组织工程心脏瓣膜支架构建的研究

目的：构建脱细胞猪主动脉瓣膜支架，为体外构建组织工程心脏瓣膜提供适宜的支架材料。方法：新鲜猪主动脉瓣叶，采用“低渗液-0．5％SDS-核酸酶”处理，进行大体、光镜、电镜观察和DNA含量测定。结果：“低渗液-0．5％SDS-核酸酶”可以完全脱去瓣膜细胞，同时较好地保持了胶原纤维和弹力纤维的原有排列和形态。结论：本方法可以成功构建脱细胞猪主动脉瓣膜支架，可进一步用于体外构建组织工程心脏瓣膜的研究。     

人脐静脉血管内皮细胞构建组织工程心脏瓣膜及其生理功能

目的 探讨人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)构建组织工程心脏瓣膜(TEHV)及其生理功能.方法 以脱细胞猪主动脉瓣作支架;将扩增的HUVECs种植在瓣膜上,体外静态构建TEHV,观察内皮细胞的形态和生长状况.收集瓣膜培养液,检测瓣膜内皮细胞分泌组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、组织型纤溶酶原激活物抑制物(PAI-1)、前列环素(PGI2)、一氧化氮(NO)、内皮素(ET-1)的功能.结果 猪主动脉瓣膜中的细胞成分能完全去除,脱细胞瓣叶的生物力学特性同新鲜瓣叶相比无明显变化以HUVECs做种子细胞,成功构建TEHV;瓣膜表面的内皮细胞生长状态良好,长成连续的细胞层.细胞能够分泌t-PA、PAI-1、PGI2、NO、ET-1等.结论 以脱细胞猪主动脉瓣膜为支架,种植HUVECs成功构建TEHV,其表面HUVECs具有正常内皮细胞的生理功能.     

移植途径对骨髓间充质干细胞调节小鼠心脏移植排斥反应的影响

目的 探讨不同途径注射骨髓间充质干细胞（BMSCs）对调节小鼠心脏移植排斥反应的影响。方法 BALB/c和C57小鼠分别作为供体和受体,建立颈部心脏移植模型,随机分为4组,每组12只,A组在移植成功后立即经移植心脏升主动脉注射C57来源绿色荧光BMSCs悬液30 μL（含1×106细胞）,B组同样时间点经移植心脏右心室腔内注射相同数量细胞,C组同样时间点移植心脏心肌内注射相同数量细胞,D组为空白对照组。移植后第7天各组处死4只小鼠,切取移植心脏,荧光显微镜下观察绿色荧光细胞的存活情况,HE染色观察移植心脏的病理学改变,流式细胞学检测移植物浸润白细胞中巨噬细胞的比例,其余8只小鼠用来观察移植心脏的存活时间。结果 术后第7天,仅A组移植心脏内可见绿色荧光细胞,病理学检测发现A组排斥反应受到明显抑制,心肌间质内细胞浸润明显减少,局灶性的心肌细胞损害,B组和C组移植心脏间质内可见多灶性淋巴细胞浸润并伴有心肌细胞变性坏死,而D组小鼠心脏见满视野大量白细胞浸润,心肌结构消失,心肌坏死。流式细胞学检测发现A组移植心脏内巨噬细胞的比例明显高于其他3组,A组的心脏存活时间明显长于其他3组。结论 BMSCs能减轻心脏移植排斥反应,动脉途径注射优于静脉和心肌局部注射途径,其机制可能与骨髓间充质干细胞在移植心脏内存活时间以及巨噬细胞比例增加有关。     

应用富含血小板血浆构建组织工程骨的研究

目的探究富含血小板血浆（PRP）是否能成为接种骨髓间充质干细胞（BMSCs）于3D支架中的有效媒介,是否具有促进骨组织再生、新生骨成熟及血管化的作用,为组织工程骨的构建策略及动物实验和临床应用提供理论依据。方法体外培养新西兰兔BMSCs至第三代作为种子细胞,分别应用PRP组、乏血小板血浆（PPP组）重悬BMSCs,双相接种法构建细胞/支架复合体,另设对照组,通过检测支架内DNA含量、碱性磷酸酶（ALP）含量,对比细胞的接种效率、增殖和分化情况。结果 PRP组的成骨量较PPP组和对照组显著（P〈0.05）。结论用PRP介导的双相接种法可以促进BMSCs在细胞/支架复合物中增殖并向成骨分化;PRP双相接种法是一种可行的构建组织工程骨的方法,具有很大的潜力和广阔的应用前景。     

体外组织工程软骨的构建及其对关节软骨损伤的修复

目的探讨体外组织工程软骨的构建及其对关节软骨损伤治疗的可行性。方法①体外分离、培养、扩增骨髓基质干细胞,诱导分化培养为软骨样细胞;②以胶原膜为支架在体外构建组织工程软骨;③建立兔髋关节软骨缺损动物模型16只,对照组8只,实验组8只;应用组织工程软骨修复兔股骨头关节软骨缺损,8、16周后观察修复效果。结果8周后大体标本显示关节软骨缺损为白色软骨样组织填充,组织切片显示缺损处有新生软骨形成,阿新兰染色和Ⅱ型胶原免疫组化检测有GAG和Ⅱ型胶原强阳性表达;16周后关节软骨缺损仍为软骨样组织修复,部分见表面粗糙,镜下见软骨细胞排列紊乱。结论体外构建的组织工程软骨可用于修复兔股骨头关节软骨缺损,较长期的观察结果显示有退变倾向。     

人牙源性iPSCs分化心肌细胞促进急性心肌梗死小鼠心肌修复的研究

目的 探讨人牙源性诱导性多能干细胞（iPSCs）分化心肌细胞对急性心肌梗死（AMI）小鼠心功能的影响。方法 采用仙台病毒诱导、单克隆挑选和无饲养层体系将人牙根尖乳头干细胞（SCAP）重编程为iPSCs,心肌分化培养基定向诱导。9只BALB/C雄性小鼠按照随机数字表法分为正常组（不干预）、AMI组（AMI造模）和实验组（...     

应用微重力旋转培养系统构建组织工程软骨的实验研究

目的探讨微重力旋转培养系统(RCCS)在构建组织工程细胞/载体复合物修复兔关节软骨缺损中的作用。方法将兔骨髓间充质干细胞附着在三维载体壳聚糖上,分为传统的静置培养组和微重力旋转培养组,经过体外成软骨诱导作用后,修复兔关节软骨缺损。考察不同时间点、不同培养体系中细胞增殖情况、成软骨表达情况以及对兔关节软骨缺损的修复情况。结果相对于常规的静置培养组,RCCS组细胞增殖能力、成软骨表达均得到增强,对兔关节软骨缺损的修复更为有效。结论微重力旋转培养系统可以作为构建组织工程软骨一个有效的辅助手段,进而应用临床软骨缺损的修复。     

分子嵌合MHC-Ⅰ基因对小鼠DC反应的研究

目的:构建分子嵌合主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅰ基因小鼠骨髓造血干细胞,并探讨其诱导脾脏T细胞对异基因小鼠树突状细胞(DC)反应的机制。方法:密度梯度法分离培养BALB/c小鼠骨髓造血干细胞。构建携带C57BL/6小鼠MHC-Ⅰ基因慢病毒载体(病毒感染组),携带无意义基因慢病毒载体(阴性对照组)。分别感染BALB/c小鼠骨髓造血干细胞,构建分子嵌合细胞。分别取病毒感染组、阴性对照组及未加入病毒的空白对照组造血干细胞输注BALB/c小鼠后7d,获取脾脏T淋巴细胞,分别与C57BL/6小鼠DC进行混合淋巴细胞培养,测定刺激指数。结果:成功体外分选及培养BALB/c小鼠骨髓造血干细胞。病毒感染组C57BL/6小鼠MHC-Ⅰ蛋白表达率可达98.17%。单向混合淋巴细胞培养结果显示,C57BL/6小鼠DC对输注病毒感染组细胞后BALB/c小鼠脾脏T细胞刺激指数明显降低(P<0.01)。结论:输注分子嵌合MHC-Ⅰ基因造血干细胞后,小鼠脾脏T细胞对异基因小鼠DC反应明显减低。     

间充质干细胞和单个核细胞异种移植治疗大鼠肝损伤的研究

目的:研究小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)和单个核细胞(MNCs)在四氯化碳(CCl4)诱导性大鼠肝损伤治疗中的作用.方法:无菌条件下取雄性Balb/c小鼠骨髓分离MNCs,培养纯化及流式细胞仪筛选获得MSCs;采用CCl4制作雌性Wistar大鼠肝损伤模型,随机分为MSCs移植组、MNCs移植组和肝损伤对照组.2个细胞移植组分别在CCl4损伤后立即经尾静脉注入小鼠MSCs或MNCs,各组分别于移植细胞输入前即刻(T0)、输入后第1(T1)、7(T2)、14(T3)、28(T4)、42(T5)天断尾取血检测丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST).6周后处死大鼠,比较肝脏质量指数,肝病理学切片检测肝损伤程度,PCR检测小鼠Sry基因片段植入大鼠肝脏的情况.结果:MSCs CD44、CD90均表达阳性,而CD45表达阴性;2个细胞移植组在T1-4时点ALT和AST浓度差异有统计学意义(P<0.05);与肝损伤对照组比较,MSCs移植组ALT和AST浓度在T1-4时点均降低;MSCs移植组肝损伤修复程度明显好于MNCs移植组和肝损伤对照组;仅MSCs移植组肝内有小鼠Y染色体阳性细胞存在.结论:体外分离培养及扩增的小鼠MSCs可植入到CCl4诱导性肝损伤大鼠的肝组织中,并改善CCl4导致的肝损伤.     

采用纤维蛋白凝胶种植技术体外构建组织工程软骨

目的 探讨有效体外构建高质量组织工程软骨的细胞种植技术.方法 将分离、培养的兔第1代软骨细胞分别通过纤维蛋白凝胶种植技术(实验组)及常规种植方法(对照组)接种于聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)支架.体外培养3周后收获组织工程软骨,行大体观察,组织切片,定量检测氨基糖胺聚糖(GAG)、DNA含量及Ⅱ型胶原染色面积.结果 实验组较对照组构建的组织工程软骨体积更大、更有弹性和光泽;其Ⅱ型胶原染色面积、GAG、DNA含量均高于对照组(P＜0.05).结论 与传统种植方法比较,采用纤维蛋白凝胶种植技术能在体外形成更高质量的组织工程软骨.     

大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的研究

目的研究体外大鼠骨髓间充质干细胞的生长特性。方法在无菌条件下,取大鼠骨髓,采用密度离心法和全骨髓贴壁法联合培养并结合传代获取、纯化细胞,倒置显微镜观察其形态,流式细胞术检测其表面抗原CD29、CD90及CD34的表达。CCK-8法测定第1、3代细胞的增殖情况,并绘制其生长曲线。结果经全骨髓贴壁法和密度梯度离心联合培养,所得到的原代细胞形态呈椭圆形、圆形、三角形,接近融合状态时可呈现均一的长梭形,排列规则。传至第8代时,细胞的增殖能力减弱,其形态宽大畸形,呈树枝状。经流式细胞仪检测,所分离的细胞CD29的表达率为94.97%,CD90的表达率为88.50%,CD34的表达率为2.23%。CCK-8法显示第3代细胞有较强的增殖能力。结论体外培养的大鼠BMSCs是骨组织工程的优良种子细胞。     

HSV-1体外感染骨髓间充质干细胞的实验研究

目的:在体外原代培养大鼠骨髓间充质干细胞,观察单纯疱疹病毒1型(HSV-1)感染骨髓间充质干细胞情况。方法:分离骨髓间充质干细胞,并对其作鉴定。用HSV-1感染骨髓间充质干细胞,提取总DNA,PCR法扩增骨髓间充质干细胞内的HSV-1特异性片段。结果:骨髓间充质干细胞经14d诱导后,碱性磷酸酶含量增高,形成钙结节,表现出成骨细胞特性。HSV-1感染骨髓间充质干细胞,细胞出现典型的病变,PCR法成功扩增出骨髓间充质干细胞内的HSV-1特异性片段。结论:大鼠骨髓间充质干细胞在体外可以向成骨细胞方向分化,可作为组织工程学的种子细胞。HSV-1可以在体外感染骨髓间充质干细胞。     

干细胞来源外泌体的生物学特性研究进展

目前,干细胞来源外泌体可通过不同的方法对其进行鉴定及提取,从而为干细胞来源外泌体的研究奠定了基础。研究发现干细胞来源外泌体在非肿瘤环境下可通过免疫调节、抗炎、抗氧化、调节蛋白及促进组织功能恢复等方式参与机体的调节功能,在缺氧、脂多糖及转染等外源诱导作用下可干预干细胞分泌外泌体的功能及外泌体的分泌作用。而在肿瘤环境下,多数研究报道干细胞外泌体具有促肿瘤的作用,而通过基因转染干细胞衍生的外泌体对肿瘤具有抑制作用。     

骨髓来源成骨细胞体外成骨表达的研究

目的探索在体外诱导兔骨髓基质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)向成骨细胞分化及成骨表达的特性。方法抽取兔骨髓,通过离心法获取单个核细胞,在体外经条件培养基培养21d,通过倒置显微镜及激光共聚焦显微镜观察成骨细胞的形态学特点;应用MTT法测定成骨细胞活性;并检测成骨细胞分泌碱性磷酸酶活性及形成矿化结节情况。结果体外BMSCs可在成骨条件培养液下诱导培养后可向成骨细胞分化,经倒置显微镜和激光共聚焦显微镜观察证实,诱导后BMSCs由长梭形转变为短胖形的成骨细胞,MTT检测成骨细胞活性良好,分泌碱性磷酸酶并形成矿化结节。结论骨髓基质干细胞在体外可定向诱导为成骨细胞,并具有成骨细胞功能,有希望成为理想的种子细胞应用于临床。     

超声联合微泡促进骨髓间充质干细胞迁移的实验研究简

目的 探讨体外超声联合微泡对骨髓间充质干细胞迁移的影响,为超声微泡促进干细胞迁移的体内研究提供依据.方法 体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,分为超声联合微泡组、单纯超声组、单纯微泡组及空白对照组.超声探头频率1 MHz,强度1 W/cm2,进行脉冲超声辐射,采用transwell小室培养法,观察超声联合微泡对骨髓间充质干细胞运动的影响.结果 空白对照组、单纯微泡组骨髓间充质干细胞的迁移能力较低,超声联合微泡组与单纯超声组细胞的迁移能力无显著差异（P〉0.05）,但两者比空白对照组、单纯微泡组迁移能力有显著差异（P〈0.01）.结论 超声及超声联合微泡作用能明显增强间充质干细胞的迁移能力.     

羧甲基壳聚糖温敏凝胶对小鼠L929细胞增殖的影响

目的:研究自制羧甲基壳聚糖温敏凝胶对小鼠肺成纤维细胞(L929)增殖的影响及其组织相容性.方法:用羧甲基壳聚糖(CMCS)与甘油磷酸盐(GP)互配,制备羧甲基壳聚糖温敏凝胶,22只小鼠分为正常对照组1只、空白对照组3只,2％凝胶组和5％凝胶组各9只.采用四甲基偶氮唑盐法(MTT)分别测定质量浓度为50、10、2、0.4、0.08倍的羧甲基壳聚糖温敏凝胶浸提液对体外培养的L929细胞的增殖情况;分别将2％和5％的温敏凝胶植入小鼠皮下,于3、7、14d处死,常规组织切片,HE染色观察凝胶周围组织的炎症反应.结果:培养24 h～96 h,0.4倍及0.08倍浸提液组与阴性和阳性对照组的OD值差异有统计学意义(P＜0.05);培养48、72、96 h后,除50倍浸提液组外其余各实验组与阴性和阳性对照组的OD值差异有统计学意义(P＜0.05),其中0.4倍浸提液促细胞增殖作用最为明显;凝胶植入后前3d,实验组以急性炎症为主,随着时间的延长各实验组炎症细胞逐渐减少至消失.结论:羧甲基壳聚糖温敏凝胶对L929细胞有明显的促进作用,且具有良好的组织相容性,在牙周病治疗中具有潜在的应用价值.     

胎儿骨髓间充质干细胞的分离和培养

目的探讨胎儿骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)的分离和培养条件。方法用DMEM培养液冲洗引产胎儿的骨髓腔,密度梯度离心法分离出其中的单个核细胞后,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液,将细胞浓度调整到5×105个/ml,接种于12孔培养板中(1ml/孔),放在37℃、含体积分数为5%的CO2的饱和湿度培养箱中培养,48h后更换新鲜培养液,去除未贴壁细胞,以后每3d换液1次继续培养。当细胞铺满培养板底90%以上时,按常规方法进行细胞传代培养。结果原代培养的细胞接种后4h部分细胞开始贴壁,24h大量细胞贴壁并且胞浆伸出突起,变成梭形,培养10～14d后细胞融合成片铺满瓶底;传代培养的细胞1h即可贴壁,4h细胞开始伸展扩大,7～10d即可铺满瓶底。结论用密度为1.077g/ml淋巴细胞分离液作为分离液,密度梯度离心法分离培养的胎儿骨髓MSCs增殖力强,操作简单,是一种较好的分离和培养MSCs的方法。     

兔骨髓基质细胞体外培养的生物学特性

目的 研究兔骨髓基质细胞(MSC)体外培养状态下的生物学生长特性,为骨/软骨组织工程提供实验理论和技术支持。方法 抽取兔骨髓分离MSC,连续培养5代。描绘1～5代MSC生长曲线、计算倍增时间,测定细胞贴壁率和细胞活性。结果 第1～3代传代细胞生长曲线基本相同,倍增时间20h,贴壁率无明显差异,接种后12h贴壁率为96％,成活率大致相等,为95％;第4、5代细胞倍增时间延长,贴壁能力及细胞活力下降。结论 原代及第1～3代MSC体外培养生长稳定,增殖迅速,贴壁率高,活力良好,是骨／软骨组织工程良好的种子细胞来源。     

骨髓间充质干细胞生物学特性及中药对其生物学行为的影响

目的：综述骨髓问充质干细胞(MSCs)的生物学特性及中药对其生物学行为的影响，探讨中药在MSCs研究中的应用前景。方法：查阅国内外检索类期刊，归纳骨髓MSCs的生物学特点及中药对其影响。结果：骨髓MSCs容易获取、可以体外大量扩增、干细胞特性不易丧失，是组织工程和细胞治疗中理想的种子细胞，中药可诱导骨髓MSCs定向分化成神经元。结论：中药对骨髓MSCs的生物学特性有影响，并有待深入研究。