及临床应用提供理论与实验方法学基础。     

转染内皮祖细胞的脂质体与腺病毒载体的比较

目的:比较脂质体和腺病毒作为肝细胞生长因子(HGF)基因转染内皮祖细胞载体的效力.方法:分离培养大鼠骨髓血管内皮祖细胞,并通过摄取DiL-acLDL、结合FITC-UEA-1及流式细胞术检测表面抗原CD133+进行鉴定.脂质体介导细胞转染,将细胞分为HGF质粒转染组(转染pIRES2-EGFP-HGF质粒)、空载质粒转染组(转染plRES2-EGFP质粒)和空白对照组.病毒介导细胞转染,细胞分HGF病毒转染组(pAdxsi-GFP-HGF重组腺病毒转染)、空载病毒转染组(导入pAdxsi-GFP腺病毒)和空白对照组.荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,ELISA法检测HGF的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)检测细胞增殖能力.结果:脂质体和腺病毒载体均可成功将绿色荧光蛋白标记的HGF基因转入内皮祖细胞,其中腺病毒转染效率更高,最高可达80％以上,其表达HGF水平以及细胞增殖能力都明显强于脂质体转染.空载病毒转染组细胞增殖与空白对照组差异无统计学意义(P＞0.05),而空载质粒转染组细胞增殖明显少于空白对照组(P＜0.05).结论:腺病毒作为HGF基因转染内皮祖细胞的载体相对于脂质体载体具有更高效、低毒、高表达目的基因的优点.     

大鼠滑膜细胞的分离和培养

大鼠滑膜细胞的分离和培养王斌，陈敏珠，徐叔云（安徽医科大学临床药理研究所，合肥２３００３２）类风湿性关节炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ＲＡ）等关节损伤性炎症性疾病的滑膜细胞可分泌多种炎症介质，如白细胞介素１（ＩＬ－１），肿瘤坏死因子（Ｔ...     

人和大鼠血管内皮细胞的培养和鉴定

目的：建立人和大鼠血管内皮细胞体外培养的模型，为内皮细胞相关性疾病的研究提供重要的实验基础。方法：采用0．1％I型胶原酶消化灌注法和组织块贴壁法分别获得人脐静脉内皮细胞和大鼠微血管内皮细胞，每天在倒置相差显微镜下进行观察，并用免疫荧光法分别进行鉴定。结果：经胶原酶消化法和组织块贴壁法获得的内皮细胞，经过镜下观察、免疫荧光法鉴定证明是人脐静脉内皮细胞和大鼠血管内皮细胞。结论：胶原酶消化法和组织块贴壁法都可获得血管内皮细胞，可为临床研究提供大量的种子细胞。     

阿托伐他汀对颅脑损伤大鼠内皮祖细胞和神经功能的影响

【摘要】 目的 观察阿托伐他汀对颅脑损伤大鼠内皮祖细胞和神经功能的影响。方法 30只成年雄性Wistar大鼠,随机分为假手术组、治疗组和对照组,各10只。治疗组和对照组采用液压打击法制作颅脑损伤模型。假手术组颅骨钻孔后不进行液压打击。治疗组打击后1h口服阿托伐他汀1mg/(kg·d),连续14天。对照组口服等量生理盐水。术后第1、4、7、14、21天测量各组大鼠循环血内皮祖细胞(EPCs)数量,进行mNSS评分。术后第21～25天进行Morris水迷宫实验,记录大鼠目标象限百分率。结果 液压打击后大鼠的神经功能受损。术后第4、7、14、21天,治疗组大鼠循环血EPCs数量高于对照组和假手术组,术后第14、21天治疗组大鼠mNSS评分均低于对照组,术后第24、25天治疗组目标象限百分率显著好于对照组(均P<0.05)。结论 阿托伐他汀能调节颅脑损伤后大鼠循环血EPCs数量,促进大鼠神经功能恢复。     

大鼠原代肝细胞分离培养的实验研究

目的:探讨胶原酶经肝门静脉灌流分离肝细胞及培养的可行性.方法:取10只SD大鼠,按照改良Seglen原位两步胶原酶灌流法分离培养原代肝细胞.以SD大鼠作为肝细胞供体,采用Ⅳ型胶原酶经门静脉灌注,下腔静脉封闭保留胶原酶消化分离肝细胞,经200目筛过滤,滤液以200 r/min离心3～5 min,重复3次,纯化肝细胞.台盼蓝拒染实验检测分离细胞活性.将10只SD大鼠分离得到的肝细胞混合,稀释50倍后接种于包被有鼠尾胶原的培养皿或培养板中,倒置显微镜下观察分离肝细胞的形态特征,糖原染色法(PAS法)鉴定分离肝细胞,MTT法测定肝细胞在培养不同时期的增殖情况.结果:平均每只大鼠肝脏分离获得(1.8±0.14) ×108/mL肝细胞,细胞活率＞85％.肝细胞内因有大量的糖原颗粒,经PAS染色后被染成红色.MTT实验结果表明在培养的第八天肝细胞增殖达到峰值,培养的第九天细胞活力开始下降.结论:采用胶原酶经肝门静脉灌流分离肝细胞是一种简单、高效的获得肝细胞的方法.     

骨髓间充质干细胞促进大鼠80%肝切除后残肝再生及修复作用的研究

目的:观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)对大鼠自体80%肝切除后残余肝脏再生及修复的作用。方法:采用密度梯度离心联合贴壁筛选法分离纯化鉴定BMSCs,取6～8周体质量200～220g的大鼠,建立大鼠80%肝切除模型,实验组16只,术后即刻经门静脉注射BMSCs;对照组20只,注射等量生理盐水。采用生物化学方法检测肝功能,流式细胞仪和免疫组化检测肝细胞周期和增殖细胞核抗原(PCNA)。结果:体外成功分离培养、扩增BMSCs;实验组术后生存15只,死亡1只,对照组生存15只,死亡5只;肝脏组织显示,实验组术后1、3和7d时肝窦轻度扩张,较少的炎性细胞浸润,少见坏死,坏死程度明显轻于对照组,术后3d差异尤为明显;实验组术后1、3和7d时血ALT和AST水平较对照组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);实验组术后1、3和7d时肝细胞周期中S期细胞比例与对照组相比均明显增高(P<0.05);残肝免疫组化显示实验组PCNA表达水平明显高于对照组(P<0.05)。结论:BMSCs可以促进大鼠80%肝切除后残余肝脏细胞的再生及修复。     

HSV-1体外感染骨髓间充质干细胞的实验研究

目的:在体外原代培养大鼠骨髓间充质干细胞,观察单纯疱疹病毒1型(HSV-1)感染骨髓间充质干细胞情况。方法:分离骨髓间充质干细胞,并对其作鉴定。用HSV-1感染骨髓间充质干细胞,提取总DNA,PCR法扩增骨髓间充质干细胞内的HSV-1特异性片段。结果:骨髓间充质干细胞经14d诱导后,碱性磷酸酶含量增高,形成钙结节,表现出成骨细胞特性。HSV-1感染骨髓间充质干细胞,细胞出现典型的病变,PCR法成功扩增出骨髓间充质干细胞内的HSV-1特异性片段。结论:大鼠骨髓间充质干细胞在体外可以向成骨细胞方向分化,可作为组织工程学的种子细胞。HSV-1可以在体外感染骨髓间充质干细胞。     

不同输注途径移植骨髓间充质干细胞对阿霉素肾病大鼠疗效初探

【摘要】目的探索骨髓间充质干细胞（BMSCs）经不同输注方式移植入阿霉素慢性肾病大鼠体内对肾损伤的影响。方法SD大鼠左侧肾切除后以2.5mg/kg剂量给大鼠尾静脉注射阿霉素,1次/周,连续2次,慢性肾病模型成功后,将成模大鼠36只随机均分为3组：阿霉素慢性肾病对照（ADR）组、干细胞经肾动脉移植（M-A）组、干细胞经外周静脉移植（M-V）组,另选12只正常大鼠设正常对照（N）组。BMSCs经体外培养后,以2×10⁶个/mL经肾动脉注射到M-A组大鼠体内,2×10⁶个/mL经尾静脉注射到M-V组大鼠体内,2周后再次同样方法注射等量BMSCs。检测移植当周、移植后1周、2周大鼠血尿素氮、血肌酐、24h尿蛋白、24h尿微量蛋白,末次注射干细胞后第1周于激光聚焦显微镜下观察大鼠肾脏病理和干细胞在肾脏内分布情况。结果M-A组、M-V组和ADR组在各观察时点血尿素氮、血肌酐、24h尿蛋白总量、24h尿微量蛋白均明显高于N组（P＜0.01）。移植后1、2周M-A组的24h尿微量蛋白低于ADR组（P＜0.01）,且M-A组的血肌酐较ADR组和M-V组均降低（P＜0.01）。移植后1周,M-A组24h尿蛋白、24h尿微量蛋白明显低于M-V组（P＜0.01）;但2周时尿蛋白和微量蛋白与M-V组的差异无统计学意义。结论BMSCs移植可以改善阿霉素慢性肾病的肾损伤情况,在BMSCs移植后一段时间,BMSCs经肾动脉移植的效果优于经外周静脉移植。     

CD34+细胞在急性心肌梗死周边区表达的研究

目的探讨动员骨髓干细胞后CD34 细胞在急性心肌梗死微环境周边区中的表达。方法制备大鼠心肌梗死模型,通过心肌病理组织学及免疫组织化学检测,评价动员的骨髓干细胞对心肌梗死后24h、7d及14d的治疗作用,并对其机制进行探讨。结果24h及7d动员组检测CD34 阳性心肌细胞(个/HP)与对照组相比,分别为(2.90±0.87比1.10±0.88;8.30±1.83比1.40±0.51,P<0.05),且动员组CD34 细胞数7d与24h比较(个/HP)(8.30±1.83比2.90±0.87,P<0.05)明显增加;7d时,动员组与对照组缺血周边区均有B r-dU免疫阳性细胞,与对照组比(个/HP),B rdU标记阳性细胞数明显增多(7.90±1.37比1.30±0.67,P<0.05);14d时,对照组可见大量心肌瘢痕组织;而动员组瘢痕组织面积明显小于对照组,部分血管壁上可见小核深染的细胞附着,并沿血管壁移行,14d时CD34 细胞均变为阴性反应。结论动员的骨髓干细胞对大鼠缺血心肌有治疗作用,其机制可能是在心肌微环境中,动员的骨髓干细胞(包括CD34 细胞)有向心肌细胞、血管内皮细胞分化的潜能。     

自体骨髓干细胞移植治疗下肢动脉硬化闭塞

目的观察自体骨髓干细胞移植治疗下肢动脉硬化性闭塞症的疗效。方法确诊严重的下肢动脉硬化性闭塞症患者,经骨髓干细胞动员后,第二天进行骨髓干细胞采集,将干细胞混悬液肌肉注射进行双下肢移植,观察5个月,进行各项指标综合评估。结果脐血干细胞移植后,患者疼痛、肢体冷感、间歇性跛行,溃疡均明显好转。移植5个月后,数字减影下肢动脉造影结果显示,血管形成明显增加,未出现并发症和不良反应。结论脐血干细胞移植治疗老年动脉硬化性闭塞症,是一种简单、有效的方法。     

大鼠肝卵圆细胞的分离、鉴定及体内移植

目的:探讨大鼠肝卵圆细胞分离、纯化方法,并对暴发性肝功能衰竭大鼠模型进行体内移植。方法:以雄性Wistar大鼠肝卵圆细胞增殖模型为供体,Seglen胶原酶原位灌注结合Percoll密度梯度离心分离纯化大鼠卵圆细胞,并进行鉴定。D-氨基半乳糖(1200mg/kg)诱导雌性大鼠暴发性肝功能衰竭模型,肝脏注射移植细胞0.4mL,移植前及移植后取血测定血清谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TBiL),PCR方法测定受体肝脏组织性别决定因子。结果:平均细胞产量为(5.10±0.40)×106,细胞活性率(94.30±1.89)%。光镜、电镜及免疫组化染色符合卵圆细胞特点,体外培养可形成克隆样结构。移植组暴发性肝功能衰竭大鼠中位生存时间延长(P<0.05),血清ALT、TBiL水平下降,各时间点组间比较均低于对照组(P<0.01)。肝脏病理损伤减轻,受体肝脏组织中性别决定因子呈阳性表达,且随时间延长而表达增强。结论:本方法可成功诱导、分离、纯化大鼠肝卵圆细胞。体内移植延长暴发性肝功能衰竭大鼠中位生存时间,改善肝功能及病理指标。     

大鼠骨髓源性肝干细胞脾内移植后的分化

目的探索大鼠骨髓源性肝干细胞（BDHSC）脾内移植后的分化情况。方法利用肝细胞生长因子（HGF）体外诱导大鼠BDHSC,并植入60只成年SD大鼠脾内,两组（n=30）分别于术后7天和14天处死动物后取脾,RT—PCR及免疫组化检测移植细胞的AFP及白蛋白的表达。结果移植后7天,AFP mRNA、白蛋白mRNA和AFP的阳性表达率分别为73．3％、46．7％、56．7％;移植后14天,AFP mRNA阳性表达率（23．3％）显著下降（P〈0．01）,白蛋白mRNA阳性表达率（20%）显著下降（P〈0．05）,AFP阳性表达率（26．7％）亦显著下降（P〈0．05九,结论体外诱导大鼠BDHSC脾内移植后,其原有的肝干细胞特性逐渐丧失