荧光定量PCR监测单核细胞增多性李斯特菌研究

目的 探索一种快速、敏感、特异的单核细胞增多性李斯特菌检验方法。方法 以单核细胞增多性李斯特菌hlyA基因作为靶序列设计一对引物，并以标准单核细胞增多性李斯特菌菌株中提取的DNA作为模板，用常规PCR和荧光定量PCR对单核细胞增多性李斯特菌进行监测与鉴定。结果 含有一段特征基因的600bp片段，具有良好的单核细胞增多性李斯特菌检测特异性。结论 荧光定量PCR比普通PCR具有特异性强、灵敏度高、重现性好。可以定量、快捷的应用于监测检验单核细胞增多性李斯特菌。     

实时荧光定量PCR法与常规PCR法及细菌培养法检测单增李斯特菌的比较

目的：比较实时荧光定量PCR法、常规PCR法及细菌培养法检测单核细胞增生性李斯特菌的灵敏度与特异性。方法：采用建立的实时荧光定量PCR、常规PCR及传统细菌培养法3种方法,同时对单核细胞增生性李斯特菌等细菌进行检测。结果：实时荧光定量PCR检测的灵敏度可达19 cfu/ml,且有很高的特异性,对英诺克李斯特菌等10种相关细菌均无交叉反应,从细菌核酸提取至完成检测仅需3 h左右。结论：实时荧光定量PCR检测由于在密封环境中进行,避免了产物与环境间的交叉污染,且是3种方法中最为快速敏感的方法,适用于公共卫生应急疫情的实验室快速诊断。     

李斯特菌属荧光定量PCR检测方法的建立

目的采用荧光定量PCR技术,建立可以同步检测李斯特菌属与单增李斯特菌的快速检测方法。方法选取单增李斯特菌hlyM基因和李斯特菌属23Sr DNA基因为靶基因,分别设计引物和探针,在构建二者的阳性重组质粒基础上,对李斯特菌属和单增李斯特菌进行荧光定量PCR的检测。结果建立的李斯特菌属和单增李斯特菌单重荧光定量PCR检测方法与双重荧光定量PCR的检测方法敏感度一致,分别为18.6拷贝/μl和23.2拷贝/μl。结论建立的双重荧光定量PCR方法可以同步检测李斯特菌属与单增李斯特菌。     

脑膜炎奈瑟菌实时荧光定量PCR的检测方法建立及评估

目的 建立脑膜炎奈瑟菌实时荧光定量PCR的检测方法,为快速、准确检测脑膜炎奈瑟菌提供有效的手段.方法 选用脑膜炎奈瑟菌夹膜转运基因ctrA作为靶基因,设计合成引物和探针,建立脑膜炎奈瑟菌实时荧光定量PCR的检测方法.并对该方法的特异性、敏感性、可重复性等进行方法学评价.结果 采用该方法对流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺...     

应用Taqman实时PCR法检测猪肉中单核细胞增生李斯特菌

目的建立敏感快速的检测猪肉中单核细胞增生李斯特菌的实时PCR方法。方法以hlyA基因为靶标,建立并验证实时PCR法的特异性。选用单核细胞增生李斯特菌CMCC 54004,制备不同浓度的纯菌液,用实时PCR进行检测,制作标准曲线并计算扩增效率。进行人工染菌实验,染菌量分别为每25g猪肉样本1.3×100、1.3×101、1.3×102、1.3×103、1.3×104、1.3×105和1.3×106CFU。分别在增菌0、4、8、12、18、24、30、36和46 h取1 ml培养液,提取DNA进行实时PCR检测,并用PCR和传统方法进行检测,比较3种方法检测的敏感性和特异性。采集24份市售猪肉样本,用这3种方法进行检测,进一步比较三者的阳性检出率。结果建立的实时PCR法特异性好,对纯菌液的检出限为1.3×103CFU/ml。人工染菌样本增菌24 h后,实时PCR检出限1.3 CFU/25 g,PCR及传统方法达到这一检出限需要增菌46 h。根据增菌24 h的检测结果,建立实时PCR样本标准曲线。24份猪肉样本,实时PCR检出17份阳性,阳性率70.83%(17/24),与PCR和传统方法的阳性率一致。根据所得的样本标准曲线,对检测样本进行定量分析,确定了阳性样本中初始含量菌。结论所建立的实时PCR具有快速简便、敏感特异等优点,整个操作可在27 h内完成,适用于猪肉中单核细胞增生李斯特菌的快速定量检测。     

荧光定量PCR快速检测沙门菌方法的建立及应用

目的:建立沙门菌实时荧光PCR的快速检测方法,探讨其可行性和应用价值。方法:根据沙门菌的特异性DNA作为靶序列,以沙门菌菌株提取核酸DNA作为模板进行荧光检测。结果:本研究在7种相关菌株的检测中,除沙门菌出现很好的阳性外,其余菌株均为阴性;在纯菌条件下,定量检测低限为30 cfu/ml;同一样品检测3次Ct值的变异系数均小于5%;对模拟标本与分离培养对比,二者符合率为100%。结论:该方法的建立,不仅为食源性沙门菌污染及食物中毒的快速检测提供依据,而且还可直接用于临床粪便标本的检测。     

沙门菌实时荧光定量PCR检测试剂盒的研制与应用

[目的]建立一种快速、灵敏、准确的检测方法,预防沙门菌食物中毒。[方法]根据沙门菌保守基因序列fimY基因设计合成了引物和TaqMan探针,建立快速检测沙门菌的实时荧光定量方法,并对反应条件进行了优化,组装成快速检测试剂盒。[结果]其检测灵敏度达到4．5efu,比常规PER高100倍,而且稳定性良好,冷冻至少可以保存9个月。[结论]通过临床样品的检测,该试剂盒具有操作简便快速、灵敏度高、特异性强、重复性好、稳定性强等优点,很适合大量样品的检测。     

奶液模拟标本中单增李斯特菌real-time PCR检测方法的建立

目的建立了基于TaqMan探针的real-time PCR技术针对奶液模拟标本中单增李斯特菌的快速检测方法。方法用单增李斯特菌hlyO基因的部分片段作为靶基因,制作标准曲线,定量检测奶液中的单增李斯特菌。结果通过对不同李斯特菌及一些较为常见的致病菌的DNA进行扩增,只有单增李斯特菌能够产生扩增曲线,其余菌株均不产生扩增曲线。单增李斯特菌的检测灵敏度可以达到9copies/反应体系。结论该方法特异性好,灵敏度高,整个实验可在1.5h内完成,可用于食品中单增李斯特菌的快速检测和疫情暴发时的相关病原调查。     

改良分子信标-实时PCR快速检测产单核李斯特菌

目的：建立改良分子信标-实时PCR检测产单核李斯特菌（LMO）的快速方法，应用于食品中LMO的污染状况调查及食物中毒快速诊断。方法：根据GenBank公布的LMO hlyA基因的保守序列，设计引物和改良分子信标探针，建立改良分子信标-实时PCR检测体系，应用于食品中LMO检测。结果：改良分子信标-实时PCR反应体系DNA灵敏度为110fg，菌液灵敏度为99cfu／ml或4cfu／PCR反应体系，无交叉反应。以此反应体系检测28株LMO，均出现特异的荧光信号。上述方法可将检测时问由原来的至少4d缩短至1d。对228份食品进行LMO检测，8份增菌液LMO实时荧光PCR阳性，其中6份1310细菌培养阳性。结论：改良分子信标-实时PCR反应体系快速、灵敏度高，特异性强．能提高LMO的检出率和准确性，可应用于LMO食品污染状况调查及食物中毒的快速诊断。     

沙门菌和志贺菌二联实时荧光定量PCR的临床检测应用研究

目的:进行沙门菌和志贺菌二联实时荧光PCR检测的研究,并探讨在CDC体检中临床检测的应用.方法:在沙门菌、志贺菌的fimY基因和缸ipaH基因保守区设计特异性引物和探针,对引物、探针、Mg2 浓度、Taq酶的用量、反应条件等进行优化,并与传统检测方法进行对比.结果:该方法从细菌核酸提取至完成检测仅需3 h左右,对两种菌的检测灵敏度均达到100 cfu/ml,检测自2007年11月以来CDC临床肛拭子样本5896份,实验结果与权威检验机构的结果符合率达100%.结论:二联实时荧光定量PCR可同时定量的检测出沙门菌和志贺菌,灵敏度高,特异性强,检测周期短.适用于CDC体检等同时对沙门菌和志贺菌的快速临床检测.     

荧光实时定量PCR检测铜绿假单胞菌外膜蛋白oprI基因的标准品的构建

目的构建荧光实时定量PCR(FQ-PCR)标准品测定铜绿假单胞菌oprI基因,以此测定铜绿假单胞菌菌量。方法以铜绿假单胞菌的oprI基因为目的基因设计探针引物,提取细菌基因组DNA,与pMD 18-T Vector连接并转化到大肠杆菌中。用氨卞青霉素筛选出白色菌落,提取含目的基因质粒,并用HindⅢ限制酶进行线性化处理,通过直接PCR、OD值测定及DNA片段测序鉴定其特异性。根据OD值确定浓度,制备FQ-PCR梯度浓度参考标准品,做出标准曲线,检测各样品菌菌量。结果铜绿假单胞菌oprI基因的目的片段成功制备,获得稳定的重组质粒,保持了目的片段的特异性和序列完整性,并获得很好的标准曲线(相关系数0.994),成功检测了铜绿假单胞菌标准菌株、培养株的菌量,而大肠杆菌及阴性对照无扩增。结论成功构建FQ-PCR检测铜绿假单胞菌oprI基因的定量参考标准,荧光实时定量法可以快速检测铜绿假单胞菌。     

实时荧光定量PCR方法在沙门菌鉴定及筛选中的应用

目的在沙门菌鉴定中运用taqman技术建立荧光定量聚合酶链反应(PCR)的方法,并考评该方法的特异性、灵敏度、抗干扰性及重复性。方法根据沙门菌GenBank Accession NO DQ644631基因序列,设计并合成引物和荧光标记探针。建立实时荧光定量PCR反应体系,用沙门菌各种型别对该方法进行考评。结果实时荧光定量PCR技术在沙门菌鉴定中有良好的特异性、极高的灵敏度、较强的抗干扰性及重复性。结论在沙门菌的鉴定和筛选中实时荧光定量PCR方法准确、快速、简便,有很好的应用前景和研究价值。     

实时荧光定量PCR法检测MTHFR C677T基因多态性方法的建立和应用

目的:建立一种准确、快速、自动化程度较高的检测亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)C677T基因多态性的方法,并观察中国北方健康人群中MTHFR C677T基因频率。方法:应用MGB探针的原理建立MTHFR C677T基因多态的检测方法,与传统PCR-RFLP方法作对照,共检测标本88例,并计算各基因型频率。结果:荧光定量方法可以快速完成MTHFR C677T基因多态性的检测,检测结果得到传统PCR-RFLP方法的证实。88例北京汉族正常人群MTHFR基因的各种基因型频率为25％、42％和33％。结论:该方法准确、检测效率高,适用于临床实验室及流行病学调查研究。     

PCR法对单核细胞增生李斯特菌食品分离株的鉴定

〔目的〕采用PCR法对常规法分离的八株单核细胞增生李斯特菌 (LM )再鉴定 ,以验证PCR法作为检测LM的有效性及可靠性。〔方法〕八株从食品中分离的LM在BHI培养基纯培养 2 4h后 ,提取基因组DNA ,用PCR扩增hly基因特异性 85 6bp的片段。〔结果〕八株从食品中分离并经传统方法鉴定的LMPCR扩增均出现特异性的条带 ,而其他属的李斯特菌和非李斯特菌未出现特异性的条带。〔结论〕采用hly基因作为PCR扩增的目标基因检测LM具有较好的特异性 ,可用于食品中LM的检测与分离。     

PCR检测食品中单核细胞增生性李斯特菌毒力基因

目的 检测食品中分离的单核细胞增生性李斯特茵毒力基因携带率。方法 应用GB4789．30-94单核细胞增生性李斯特菌的检验方法分离菌株，采用PCR检测李斯特菌的两种致病因子。结果 从2000．2001年我省采集的272份食品中分离出35株单核细胞增生性李斯特菌。其中11株含有内化素基因(Internalin，Inl)和李斯特菌溶血素O基因(Listerialysin0，Hly)，1株仅含有内化素基因；其它23株两种基因均为阴性。结论 我省存在发生李斯特菌食物中毒的潜在危险。建立PCR方法检测李斯特菌毒力基因对快速诊断单核细胞增生性李斯特菌有现实意义。     

呼吸道病原体多重实时荧光定量PCR的检测

目的 建立多重实时荧光定量PCR检测方法,为实现对呼吸道病原体的快速、灵敏特异性检测.方法 采用经报道的引物和探针对合胞病毒、腺病毒等8种呼吸道病原体进行多重实时荧光定量PCR检测.结果 多重荧光定量PCR阳性检测率高达57.8%,无假阳性及假阴性,特异性强.结论 多重实时荧光定量PCR具有经济、快速、特异性强等优点,在呼吸道病原体检测方面有巨大应用价值.     

荧光定量PCR技术检测结核杆菌临床应用分析

目的 探讨荧光定量PCR技术在检测结核杆菌的临床应用价值. 方法 将本院临床诊断确诊为肺结核的68例患者为研究对象,采用荧光PCR技术测定两组痰液及外周血中的结核杆菌,以临床诊断结果为金标准,采用x2检验对结果进行分析比较. 结果 68例结核病患者中痰涂片、痰定量PCR、外周血定量PCR检测的阳性率为14.7％、41.2％、44.1％,定量PCR检测的阳性率显著高于痰涂片(P＜0.05).痰涂片阴性的58例患者中痰及外周血定量PCR检测阳性率为31.0％、41.3％.痰及外周血定量PCR配对检测两种标本同时检测的符合率为44.1％. 结论 荧光PCR技术检测结核杆菌的效果要显著优于传统涂片,其可证实、鉴定涂片阳性结果,同时对痰和外周血进行定量PCR检测,可.增强互补作用,提高检测的准确率.     

TaqMan-MGB探针法快速检测脑膜炎奈瑟菌的研究

目的建立TaqMan-MGB探针荧光定量PCR快速检测脑膜炎奈瑟菌（Nm）方法,为流脑的诊断提供更加灵敏、特异、可标准化、自动化的检测方法;评价TaqMan-MGB探针荧光定量PCR法在健康人群带菌调查中的应用价值。方法根据Nm ctrA基因的3端保守序列设计合成引物和TaqMan-MGB探针,建立快速检测脑膜炎奈瑟菌的荧光定量PCR方法,并对反应条件进行优化。结果TaqMan-MGB探针荧光定量PCR检测脑膜炎奈瑟菌的灵敏度为102cfu/ml,TaqMan-MGB探针法检测900份健康人群咽拭子标本,阳性34例,检出率3.8%,高于培养法（1.2%）。结论该方法特异性强、灵敏度高,能实现脑膜炎奈瑟菌的快速检测,适用于健康带菌检查并可作为临床常规诊断方法的补充,有利于流脑的早诊断、早治疗。     

实时定量PCR在细菌移位研究中的潜力

实时定量PCR（RQ-PCR）是一种新型核酸定量技术,具有实时监测、快速、灵敏、精确、特异等特点.与原有PCR技术相比,其最主要的优势是能对待测样本起始PCR反应模板进行准确定量,扩大了PCR的应用范围.目前在细菌移位研究中,对肠黏膜屏障损伤的早期诊断一直没有很理想的方法.RQ-PCR能准确定量外周血中细菌DNA,有利于对肠黏膜屏障损伤的早期诊断和损伤程度评估.