在Sf9昆虫细胞-杆状病毒系统中表达毒蕈碱型M_2及M_5受体重组突变体

目的为乙酰胆碱毒蕈碱(M)受体亚型特异性的变构调节剂及基因工程的研究提供实验平台。方法用PCR及搭桥PCR法对乙酰胆碱M2及M5受体作以下突变:①将N-糖基化位点Asp突变为Asn;②删除对蛋白酶敏感的M受体的第三个细胞内环;③在C端添加凝血酶识别位点(CMV)和6-His标记。将PCR扩增出重组嵌合蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体,制备重组杆状病毒并感染昆虫细胞表达M2/M5受体蛋白。Western印迹及放射性配体受体结合实验验证受体的正确表达及功能。结果通过搭桥PCR,成功扩增出1018 bp的重组M2受体和1041 bp重组M5受体核酸序列;使用pUC/M13的扩增引物成功构建M2/M5重组转移载体。将重组载体质粒与线性化病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9,制备重组杆状病毒并感染昆虫细胞,见细胞空泡样病变。Western印迹分析确定重组杆状病毒感染昆虫细胞M2/M5蛋白表达,放射性配体受体饱和实验结果表明,表达的重组受体蛋白与[3H]N-甲基-东莨菪碱具有特异性结合能力。结论 Sf9昆虫细胞能够表达M2及M5重组受体蛋白,M2及M5重组受体蛋白的病毒样颗粒可用于M受体的新药研究。     

HIV-1 Gag-gp120嵌合基因在重组杆状病毒系统中的嵌合表达

将中国株HIV-1B亚型gag基因序列克隆到杆状病毒表达载体pFASTBAC1中,将gp120基因以相同的读框克隆到gag基因的3／端下游,构建了重组表达质粒pFge,利用大肠杆菌埃希菌杆状病毒表达系统筛选重组杆状病毒,在昆虫细胞sf9中表达了HIV-1的Gag-gp120嵌合蛋白。     

pCEP4/hIL-17真核表达载体的构建及表达

目的构建pCEP4/hIL-17载体及在真核细胞中表达hIL-17/mFc融合蛋白;初步研究IL-17生物学特性。方法采用RT-PCR的方法克隆hIL-17CDS段基因序列;将测序正确的hIL-17序列插入pCEP4质粒构建pCEP4/IL-17真核表达载体,转染中华仓鼠卵巢(CHO)细胞后,筛选阳性表达细胞株;并用RT-PCR、ELISA和Western blot等法鉴定IL-17基因的mRNA和蛋白表达;流式细胞术分析纯化的蛋白对Raji细胞表达的hIL-17受体的结合能力;以体外实验验证其促炎症作用。结果成功构建了pCEP4/hIL-17重组载体,并在CHO细胞中稳定表达;所获得hIL-17重组蛋白能稳定结合Raji细胞上的IL-17受体;体外刺激HeLa细胞,能明显促进IL-6等炎症因子的分泌。结论稳定表达hIL-17重组蛋白的CHO细胞系的建立,为进一步研究hIL-17的生物学功能奠定了良好的基础。     

乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg基因重组杆状病毒的构建及鉴定

目的利用杆状病毒表达系统（BEVS）构建含乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）基因的重组杆状病毒。方法采用PCR法从含乙型肝炎病毒全基因序列（adw）的质粒pHBV1中扩增出HBVC基因,亚克隆到pGEM-T载体,然后将HBVC基因插入载体pAcGHLT-A中,构建含有HBVC基因的重组质粒pAcGHLT-HBcAg,与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcNPV）联合转染秋粘虫细胞（Sf9）,获得含有HBVC基因的重组杆状病毒。采用限制性内切酶酶切和DNA序列分析对重组病毒进行鉴定。结果利用杆状病毒表达系统,成功地构建了含HBVc基因的重组杆状病毒,感染昆虫细胞Sf9后,PCR检测可以扩增出相应大小的片段。结论利用BEVS成功构建了含有HBVC基因的重组杆状病毒,为进一步的研究奠定了基础。     

SARS-3CL蛋白酶基因在杆状病毒载体中的构建及其转染

目的:构建SARS冠状病毒3CL蛋白酶基因的杆状病毒重组供体质粒,包装重组3CL蛋白酶的杆状病毒,感染昆虫细胞进行表达.方法:首先扩增含3cl-Teagy和pFagtBac HTh的转化菌,用酶切连接法构建重组转座质粒pFB HTb-3cl.将该质粒转化E.coli DH10Bac感受态菌,在菌体内进行重组,并经三重抗性和蓝白斑筛选,得到杆状病毒重组质粒Bacmid-HTb-3cl,对重组质粒Bacmid-HTB-3cl进行纯化并转染St9昆虫细胞包装杆状病毒,利用病毒感染St9昆虫细胞并进行蛋白表达.利用SDS-PAGE检测蛋白表达情况.结果:成功构建了重组表达载体并得到了重组杆状病毒,SDS-PAGE检测到有3CL蛋白酶表达.结论:3CL蛋白酶在昆虫细胞中的表达为蛋白活性的检测及抑制剂的筛选奠定了基础.     

人miR-378慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建人miR-378慢病毒表达载体。方法酶切法从已构建的质粒获得pri-miR-378,克隆于含绿色荧光蛋白(GFP)编码基因的PGCSIL载体,转化感受态细胞,产生重组慢病毒质粒PGCSIL-miR-378,并进行PCR及测序鉴定。将PGCSIL-miR-378、pHelper 1.0和pHelper 2.0三种质粒DNA共转染293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平用逐孔稀释滴度法测定病毒滴度。结果成功构建miR-378的慢病毒表达载体,测序证实所插入基因序列完全正确。荧光显微镜检测证实PGCSIL-miR-378携有正确的miR-378基因,并能在293T细胞中表达。检测病毒滴度为8×108 TU/ml。结论成功建立了miR-378慢病毒表达系统。     

携带人PPARα基因高效真核表达载体的构建及其意义

目的构建可以高效表达人过氧化物酶体增殖物激活受体(αhPPARα)的真核细胞表达载体,为筛选作用于PPARα受体的药物提供分子平台。方法将HepG2细胞总RNA经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆hPPARα全长基因,用BamHⅠ、SalⅠ双酶切后,与相同双酶切的pIRES2-EGFP载体连接,构建phPPARα-IRES2-EGFP重组质粒,用酶切及基因测序鉴定重组质粒中hPPARα基因的完整性和可靠性;重组质粒转染293细胞,荧光显微镜观察EGFP报告基因表达强度,并对转染细胞的hPPARα表达进行荧光定量PCR及免疫细胞化学检测。结果经酶切和测序证实重组质粒构建正确,并在转染的293细胞中获得hPPARα的高效表达。结论成功构建重组质粒phPPARα-IRES2-EG-FP,为基于hPPARα受体靶点的药物筛选平台的建立提供了高效表达hPPARα的重组载体。     

人脂联素基因慢病毒载体在293 T细胞中的表达及意义

目的构建携带人脂联素(human apM1,hapM1)基因的慢病毒载体,并观察其在293 T细胞中的表达及意义。方法将hapM1的编码区(CDS区)从克隆载体上亚克隆到慢病毒载体上,构建重组慢病毒载体质粒。在脂质体介导下与包装质粒HELPER、包膜质粒VSVG共转染293 T细胞包装生产慢病毒。慢病毒感染293 T细胞后,RT-PCR和Westernblot法检测在293 T细胞中hapM1基因的表达。采用抑制血管平滑肌细胞增殖实验,检测表达产物的生物学活性。结果hapM1基因经测序后与GenBank报道序列完全一致。重组慢病毒载体质粒PNL-hapM1-IRES2-EGFP经鉴定正确。三质粒共转染293 T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为2.0×105TU·L-1。感染293 T细胞后RT-PCR、Western blot检测hapM1组细胞有hapM1蛋白表达,其余两组(Mock-293 T组、293 T组)均无表达。表达产物hapM1蛋白能够抑制血管平滑肌细胞的增殖。结论成功构建带有hapM1基因慢病毒载体,并且能够在293 T细胞中表达具有生物学活性的hapM1蛋白。     

人甲状腺过氧化物酶膜外区基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

摘要 目的：尝试克隆人甲状腺过氧化物酶（hTPO）膜外区基因并构建其杆状病毒表达载体,为其在昆虫细胞中的表达打好基础。方法：PCR扩增hTPO膜外区基因,并将其先后重组入pGEM3zf(+)质粒和pFastBac1质粒,以hTPO-pFastBAC1质粒转染E.coli DH10Bac大肠杆菌,获得重组hTPO杆状病毒表达载体（hTPO-Bacmid）,分别以多种方法鉴定其正确性。结果：经PCR及酶切、基因测序等方法证实得到的重组hTPO-pGEM3zf(+)质粒、hTPO-pFastBAC1质粒和hTPO-Bacmid均与预期相符。结论：成功的克隆了hTPO膜外区基因,并将其正确重组入pGEM3zf(+)质粒和pFastBac1质粒,后者经位点特异性转座整合至Bacmid,成功的构建了重组hTPO杆状病毒表达载体,为进一步实现hTPO在昆虫细胞中的真核表达作好了准备。     

Chinese 1基因型弓形虫棒状体蛋白 ROP16的基因克隆表达及生物信息学分析

目的：构建弓形虫Chinese 1基因型TgCtWh3（以后均简称Wh3）株棒状体蛋白（ rhoptry protein ,ROPs）16的原核和真核重组表达质粒及其3D结构。方法参照ROP16序列分别设计引物,采用PCR从弓形虫Chinese 1基因型Wh3株基因组DNA中扩增出编码ROP16的基因片段,克隆至pMD18-T载体;经PCR及测序分析鉴定;阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达载体pET-28a和真核表达载体pEGFP-C2,分别转化大肠杆菌BL21和DH5α,PCR和酶切鉴定转化菌落插入的序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达;将构建的真核重组质粒经脂质体转染293T细胞,观察其在细胞中表达;采用生物信息学方法分析构建了蛋白的3 D结构。结果各组均PCR扩增出约2．1 kb ROP16基因的特异片段,序列检测结果均正确;分别亚克隆到原核表达载体pET-28a和真核表达载体pEGFP-C2中,成功构建了Chinese 1基因型弓形虫棒状体蛋白ROP16的原核表达质粒和真核表达质粒;原核表达质粒在大肠杆菌中表达了ROP16的融合蛋白;真核表达质粒在293T细胞中成功表达,成功构建出ROP16基因的3D结构图。结论以pET-28a和pEGFP-C2为载体,分别成功构建并表达了ROP16的原核和真核重组质粒,并构建出其3D结构图。     

人骨形态发生蛋白—2基因的真核表达载体构建

目的;利用杆状病毒载体,构建可直接转染昆虫细胞Sf9的含人骨形态发生蛋白-2（hBMP-2)基因的重组穿梭载体（bacmidDNA),最终获得重组蛋白。方法：将编码包含hBMP-2 N-端信号肽,中间前肽以及C－端成熟肽共1188bp的cDNA片断,插入真核表达载体pFastBacl的多克隆位点,受控于pPolh启动子,构建成pFastBacl/hBMP-2重组转移载体。重组子转化大肠杆菌DH10Bac。转座后、挑选阳性菌落,提取bacmid DNA,经PCR鉴定后,以重组bacmidDNA转染Sf9细胞。收集重组病毒,扩大转染Sf9,表达产物行SDS－PAGE初步鉴定。结果：获得了含hBMP-2全长cDNA片段的重组bacmid DNA和重组病毒,经SDS－PAGE证实在昆虫细胞中表达了分泌型hBMP-2蛋白,经激光密度扫描仪扫描显示分泌性蛋白表达量占细胞蛋白总量的35．6％。结论：利用杆状病毒载体成功构建了可用于直接转染昆虫细胞而无需同源重组的重组bacmidDNA,并在昆虫细胞中表达了分泌型hBMP-2蛋白。     

抗HBsAg单链抗体与白细胞介素-2融合蛋白的构建与序列测定

目的:构建以人抗乙肝表面抗原（HBsAg）单链抗体（ScFv）为导向作用,白细胞介素-2（IL-2）为治疗作用的融合蛋白原核表达载体pQE 40/ScFv-IL-2。方法:应用PCR技术将抗HBsAg单链抗体与白细胞介素-2在分子水平上进行基因重组,构建中间载体pGEM7Zf（+）/ScFv-IL-2,经酶切鉴定及序列测定正确后,将目的基因片段克隆到pQE 40表达载体中,转化大肠杆菌,经IPTG诱导表达。结果:SDS-PAGE结果显示在相对分子质量约4.3×104Da处,可见蛋白表达带。以鼠抗人IL-2单克隆抗体经免疫印迹验证,该表达蛋白为所设计的融合蛋白。结论:融合蛋白ScFv-IL-2的成功构建及表达,为融合蛋白的纯化和研究开发新型的乙肝导向治疗的基因工程药物打下良好的基础。     

天蚕抗菌肽AD基因在AcNPV载体系统中的表达研究

目的 研究利用昆虫杆状病毒载体系统在昆虫培养细胞和虫体中高效表达新型多肽抗生素天蚕抗菌肽AD(cecropinAD，CAD)。方法 采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)点突变技术改造CAD基因，改造后的CAD基因先克隆到质粒pGEM—T easy vector中进行鉴定和序列分析，然后再亚克隆到苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus，AcNPV)表达载体pAcGP67B中，获得重组病毒载体pAcAD。用重组病毒载体pAcAD和野生AcNPVDNA共感染草地夜蛾(Spodoptera frugiperdoda)Sf9细胞，经空斑法筛选得到重组病毒AcNPVAD。重组病毒AcNPVAD经PCR扩增签定，证实了CAD基因已经整合到重组病毒AcNPVAD中。结果 以AcNPVAD转染Sf9细胞和苜蓿丫纹夜蛾幼虫，抑菌活性试验证实CAD基因在昆虫培养细胞Sf9和苜蓿丫纹夜蛾幼虫虫体中均得到表达，表达产物具有抑菌作用。通过离子交换层析，杂蛋白基本去除，重组抗菌肽获得初步纯化，重组抗菌肽活性峰位于0．75mol/L处。结论 CAD基因在昆虫杆状病毒载体系统获得了表达，表达产物具有抑菌活性。     

人源抗HBsAg单链抗体与白细胞介素2融合蛋白在巴氏毕赤酵母中的表达

目的：探讨抗HBsAg单链抗体与白细胞介素2融合蛋白在巴氏毕赤酵母(P．Pastoris)中的表达以及初步的纯化、活性鉴定方法。方法：用PCR将目的蛋白基因从质粒PGEM7Zf( )-HBScFv-IL-2上扩增出来，再亚克隆到酵母表达载体pPICZaA中，转化P．Pastoris宿主菌GS 115，菌落：PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定转化子，重组酵母经甲醇诱导后，通过SDS-PAGE及Western-blot分析鉴定表达产物；再通过亲和层析法纯化目的蛋白；用间接ELISA实验鉴定其活性。结果：表达的重组蛋白分子质量约为44ku，表达量可达12％；纯化后凝胶成像分析目的蛋白的纯度达到95％；重组融合蛋白能与HBsAg、鼠抗IL-2单克隆抗体特异性结合。结论：成功构建了抗HBsAg单链抗体与IL-2融合蛋白酵母表达工程菌，并初步建立了对目的蛋白的纯化及活性鉴定方法。     

人白细胞介素24真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的 构建人白细胞介素24(human interleukin-24,hIL-24)真核表达载体,并在HepG2细胞中稳定表达,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),从植物血凝素活化的人外周血单个核细胞中克隆得到hIL-24基因目的 片段.应用DNA重组技术将IL-24PCR产物双酶切后定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),转化大肠杆菌DHSα获得重组载体,进行PCR、酶切及测序鉴定.应用脂质体将鉴定正确的重组质粒转染至HepG2细胞,用G418筛选稳定转染细胞株.采用RT-PCR检测稳定转染细胞HepG2中IL-24 mRNA的表达.结果 通过RT-PCR获得与预期大小一致约600 bp的IL-24基因片段;重组载体pcDNA3.1(+)-IL-24经PCR、双酶切及测序证实,IL-24 eDNA片段已正确插入真核表达载体中;在稳定转染的HepG2细胞株中可见到IL-24 mRNA表达.结论 成功构建了hIL-24真核表达载体pcDNA3.1(+)-IL-24,并获得了稳定转染该重组质粒的HepG2细胞株.     

人白细胞介素-31的真核表达及其对HaCaT细胞IL-6和TNFα表达的影响

目的构建人白细胞介素-31(hIL-31)基因真核表达载体并将其转染到HaCaT细胞,观察其对HaCaT细胞炎症因子分泌的影响。方法分离人外周血单核细胞,加入终浓度为20 nmol/L的豆蔻佛波醇乙酯(PMA),继续培养24 h收集细胞。RT-PCR克隆hIL-31 cDNA,并将其克隆到真核表达载体pSecTag2/Hygro B上。将构建成功的重组体转染至HaCaT细胞,用Western blot分析hIL-31在细胞中的表达以及RT-PCR方法分析其对IL-6、TNFα表达的影响。结果经双酶切、测序及Blast分析鉴定,我们成功获得hIL-31基因cDNA全长序列和pSecTag2/HygroB-IL-31重组体。转染至HaCaT细胞的外源性hIL-31可以促进IL-6、TNFα的表达。结论 hIL-31可以通过自分泌的方式促进HaCaT细胞炎性相关细胞因子的表达。