人前列腺干细胞抗原的原核表达、纯化及鉴定

目的 构建包含人前列腺干细胞抗原(PSCA)的原核表达质粒,并进行诱导表达、蛋白纯化及鉴定.方法 通过PCR扩增人PSCA基因片段,与过渡载体pGEM-T Easy连接后进行测序鉴定,鉴定正确后,将PSCA基因片段酶切并插入含有谷胱甘肽s-转移本科GST标签的原核表达载体pET42a,得到重组质粒pET42a-PSCA.将pET42a-PSCA转化大肠埃希菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达GST-PSCA融合蛋白,用Glutathione-Sepharose 4B柱对融合蛋白进行纯化,纯化产物进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定.结果 PSCA基因的PCR产物大小与预期相符,测序结果与GenBank 中的PSCA序列一致.pET42a-PSCA原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE及Western blotting检测显示融合蛋白诱导表达成功,分子量大小约为43kD.结论 成功构建了人PSCA的原核表达质粒,能在BL21菌株中表达,且纯化后得到较高纯度的GST-PSCA融合蛋白,为后续抗前列腺癌基因疫苗研究奠定了基础.     

SNAP-25基因克隆及其在大肠杆菌中的表达与鉴定

目的：构建SNAP-25基因的原核表达载体pET22b—SNAP-25,对表达产物活性进行初步鉴定。方法：根据GenBank中已报道的SNAP-25基因序列,设计特异引物,通过RT—PCR从小鼠全脑组织总RNA中得到基因。将全长基因克隆至原核表达载体pET22b中,重组质粒转化大肠杆菌E.coli如BL21感受态细胞,IPTG诱导表达,表达产物经Ni—NTA亲和层析进行纯化。通过SDS-PAGE和免疫印迹对其进行鉴定,并对该蛋白进行活性的初步分析。结果与结论：成功构建了原核表达载体pET22b—SNAP-25,Western印迹证实重组蛋白获得表达。表达的重组蛋白与A型肉毒毒素混合反应,经SDS—PAGE验证,重组蛋白具有被毒素特异性切割的活性。     

铜绿假单胞菌外膜蛋白OprH原核表达载体的构建与表达

目的克隆铜绿假单胞菌外膜蛋白OprH基因,构建其原核表达载体并鉴定其表达。方法从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA进行PCR扩增OprH基因;采用T-A克隆技术构建pMD19T-OprH重组质粒,并经酶切和序列测定后,获得OprH片段插入到原核表达载体pET28b中,以构建pET28b-OprH重组表达质粒,并在表达宿主菌E.Coli BL21中经IPTG诱导表达及通过SDS-PAGE电泳鉴定。结果 pET28b-OprH原核表达载体构建成功:重组表达质粒经IPTG诱导后表达外膜蛋白OprH。结论成功克隆了OprH基因并获得原核表达物,为进一步研究快速检测该菌的方法奠定了基础。     

人源性热休克蛋白70在大肠杆菌中的表达及鉴定

为在大肠杆菌中表达人源性热休克蛋白70（HSP70）的基因，以质粒为模板，采用PCR方法进行扩增，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收大小约1.96kb的片段；回收片段经T－A克隆法克隆到pUCm-T载体上，并进行DNA测序；将目的基因片段从pUCm-T载体上酶切后，亚克隆到表达载体pET-21a( )上，将重组质粒pET-21a( )/HSP转化大肠杆菌，经IPTG诱导后，收集细菌，菌体裂解后进行SDS－PAGE及Western blot检测。结果表明，应用PCR方法扩增出约1.96kb的目的片段，序列测定结果证实，扩增的HSP70基因序列与GeneBank中HSP70 cDNA序列一致；经EcoR I Xho I酶切及PCR鉴定证实，HSP70基因成功地克隆到原核表达载体pET-21a( )上，转入重组质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后，进行SDS－PAGE，发现在分子量为72000处有表达量明显增多的蛋白条带，Western blot证实其为目的的条带。表明在大肠杆菌中已成功地表达了HSP70基因。     

霍乱弧菌外膜蛋白W的原核表达及抗原性分析

目的在大肠杆菌中表达霍乱弧菌种特异性外膜蛋白（Omp）W,纯化后制备检测用OmpW抗体。方法采用PCR法以霍乱弧菌基因组为模板扩增ompW基因,插入表达载体pET-32a（＋）的多克隆位点,构建重组表达质粒pET-32a-ompW;重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,筛选阳性重组菌株,经IPTG诱导获得目的蛋白,纯化后免疫新西兰大耳白兔,制备OmpW的多克隆抗体并进行鉴定。结果扩增得到ompW基因片段,并成功构建pET-32a-ompW原核表达系统,重组蛋白OmpW以包涵体形式高效表达;制备的OmpW抗体能与天然的O1群和O139群霍乱弧菌结合。结论霍乱弧菌OmpW可由原核系统高效表达,免疫获得的抗体具有较好的效价,为进一步制备霍乱弧菌检测用抗体奠定基础。     

人MD-2/GST融合蛋白在大肠杆菌的表达

构建人髓样分化蛋白－2（human myeloid differentiation proterin-2,hMD-2)与谷胱甘肽巯基转移酶（glutathione-S-transferase,GST)的融合蛋白（hMD-2/GST)表达载体PGEX－4T－1／hMD-2，在大肠杆菌中融合表达hMD-2/GST。以真核表达载体PEF－BOS／hMD-2为模板，用PCR法在MD－2编码序列上下游引入酶切位点和终止密码子，将hMD-2编码序列克隆入原核表达载体PGEX－4T－1的相应酶切位点，用PCR和酶切筛选，鉴定重组质粒PGEX－4T－1/hMD-2，并对插入基因片断测序，重组质粒PGEX－4T－1／hMD-2转化大肠杆菌，经IPTG诱导后用SDS－PAGE分析表达产物。结果PCR，酶切鉴定和序列测实MD－2编码序列正向插入原核表达载体PGEX－4T－1的相应酶切位点，片断与PCR扩增产物大小相同，序列无误，阅读框架正确，SDS－PAGE证实hMD-2/GST在大肠杆菌中表达，表达量约占菌体总蛋白的30％，说明成功构建了PEGX－4T－1／hMD-2载体，hMD-2/GST融合蛋白在大肠杆菌中得到初步表达，为MD－2后续研究作了必要的准备。     

肿瘤相关抗原MART-1蛋白原核表达载体的构建、表达纯化和活性鉴定

目的构建编码肿瘤相关抗原MART-1融合基因的原核表达载体,在大肠埃希菌中表达His-MART-1融合蛋白,并对蛋白进行纯化和免疫原性鉴定。方法采用PCR法扩增编码MART-1的基因片段,将该基因片段克隆到含有His标签的pET-28b原核表达载体上,重组质粒经双酶切、PCR及测序鉴定正确后转化大肠埃希菌,IPTG诱导融合蛋白表达,用镍离子亲和层析法纯化融合蛋白并进行脱盐,SDS-PAGE电泳和Western blotting法鉴定。通过ELISA法检测经树突状细胞提呈后的His-MART-1融合蛋白对特异性CD4+T细胞的刺激作用。结果重组质粒经双酶切、PCR和测序鉴定证明载体构建成功。His-MART-1融合蛋白经表达纯化后,分子量约13kD,与预期值相符。Western blotting证实该融合蛋白可与抗His单克隆抗体发生特异性结合。His-MART-1融合蛋白经树突状细胞提呈后能刺激MART-1特异性CD4+T细胞分泌IFN-γ。结论成功构建了编码MART-1基因原核表达载体pET-28b-MART-1,表达及纯化获得该融合蛋白,并证实其具有良好的免疫原性。     

免疫毒素IL-18-PE38原核表达载体的构建及其鉴定

目的 构建绿脓杆菌外毒素PE38融合鼠IL-18基因的原核表达载体,并鉴定其产物在大肠杆菌中的表达.方法 首先经逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）获得小鼠IL-18基因,再通过酶切及连接反应,构建小鼠IL-18与PE38融合基因的原核表达载体PRKL-IL18-PE38,重组载体经PCR、限制性内切酶及DNA序列测定证实连接片段正确后,转染感受态大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和蛋白免疫印迹法分别测定其相对分子质量及特异性.结果 成功构建了IL-18-PE38免疫毒素的原核表达载体,重组载体在大肠杆菌中获得了稳定的表达,表达产物的相对分子质量与预期值一致,且所表达蛋白可被抗IL-18的特异性抗体所识别.结论 获得了IL-18-PE38融合基因在原核系统的表达,为进一步研究其对Th1细胞的靶向细胞毒性及临床应用奠定了基础.     

His-TAT-mCherry融合蛋白的跨膜转导及其在细胞内的定位

目的 构建在原核中表达的人类免疫缺陷病毒转录活化因子(HIV-TAT)红色荧光蛋白(mCherry)融合表达载体,荧光显微镜观察HW-TAT的跨膜转导及其在细胞内的定位,为进一步研究HW-TAT的跨膜转导机制及其定位提供重要工具. 方法 采用基因重组技术构建含HIV-TAT以及红色荧光蛋白的质粒pET14b-His-TAT-mCherry,对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,将该质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞,使其在体外表达,并进行纯化、除菌.将纯化的His-TAT-mCherry融合蛋白与Hela细胞共同孵育,荧光显微镜下观察. 结果 PCR、双酶切和DNA测序证明所构建质粒正确;表达纯化出了高纯度的His-TAT-mCher-ry融合蛋白.荧光显微镜下见Hela细胞中红色荧光蛋白主要分布在胞质中,细胞膜上也有一定分布. 结论 成功构建了pET14b-His-TAT-mCherry原核表达质粒,纯化了高纯度的His-TAT-mCherry融合蛋白,该蛋白在哺乳动物细胞中有跨膜转导活性,为研究HIV-TAT的跨膜转导机制提供了一个重要的工具.     

小鼠固醇载体蛋白2原核表达载体的构建与表达纯化

目的 构建小鼠固醇载体蛋白2(SCP-2)融合蛋白表达载体,并在原核细胞内表达及纯化获得具有活性的融合蛋白,为进一步研究SCP-2的生物学功能提供基础.方法 提取BALB/c小鼠肝脏组织总RNA,通过RT-PCR扩增得到鼠SCP-2编码序列,然后将该编码序列克隆到带有His标记的载体pET14b上,重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定正确后转化大肠埃希菌BL21(DE3),用异丙基β-D硫代半乳糖(IPTG)诱导融合蛋白表达,用镍离子亲和层析的方法纯化融合蛋白并进行复性,然后切取分子量正确的条带用SDS-PAGE及质谱技术进行鉴定.结果 重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定证明载体构建正确.融合蛋白表达纯化后获得了分子量约59kD的融合蛋白,符合预期大小,并经质谱分析证明该融合蛋白的表达正确.结论 成功构建了带His标签的SCP-2原核表达载体,并成功表达及纯化出该融合蛋白,为深入研究SCP-2的相关生物学功能提供了一个重要的工具.     

报告基因显像监测基因治疗研究进展

为评价基因治疗,需要随时对治疗基因的定位和表达进行监测。放射性核素报告基因技术是检测基因表达的最好方法。用基因融合、双顺反子、双启动子及双向转录等重组技术,构建表达报告基因的腺病毒载体,导入靶细胞或组织内,然后注射与报告基因偶合的核素标记的探针,进行PET、SPECT或γ-照相,可无创伤地、重复地定量显示报告基因表达。目前,用于基因治疗的报告基因和报告探针系统有:HSV1-tk(单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因)和碘、氟同位素标记的尿嘧啶、鸟嘌呤的衍生物;突变的多巴胺D₂R(多巴胺2型受体)基因和(18F-FESP(18F-氟乙基螺环哌丁苯);SSTr2(生长抑素2型受体基因)和生长抑素类似物等。其中,部分已用于临床试验治疗。     

基因治疗的现状与展望

综述了近三年人类基因治疗研究的有关进展,认为概念上比传统观点有所拓宽,从而开阔了思路,形成了策略多种和方法多样的局面。在临床上候选的治疗病种日益增多,已从先天性遗传病扩展到后天获得的疾病,如肿瘤等。同时也列举了目前有待解决的问题,指出了光明的前景。     

非病毒载体基因递送系统的研究进展

非病毒载体基因递送系统是相对于以病毒为载体的基因递送系统的另一种基因递送系统。具有高安全性、低免疫原性及易于生产的特性。本文就非病毒基因载体的种类、在疾病治疗中的应用前景及存在的主要问题作一综述。     

人降钙素基因在大肠杆菌中的克隆与表达

目的：利用大肠杆菌表达具有生物活性的人降钙素（ｈＣＴ）。方法：以人类基因组ＤＮＡ，为模板，经ＰＣＲ扩增获取ｈＣＴ基因片段，测序分析克隆到ｐＵＣ１９载体中的ＰＣＲ产物，确定得到两种ＣＴ基因序列，其中１＾＃与文献报道完全一致，２＾＃序列中含有（Ｇ６４／Ａ）点突变，采用带有热诱导启动子的高效表达载体ｐＢＶ２２０，对所获得的基因进行了表达，并利用大鼠降血钙实验，对表达产物的活性进行了检测。结果：所获得的ｒ     

节律基因mPeriod2对Lewis肺癌细胞生长的影响

目的 研究节律基因mPeriod2(mPer2)对肿瘤细胞的生长抑制及诱导分化凋亡的作用。方法 体外培养Lewis肺癌细胞,使用脂质体包裹法将真核表达质粒pcDNA3．1为基础的mPer2表达质粒(pcDNA3．1-mPer2)转导入Lewis肺癌细胞内;以免疫组化及流式细胞技术检测mPer2表达;通过流式细胞技术检测稳定转染的mPer2阳性表达的Lewis肺癌细胞的生长及凋亡。结果 mPer2表达质粒(pcDNA3．1-mPer2)转染的Lewis肺癌细胞表达PERIOD2蛋白;与对照组比较,其增殖指数下降及凋亡率增加。结论 节律基因mPer2可以抑制肿瘤细胞的生长,增加肿瘤细胞的凋亡率。     

靶向性腺病毒载体的研究进展

腺病毒载体广泛应用于恶性肿瘤的基因治疗,但它在体内应用时仍存在感染效率低、缺乏靶向性等问题.近年来,多种方法对腺病毒载体进行改建使之具有感染或表达的特异性,提高外源基因的表达效率和特异性.本文对腺病毒载体的靶向性构建相关进展作一综述,主要包括：①转导靶向设计,即通过改变腺病毒的嗜性,提高对靶细胞的转导效率或增加对靶细胞感染的特异性;②转录靶向设计,即在转录水平控制外源性基因的表达,限制基因在靶细胞中表达;③双靶向设计,即以上两方面结合起来改建腺病毒载体.     

亚细胞定位及信号转导检测技术在hrnt_1基因功能研究中的应用

目的 :hrnt_1是本实验室克隆的全长基因 ,GenBankNr库中编号为AF2 2 3393。实验证实该基因与支气管上皮细胞恶性转化相关 ,但具体的生物学功能尚不清楚。本研究旨在建立一种功能研究的方法 ,为探索hrnt_1在细胞恶性转化过程中的生物学功能提供线索。方法 :构建hrnt_1与pEGFP荧光素表达载体 ,通过融合蛋白的表达 ,观察hrnt_1基因产物在细胞中的位置分布 ;利用信号通路检测技术 ,观测hrnt_1对细胞内信号转导通路的影响。结果 :hrnt_1产物主要分布在细胞核中 ,对Myc Max,GR ,NFκB ,EIK_1 STAT等核转录因子活性有上调作用。结论 :细胞定位与信号通路检测技术相结合的方法简便、快速 ,适用于新的疾病基因功能研究。     

感觉神经元特异性受体rMrgE基因的克隆与表达

目的 克隆感觉神经元特异性受体rMrgE基因并于HEK293细胞中表达.方法 利用聚合酶链式反应技术,从大鼠背根神经节总RNA中扩增出目的基因rMrgE,克隆入真核表达载体pcDNA3.1/myc-hisB中,构建真核表达rMrgE载体,瞬时转染人胚肾293细胞得到重组质粒表达细胞株.采用RT-PCR、免疫荧光和Western印迹检测对表达产物进行鉴定.结果 与结论含有rMrgE基因的重组质粒在人胚肾293细胞中获得表达,主要定位于细胞膜上.本研究为进一步探究rMrgE受体的功能奠定了基础.     

外源性WAF1-S基因表达对喉癌细胞生长的作用

目的 探索WA1F-S基因在喉癌细胞内表达的作用,为喉癌的基因治疗提供理论依据。方法 采用亚克隆技术,构建WAF1-S真核表达载体pcDNA3-WAF1-S。利用lipofectamine介导,将外源野生型WAF1-S基因导入喉癌细胞系Hep-2,筛选阳性克隆,采用打点杂交技术观察WAF1-S基因mRNA在喉癌细胞中的表达,用Western blot及激光共聚焦方法定量分析WAF1-S基因的蛋白表达产物,MTT及流式细胞仪检测Hep-2细胞的生长状态。同时以空载体质粒pcDNA3为对照,分析WAF1基因对喉癌细胞生长的影响。结果 打点杂交证实转染WAF1-S基因的Hep-2细胞有外源WAF1-S基因的表达,外源基因WAF1-S在Hep-2细胞系中的表达能抑制Hep-2细胞系的生长。转染后喉癌细胞中WAF1-S的蛋白表达明显高于对照组。流式细胞仪计数证实WAF1-S能诱导喉癌细胞系Hep-2发生凋亡并导致其发生G1期阻滞。结论 导入外源野生型WAF1-S基因可抑制喉癌细胞生长。     

利用RNAi技术抑制ARPC2基因表达的研究

目的 构建pSUPER-ARPC2表达载体,并在真核细胞中进行表达,验证ARPC2基因表达是否受到抑制。方法 设计特异性针对ARPC2基因的寡核苷酸序列,退火后利用常规酶切、连接方法将其重组至pSUPER basic载体中。对阳性克隆进行酶切和测序鉴定后,转染HEK293细胞,利用RT-PCR和Western blot检测ARPC2基因的表达情况。结果 构建的pSUPER-ARPC2载体导入HEK293细胞时,ARPC2基因的表达受到抑制,蛋白合成减少。结论 成功构建了ARPC2的RNAi表达载体,并证实其能对ARPC2基因的表达产生抑制作用,为进一步研究ARPC2的生理功能提供了重要的实验材料。