香烟烟雾提取物诱导A-549肺上皮细胞凋亡

目的：探讨香烟烟雾提取物诱导A-549肺上皮细胞凋亡的机制。方法：以不同浓度香烟烟雾提取物作用于A-549肺上皮细胞，用碘化丙啶（PI）及Annexin V-FITC/PI双标记法检测凋亡细胞及坏死细胞。结果：50％、30％、20％、10％及5％浓度的香烟烟雾提取物处理细胞24h后，经细胞早期凋亡检测，细胞凋亡率分别达到0、31．7％、11．9％、1．6％、0．3％，细胞坏死率分别为100％、34．2％、6．2％、1．1％、0．8％。结论：一定浓度香烟烟雾提取物可诱导A-549肺上皮细胞凋亡，凋亡与坏死相伴存在，并呈剂量依赖性。     

香烟烟雾提取物对肺上皮影响的研究进展

香烟烟雾中含有多种化学成分,绝大部分有致癌作用,能增加罹患肺癌的风险。除此之外,大量的研究表明,吸烟可诱导细胞凋亡、氧化应激、促炎症反应等,是慢性阻塞性肺疾病发病的主要影响因素,可见吸烟对肺功能有直接的影响。研究香烟烟雾对肺上皮的影响可从细胞水平或分子水平上揭示各种肺部疾病的发病机制,从而为疾病的预防和治疗奠定基础。     

PF-5274857阻断香烟烟雾诱导的上皮-间质转化的作用

目的 探讨Smoothened（Smo）抑制剂PF-5274857在香烟烟雾(CS)诱导所致的上皮-间质转化（EMT）转变中的作用, 为口腔鳞状细胞癌的临床治疗和预防提供依据。方法 以支气管上皮细胞株Beas-2b建立体外CS诱导EMT模型,实验分为预防实验和治疗实验两部分进行。预防实验:用3 μmol/L PF-5274857预刺激Beas-2b细胞2 h后用CS溶液培养8 d;治疗实验:CS培养8 d后用3 μmol/L PF-52748573处理Beas-2b细胞4 d。通过Western blot、免疫荧光检测细胞蛋白中EMT标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的含量及位置变化,小室迁移实验测定治疗实验中细胞迁移能力改变。结果 PF-5274857预刺激2 h,间质标志物vimentin和α-SMA蛋白表达降低,上皮标志物E-cadherin表达升高。而已被CS诱导产生EMT改变的Beas-2b细胞经PF-5274857治疗4 d后部分恢复E-cadherin表达,并且vimentin和α-SMA蛋白表达降低,其升高的迁移能力也降低。 结论 PF-5274857可以预防和治疗由CS引起的Beas-2b细胞EMT。     

香烟烟雾提取物对气道上皮细胞增殖和FIP200表达的影响

目的: 研究香烟烟雾提取物(CSE)对气道上皮细胞增殖和细胞周期的影响及其作用机制. 方法: 利用MTT法研究CSE对气道上皮细胞增殖的影响,采用流式细胞术分析气道上皮细胞细胞周期的影响,以RT-PCR和Western blot检测气道上皮细胞FIP200 mRNA和蛋白表达,以免疫共沉淀检测FIP200与局灶粘着斑激酶(FAK)连接状况. 结果: CSE干预的气道上皮细胞MTT吸光度比对照组明显降低,G1期细胞增多,S和G2期细胞明显减少(P<0.01),FIP200 mRNA, FIP200的表达水平以及FIP200与FAK的连接均显著增高(P<0.01),且随CSE干预时间和CSE浓度而增大;气道上皮细胞FIP200表达水平和FIP200与FAK连接的增高均与G1期细胞增多呈正相关(P<0.01),与S和G2期细胞减少呈负相关(P<0.01). 结论: CSE显著抑制气道上皮细胞的增殖,FIP200的高表达可能是其作用机制之一.     

香烟烟雾提取物对猪气道上皮细胞β-连环素及酪氨酸磷酸化的影响

目的 观察香烟烟雾提取物（CSE）和酪氨酸激酶抑制剂（tyrophostin 25)对气道上皮细胞（AEC）酪氨酸磷酸化程度、细胞Src蛋白（c-Src)及β-连环素（β- cat)表达的影响,探讨细胞酪氨酸磷酸化程度及β- cat在吸烟致AEC损伤和修复中的作用及调控机制。方法 体外培养猪AEC,将培养细胞分成3组;N组：加无血清培养基;C组：在无血清培养基上分别加CSE;CT组：加tyrophostin 25及CSE。每组随机检测300个AEC中β- cat免疫细胞化学染色的分布规律;利用图像分析技术,每组随机检测30个AEC的酪氨酸磷酸化程度、c-Src,β- cat mRNA的变化。结果 C组加入20％的CSE作用4h和24h后,AEC蛋白质酪氨酸磷酸化程度分别是N组的1.51倍和3.44倍（P＜0．0001）,胞膜上β- cat阳性表达率分别为26.7%和38．7％,较N组（分别为83.3%和81．3％）明显下降（P＜0．0010）。与N组比较C组胞质中c-Src的浓度分别降低了47．9％和51．4％（P＜0．0001）;CT组酪氨酸磷酸化程度及胞膜上β- cat表达的变化接近N组。而C组和CT组β- cat mRNA含量均较N组有下降（P＜0．0001）。结论 上皮细胞的蛋白质酪氨酸磷酸化程度的变化可能介导了香烟对气道上皮细胞的损伤,而β- cat蛋白质可逆性磷酸化对粘附连接的结构和功能的维持发挥重要作用。     

过敏毒素C3a在健康人气道上皮间质转化中的作用研究

目的 观察过敏毒素C3a在正常人气道上皮间质转化(EMT)中的作用及其相关分子机制.方法 培养正常人气道上皮细胞BEAS-2B,分为对照组,重组人(rhC3a)刺激组,rhC3a+C3a受体拮抗剂(C3aRA)的拮抗组,通过显微镜观察细胞形态学变化情况;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖能力;ELISA检测细胞上清液中转化生长因子-β1(TGF-β1)的蛋白表达情况;RT-PCR检测C3a受体(C3aR)和EMT相关指标mRNA变化情况;Western blot检测C3aR、Smad2/3、p38-MAPK蛋白表达情况.结果 30、50 nmol/L rhC3a刺激组细胞形态由正常鹅卵石样变为梭形,加入1μmol/L C3aRA拮抗组细胞形态较对照组比较无明显改变.50 nmol/L rhC3a刺激组的细胞增殖较对照组降低(P=0.047);30 nmol/L rhC3a刺激组中TGF-β1蛋白水平较对照组升高(P＜0.05),C3aR mRNA及蛋白水平较对照组均升高(P＜0.05),p-Smad2/3、p-p38-MAPK蛋白水平较对照组升高(P＜0.05),加入1 μmol/L C3aRA可以降低以上指标表达(P＜0.05).30 nmol/L rhC3a刺激组中α-平滑肌肌动蛋白、N-钙黏蛋白mRNA表达上调,E钙黏蛋白mRNA表达下降,加入1μmol/L C3aRA可以拮抗这一过程(P＜0.05).结论 过敏毒素C3a通过结合C3aR,诱导正常人气道上皮细胞发生EMT,其机制可能是通过激活Smad2/3、p38-MAPK通路来参与.     

香烟烟雾凝聚物对人胎肾类上皮细胞转化作用的研究

用浓度为10和15μg/ml的香烟烟雾凝聚物处理人胚肾原代细胞24小时,一个月左右细胞开始发生转化。转化细胞的超微结构出现一些特征性的改变,细胞的染色体数目变化明显,DNA合成旺盛,细胞在半固体琼脂上生长,目前体外传代培养已在4年以上,即已获得不死性。     

鼻内滴注烟草提取物和脂多糖建立慢性阻塞性肺疾病小鼠模型的评价

目的：建立鼻内滴注烟草提取物（CSE）和脂多糖（LPS）制备慢性阻塞性肺疾病（COPD）小鼠模型,并探讨其可行性。方法：24只C57BL/6J雄性小鼠随机分为对照组和模型组,每组12只,鼻内滴注CSE和LPS建立COPD小鼠模型,测定2组小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中细胞总数、中性粒细胞数和巨噬细胞数,观察2组小鼠肺组织病理学表现并测定PAS阳性细胞数、肺泡平均内衬间隔（MLI）和肺泡破坏指数（DI）,Western blotting法检测2组小鼠肺组织中E-cadherin、Vimentin和α-SMA蛋白表达水平。结果：实验4和6周时模型组小鼠BALF中细胞总数、中性粒细胞数和巨噬细胞数明显高于对照组（P<0.01）,模型组小鼠肺组织出现典型粘液高分泌和肺气肿改变;实验4和6周时模型组小鼠PAS阳性细胞数、肺泡MLI （P<0.01）和DI （P<0.01）明显高于对照组;与对照组比较,实验4和6周时模型组小鼠肺组织中E-cadherin蛋白表达水平降低（P<0.01）,Vimentin和α-SMA蛋白表达水平升高（P<0.01）。结论：采用鼻内滴注CSE和LPS的方法可在较短时间内建立COPD小鼠模型。     

Effect of Cigarette Smoke Extract on the Proliferation of Human Airway Epithelial Cells and Expression and Activation of FAK

The effect of cigarette smoke extract (CSE) on the proliferation of human airway epithelial cells and the possible mechanism was studied. After airway epithelial cells were treated with different concentrations of CSE for 24 h, the cell proliferation was measured by MTT and the distribution of different cell cycles by flow cytometry. The FAK expression level was detected by Western blot and the degree of tyrosine phosphorylation by immunoprecipitation. The results showed that CSE could inhibit the proliferation of human airway epithelial cells, arrest the epithelial cells in G1 phase of cell cycle, dramatically decrease the number of epithelial cells in S and G2 phases； Meanwhile CSE could decrease the expression level of FAK and the degree of its tyrosine phosphorylation. The above effects of CSE were concentration-dependent. The expression of FAK and the degree of its phosphorylation was positively correlated to the increased number of epithelial cells in G1 phase, and negatively to the number of epithelial cells in S and G2 phases. It was concluded that the mechanism by which CSE could inhibit the proliferation of human epithelial cells was contributed to the increased expression and activation of FAK.     

烟草悬凝物诱导人支气管上皮细胞系恶性转化过程中染色体畸变

目的：研究染色体畸变与细胞恶性转化之间的关系,探讨烟草致肺癌的发生机制.方法：将细胞分为2组：对照组为正常人支气管上皮细胞;实验组为经烟草悬凝物（CSC）处理P15（Passage,P）,P20,P25,P30,P35及P38细胞.采用细胞遗传学方法观察染毒后CSC诱导的人支气管上皮细胞染色体畸变情况.结果：对照组各代细胞二倍体占细胞总数94%～98%,异倍体及多倍体细胞总数为17个,发生率为3%,而且能够在传代过程中基本保持核型及染色体数目稳定.实验组细胞从P15开始逐渐失去正常2n=46核型,二倍体细胞从83%递减至53%,异倍体及多倍体细胞总数196个,发生率为32.7%,与对照组相比较,差异具有统计学意义（χ^2=152.5552,P〈0.01）.对照组各代细胞结构畸变的发生细胞总数6个,发生率为1%;而实验组各代细胞结构畸变的发生细胞总数60个,发生率为10%,与对照组比较差异具有统计学意义（χ^2=40.0834,P〈0.01）;并在P38出现了内复制现象和环状染色体,发生率分别为4%和1%.结论：CSC可影响BEP-2D细胞染色体稳定性,使其发生畸变并最终促使细胞向恶性化方向转化;并在P15就发生染色体畸变.推测染色体畸变可能是早期事件.     

ERK信号通路调控二氧化硅诱导的人支气管上皮细胞上皮-间质转化

目的:探讨细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)信号通路在二氧化硅(SiO2)诱导人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cells,HBEC)上皮-间质转型(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)中的作用机制。方法:SiO2(0～300μg/mL)处理HBEC 72 h,或不同浓度的U0126(0～30μmol/L)干预1 h后再行200μg/mL SiO2刺激72 h,Western印迹检测E-cadherin和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的改变;使用丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)活性检测试剂盒检测SiO2(200μg/mL)处理HBEC(0～8 h)后ERK激活情况。结果:SiO2刺激HBEC后,E-cadherin蛋白表达水平逐渐下调,以300μg/mL时最为明显(P<0.01),α-SMA蛋白表达水平逐渐上调,以200μg/mL时最为明显(P<0.01)。SiO2刺激HBEC后,ERK明显活化,ERK磷酸化水平于30 min开始升高,1 h后逐渐降低。ERK抑...     

microRNA-101a在尿酸诱导的肾小管上皮细胞转分化中的作用

目的研究尿酸对肾小管上皮细胞间充质转分化的影响及microRNA-101a在其中的作用。方法体外培养大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）,分别以0、10、100、500μmol/L的尿酸诱导细胞,采用实时定量PCR检测各组α-平滑肌肌动蛋白（α- SMA）、I型胶原（ColⅠ）及E钙蛋白mRNA的表达水平;Wersten blot检测各组中α- SMA的表达,免疫荧光检测各组中胶原蛋白I（COL）表达水平,观察细胞是否发生转分化。再用实时定量PCR检测各组中miR-101a及COX-2mRNA的表达水平,Wersten blot检测各组中COX-2的表达。进一步实验选择100μmol/L尿酸诱导细胞,并转染miR-101a mimics,分为3组,miR-101a组：先转染miR-101a mimics,再以100μmol/L尿酸培养基培养;空白对照组：以100μmol/L尿酸培养基培养;阴性对照组：细胞转染随机合成的miRNA NC片段,再以100μmol/L尿酸培养基培养。检测各组中α- SMA、ColⅠ、E钙蛋白及COX-2mRNA的表达量。结果培养基中尿酸浓度越高,α- SMA、ColⅠ表达水平也越高,E钙蛋白越低,提示细胞发生转分化,同时miR-101a表达减少,COX-2mRNA表达增多。miR-101a组与空白对照组和阴性对照组比较,α- SMA、ColⅠ及COX-2的表达明显降低（P＜0.05）,E钙蛋白明显升高（P＜0.05）,空白对照组与阴性对照组间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论尿酸诱导肾小管上皮细胞转分化可能呈浓度依赖性, miR-101a及COX-2可能参与尿酸诱导肾小管上皮细胞转分化的调节过程。     

茶多酚对低剂量烟草悬凝物诱导人支气管上皮细胞氧化损伤及凋亡的影响

目的:研究茶多酚对低剂量烟草悬凝物诱导人支气管上皮细胞氧化损伤及凋亡的影响.方法:制备烟草悬凝物(cigarette smoke condensate, CSC),采用四甲基偶氮唑盐[3-(4,5-dimethyl thiazoly)2,5-diphenyl-tetrazolium bromide,MTT]法测定人支气管上皮细胞株(HBE135-E6E7)的生长情况;荧光-化学发光仪测定细胞内氧自由基(reactive oxygen species,ROS)水平;DNA ladder 法检测HBE135-E6E7凋亡;反转录-多聚酶链式反应 (RT-PCR)法检测Bcl-2和Bax mRNA表达.结果:CSC组与CSC+茶多酚组细胞内ROS水平均明显高于对照组(P＜0.01),CSC+茶多酚组细胞内ROS水平则明显低于CSC组.CSC组出现明显的DNA断裂拖尾带,CSC+茶多酚组仅出现少量的断裂拖尾带.RT-PCR结果显示:与对照组相比, CSC组Bcl-2 mRNA表达降低 (P＜0.01), Bax mRNA表达升高 (P＜0.01);与CSC组相比, CSC+茶多酚组Bcl-2 mRNA表达升高 (P＜0.01), Bax mRNA表达降低 (P＜(0.01)),CSC组与(CSC+)茶多酚组 Bcl-2 mRNA/Bax mRNA值明显低于对照组(P＜0.01).结论:茶多酚可拮抗CSC诱导人支气管上皮细胞凋亡,其机制可能是通过有效清除ROS,促进Bcl-2 mRNA表达和抑制Bax mRNA表达实(现的).     

Modulatory effect of aquaporin 5 on estrogen-induced epithelial-mesenchymal transition in prostate epithelial cells

BackgroundEstrogen is involved in the pathophysiological process of benign prostatic hyperplasia (BPH), in which epithelial-mesenchymal transition (EMT) plays an important role. Upregulation of aquaporin (AQP) 5, which is directly activated by estrogen, has been reported to promote EMT in multiple cells. This study aimed to examine the effects of AQP5 on estrogen-induced EMT in the prostate.MethodsNormal prostate (NP) tissue samples without any histopathological changes and BPH tissue samples with pathologically confirmed hyperplasia were obtained. An EMT cell model was subsequently established by adding estradiol (E2) to RWPE-1 cells, after which AQP5 knockdown was performed. Tissue morphological and immunohistochemical features were examined using hematoxylin-eosin and immunohistochemical staining. Western blot analysis was performed to determine the expression of AQPs, estrogen receptors, and EMT-related proteins. Cell proliferation was assessed and supernatants were collected for enzyme-linked immunosorbent assay to determine transforming growth factor-β1 (TGF-β1) concentrations. Immunofluorescence staining was performed to assess protein expressions in RWPE-1 cells.ResultsBPH tissues exhibited greater EMT (TGF-β1: 1.362 ± 0.196 vs. 0.107 ± 0.067, P = 0.003; vimentin: 1.581 ± 0.508 vs. 0.221 ± 0.047, P < 0.001; E-cadherin: 0.197 ± 0.188 vs. 1.344 ± 0.088, P < 0.001), higher AQP5 (1.268 ± 0.136 vs. 0.227 ± 0.055, P < 0.001) and estrogen receptor (ER) α (1.250 ± 0.117 vs. 0.329 ± 0.134, P < 0.001) expression but lower ERβ (0.271 ± 0.184 vs. 1.564 ± 0.130, P < 0.001) expression than NP tissues. E2-stimulated cells had higher AQP5 expression (1.298 ± 0.058 vs. 1.085 ± 0.104, P = 0.049), increased cell proliferation (1.510 ± 0.089 vs.1.000 ± 0.038, P < 0.001), and EMT (TGF-β1 concentration: 0.352 ± 0.021 ng/mL vs. 0.125 ± 0.014 ng/mL, P < 0.001; vimentin: 1.641 ± 0.120 vs. 0.188 ± 0.020, P = 0.002; E-cadherin: 0.075 ± 0.030 vs. 0.843 ± 0.046, P < 0.001) than controls. E2-stimulated cells with AQP5 knockdown exhibited decreased EMT (TGF-β1 concentration: 0.223 ± 0.041 ng/mL vs. 0.352 ± 0.021 ng/mL, P = 0.016; vimentin: 0.675 ± 0.056 vs. 1.641 ± 0.120, P = 0.001; E-cadherin: 0.159 ± 0.037 vs. 0.075 ± 0.030, P = 0.040) than E2-stimulated cells with non-related small interfering RNA (siRNA).ConclusionOur findings suggest that estrogen induces BPH possibly by promoting AQP5 expression. Hence, AQP5 might be a novel target for modulating EMT in prostate epithelial cells.     

配对盒基因2对正常肾小管上皮细胞间充质转分化的诱导作用

［摘 要］ 目的:观察体外转染配对盒基因2（PAX2）对肾小管上皮细胞表型标志物的影响,探讨PAX2诱导转分化的作用,为肾纤维化治疗提供依据。方法:正常肾小管上皮细胞株NRK52E分为对照组、空载组(转染pGC-Fu空质粒)和转染组(采用脂质体转染法将pGC-FU-GFP-PAX2质粒转染至细胞中)。转染72 h后应用倒置相差显微镜观察各组细胞形态,应用Western blotting法和Real-time PCR法检测PAX2蛋白和mRNA表达水平;转染72 h后应用免疫组织化学法、Western blotting法和Real-time PCR法检测各组细胞E-钙黏蛋白(E-cadherin) 和α-肌动蛋白(α-SMA)及其mRNA表达水平。结果：pGC-FU-GFP-PAX2转染72 h后,转染组细胞绿色荧光强度较对照组明显增强,且肾小管上皮细胞的形态伸长; Western blotting法检测,转染组PAX2蛋白表达水平明显高于空载组和对照组（P<0.05）;Real-time PCR检测,转染组细胞的PAX2mRNA表达水平明显高于空载组和对照组（P<0.05）;转染组细胞中的E-cadherin染色较空载组和对照组明显减弱;α-SMA染色较空载组和对照组明显增强。Western blotting法检测,转染组细胞中E-cadherin表达水平明显低于空载组和对照组（P<0.05）;α-SMA表达水平明显高于空载组和对照组（P<0.05）;Real-time PCR检测,转染组细胞中E-cadherin mRNA表达水平明显低于空载组和对照组（P<0.05）;α-SMA mRNA表达水平明显高于空载组和对照组（P<0.05）。结论：PAX2转染正常肾小管上皮细胞后E-cadherin表达减少,α-SMA表达增加,PAX2可能在体外诱导正常肾小管上皮细胞间充质转分化。