Precise location of proton of beta-secretase for catalytic aspartates(Asp 32 and Asp 228)in Alzheimer’s patients

BACKGROUND:β-secretase (β-site APP cleavage rate-limiting enzyme, BACE) has been proposed as a promising therapeutic target for Alzheimer's disease (AD). BACE inhibition reduces production of β-amyloid peptide (Aβ) and promotes neural regeneration. Two catalytic aspartates (Asp 32 and Asp 228) exist in a monoprotonated state in the active BACE site, but the precise proton location remains unclear.OBJECTIVE:To explore the entire process of BACE enzymatic hydrolysis using quantum chemistry calculations, and to identify the precise proton location for Asp 32 and Asp 228 during the enzymatic process.DESIGN, TIME AND SETTING:According to protonation state of BACE, four tautomers were designed and quantum chemistry calculations were performed at the Department of Human Anatomy, Zhongshan School of Medicine, Sun Yat-sen University, China between October 2008 and March 2009.MATERIALS:Hardware:linux workstation (Department of Equipment, Sun Yat-sen University, China); software:QSITE, Glide, Maestro (Schrodinger LLC, USA), MOPAC 2007 (CAChe Research LLC, USA), Triton 4.0 (National Centre for Biomolecular Research, Czech Republic) were used.METHODS:Using crystal structures of BACE to build a catalytic model (enzyme, catalytic water, and substrate peptide EVNLAAEF) on the computer and superimposition, four BACE tautomers (32i, 320, 228i, and 2280) in the monoprotonated state were developed with Schrodinger package. Hybrid quantum mechanical/molecular mechanic (QM/MM) calculations were performed at the B3LYP density functional theory level to identify the precise proton location for the dyad aspartic residues (Asp 32 and Asp 228). Using the most possible tautomer as the reactant, the entire enzymatic hydrolysis of substrate EVNL/AAEF was simulated at the semiempirical level.MAIN OUTCOME MEASURES:The precise proton location of was measured by analyzing co-planarities of 4 BACE tautorners (32i, 32o, 228i, and 2280) in the monoprotonated state, because the dihedral formed by the carboxyl oxygen atoms of the dyad aspartic residues. The transition state and the production state, as well as activation energies and reaction enthalpies, were measured by calculating geometric and energy changes during catalytic reaction of the system.RESULTS:In the 2280 BACE tautomer, the dihedral angle of the four oxygen atoms in the catalytic aspartates was 8.7°, which was the lowest of four tautomers. The lowest activation energy and highest reaction enthalpy (Ea = 216.30 kJ/mol, AH = 30.98 kJ/mol) were also found in 2280, among the four tautomers during the catalytic reaction. In addition, when the reaction proceeded to the transition state, followed by product generation, the proton location was reversed to the inner oxygen of Asp 32 (32i) from the outer oxygen of Asp 228 (228o).CONCLUSION:Results demonstrated the mechanism of Aβ generation. At beginning of BACE catalytic reaction, the precise proton location was preferred on the outer oxygen of Asp 228 (228o). In this protonation state, catalytic reaction can proceed smoothly, with reduced active energy and heat release. When the reaction proceeded to the transition state and product generation, the proton location was reversed to the inner oxygen of Asp 32 (32i). These results provide theoretical guidance for designing new drugs to protect neural cells and promote neural regeneration in Alzheimer's patients.     

β－分泌酶与阿尔茨海默病

阿尔茨海默病（A D ）是最常见的一种痴呆症,主要临床特点为进行性认知功能下降,最终导致身体机能的下降甚至死亡,65岁以上的老年人群多发［1］。对于年轻家族性AD患者而言,AD的发生与多基因因素相关,而对于年老的散发性AD患者,其原因是多重性的,包括基因、环境和后天造成的基因改变等因素。尽管AD的病因不明,但患者脑内β－淀粉样蛋白（Aβ）的增多可能是导致此病的首要原因。Aβ主要是由β－淀粉样前体（APP ）在β－分泌酶（BACE1）的作用下使其在β位点发生裂解而产生,这一过程在AD的病理性神经纤维缠结和淀粉样斑块形成中发挥着重要作用［2］。AD患者中BACE1的表达和活性均有显著升高［3］,已成为诊断AD的一个重要生物指标［4］。而关于BACE1的了解目前还存在很多局限,现通过以下几个方面来讨论近年BACE1在AD中的有关研究进展。     

β-淀粉样蛋白前体蛋白胞内结构域（AICD）与阿尔茨海默病

阿尔茨海默病的（Alzheimer＇s disease,AD）一个重要的病理学特征之一是脑内出现β-淀粉样蛋白（β-amyloid,Aβ）组成的淀粉样斑。β-淀粉样蛋白前体蛋白（β-amyloid precursor protein,APP）经β-分泌酶和γ-分泌酶依次水解后产生Aβ和APP胞内结构域（APPintracellular do-main,AICD）。现在已经知道Aβ在AD的发病机制中起着关键作用,但是关于AICD的生理及病理功能还不清楚。近年来研究发现AICD可以与细胞内多种蛋白相互作用,而且AICD在基因转录、细胞凋亡,突触可塑性,神经发生以及APP的加工和运输过程中均有调节功能。本文针对AICD的生理及病理功能进行探讨。     

阿尔茨海默病重要分泌酶BACE1及其抑制剂

阿尔茨海默病（AD）是一种最为普遍的痴呆。其病理特征是神经细胞外不溶性淀粉样蛋白Aβ以及胞内由过磷酸化tau形成的纤维缠结。这种胞外聚合物主要由Aβ4两组成,它是由淀粉样前体蛋白APP依次经β分泌酶（β-secretase）和γ分泌酶（γ～secretase）剪切所产生的。因此,通过抑制此两种酶很有可能能够减少Aβ的产生从而延缓病程。由于γ分泌酶有众多重要的生理功能,被抑制后会产生很多较为严重的副作用,因此β分泌酶的抑制剂可能是对抗AD药物研发的更有效切入点。本文主要对影响BACE1的表达及活性的相关因素和最新研制成功的β分泌酶抑制剂做简要综述。     

miRNA在阿尔茨海默病发病机制中作用的研究进展

阿尔茨海默病（AD）是一种发病率较高的神经退行性疾病,可严重影响患者及家属的生活质量。miRNA可通过调控AD中淀粉样蛋白前体（APP）、β-分泌酶1（BACE1）、tau等生物标志物的表达和神经炎症相关的胶质细胞的激活影响AD的发病机制。本文综述近年来miRNA在AD发病机制中作用的研究,为进一步探索miRNA对AD诊断及治疗的策略提供依据和思路。     

tau蛋白和自噬在PS—1基因突变发病机制中的作用

阿尔茨海默病（AD）的主要神经病理学特征表现为细胞外神经炎性斑[NPs,又称老年斑（SPs）]、细胞内神经原纤维缠结（NFTs）以及神经元和神经突触的缺失。老年斑主要由含有40～42个氨基酸残基的β-淀粉样蛋白（A13）多肽构成,是β-淀粉样蛋白前体（APP）的蛋白水解产物,而神经原纤维缠结则由神经元内高度磷酸化的细胞骨架相关蛋白tau蛋白聚集形成。     

多光子激光扫描成像技术对活细胞内淀粉样前体蛋白裂解和β-淀粉样蛋白生成的观察

目的在活细胞内探究淀粉样前体蛋白（amyloidprecursorprotein,APP）的裂解和β-淀粉样蛋白（amyloidbeta,AB）的生成机制。方法利用PCR扩增CFP（编码蓝色荧光蛋白）,YFP（编码黄色荧光蛋白）和C99（编码APP最后99个氨基酸）三片段。含有54个碱基（编码APP中间18个氨基酸）的片段54bp由生物公司合成。CFP,YFP,54bp和C99四个片段连入载体质粒pcDNA3．0得到重组质粒pcDNA3．0-CFP-54bp-YFP和pcDNA3．0-CFP-54bp-YFP-C99。将这两个重组质粒分别瞬时转染SH-SY5Y细胞。利用多光子激光扫描显微镜观察融合基因的表达,荧光共振能量转移（fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET）检测APP的B裂解。免疫细胞化学和多光子激光扫描显微镜观察AB的生成。MTT检测转染细胞活性。结果（1）限制性内切酶双酶切消化和测序分析鉴定重组质粒序列完全正确。（2）转染细胞内可以观察到蓝色和黄色荧光。（3）在pcDNA3．0-CFP-54bp-YFP转染细胞中存在FRET现象;在pcDNA3．0-CFP-54bp-YFP-C99转染细胞中观察不到FRET现象。（4）免疫细胞化学和多光子激光扫描显微镜观察到在pcDNA3．0-CFP．54bp-YFP—C99转染的细胞中有AD的生成。（5）AD的沉积广泛分布于细胞内。（6）随着AB在细胞内的产生和聚集,细胞的活性逐步下降。结论C99对于APP的β裂解非常重要。早期Aβ首先在细胞内生成并在细胞内形成广泛沉积。细胞内聚集的Aβ会影响细胞活性,带来不利结果。     

糖基化终末产物对人神经母细胞瘤细胞APP表达及Aβ生成的影响

目的通过研究糖基化终末产物（AGEs-BSA）以及阻断其与特异性受体RAGE的结合对培养的人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein,APP）的表达以及β淀粉样蛋白（β-amyloid,Aβ）生成的影响。方法以培养的SH-SY5Y细胞为模型,将细胞随机分为4组,空白对照组、BSA组、AGEs-BSA组、AGEs-BSA＋抗RAGE中和抗体组。用MTT法观察细胞形态以及确定AGEs-BSA的最佳干预时间及浓度。用免疫细胞化学方法及免疫印迹方法来检测各组细胞内APP、RAGE表达和Aβ生成情况。结果不同蛋白浓度的BSA处理细胞24、48、72h,与空白对照组比较细胞MTT代谢率,APP、RAGE及Aβ的表达水平没有明显差异,（P〉0.05）;不同蛋白浓度的AGEs-BSA（〉50μg/ml）处理细胞与BSA组比较,细胞MTT代谢率明显降低,并随蛋白浓度升高差异越明显,APP、RAGE、Aβ的表达水平较BSA组明显增加（P〈0.05）,预先用抗RAGE中和抗体（1∶100）1h后再加入AGEs-BSA,APP、Aβ的表达水平较AGEs-BSA组明显减少（P〈0.05）,但仍高于BSA组（P〈0.05）。结论糖基化终末产物能够促使SH-SY5Y细胞中APP、RAGE、Aβ的表达和生成增加。通过阻断其与特异性受体RAGE的结合可以部分减少APP、Aβ的表达和生成。     

人羊膜间充质干细胞移植对阿尔茨海默病转基因小鼠的行为学和β-淀粉样蛋白的影响

背景：研究发现APP基因与阿尔茨海默病发病密切相关。β-淀粉样蛋白是阿尔茨海默病患者脑内老年斑的主要成分，基因突变和外界环境的影响能破坏β-淀粉样蛋白的动态平衡，从而引发或加速阿尔茨海默病的产生和发展。 目的：探讨人羊膜间充质干细胞尾静脉移植对阿尔茨海默病转基因小鼠学习记忆能力及脑组织β-淀粉样蛋白表达的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2008-05/10在郑州大学微生物学与免疫学教研室和河南省中医药治疗研究院完成。 材料：健康剖宫产产妇志愿捐献的羊膜，由郑州大学第一附属医院产科提供。APP转基因鼠29只，PCR技术鉴定转APP-基因小鼠9只，作为正常组；转APP+基因小鼠20只，随机分为细胞移植组、对照组，10只/组。 方法：无菌条件下体外分离培养人羊膜间充质干细胞，传至第3代将细胞浓度调整为1×109 L-1，经尾静脉注入0.5 mL至细胞移植组小鼠体内；对照组经尾静脉注入同体积的生理盐水；正常组小鼠不给予任何干预措施。 主要观察指标：采用Morris水迷宫测定小鼠逃避潜伏期、穿越平台次数及在平台象限的时间，刚果红染色观察小鼠脑组织内β-淀粉蛋白的表达。 结果：定位航行试验中，移植前与正常组比较，细胞移植组、对照组小鼠逃避潜伏期差异均有显著性意义（P < 0.05）；移植后2周细胞移植组小鼠逃避潜伏期与正常组基本相似（P > 0.05），但明显短于对照组（P < 0.05）。空间探索试验中，移植前后小鼠穿越平台次数及其在平台象限的时间3组间比较差异均无显著性意义（P > 0.05）。移植后1个月，正常组未见或仅见极少量的β-淀粉样蛋白沉积，细胞移植组淀粉样蛋白的沉积明显少于对照组。 结论：人羊膜间充质干细胞尾静脉移植能促进阿尔茨海默病转基因小鼠空间定位及学习记忆能力的提高，且减少小鼠脑内β-淀粉样蛋白的沉积。     

阿次海默病与Abeta的降解

自1907年始,阿尔次海默病（AD）就被定义为发生在记忆和认知功能脑区的病变：神经原纤维缠结（NFT）、老年斑（淀粉样斑块,SP）的形成以及神经元的进行性死亡。β-淀粉样蛋白（Aβ）是老年斑的主要成分,并且被认为在AD的发生和发展过程中起着很重要的作用。脑内Aβ的水平存在着一个动态平衡：一方面,由Aβ的前体蛋白（APP）经β泌肽酶和γ泌肽酶相继酶切后产生Aβ,进而形成寡聚体并且沉积形成老年斑;另一方面,Aβ可以被NEP等降解酶水解。而AD病人脑内的这一动态平衡被打乱了。在某些病理情况下（如缺氧或者缺血）或者随着年龄的增加,这些降解Aβ的酶的表达水平降低,这就会促进AD的发生。而相反的,以药理学等方法增加这些降解酶的活性,可以起到神经保护作用。这就为AD的治疗提供了一个新思维。     

尼古丁对Aβ25～35细胞毒性的拮抗作用及与β-淀粉样前体蛋白代谢的关系

目的研究尼古丁对β-淀粉样蛋白（Aβ）细胞毒性的拮抗作用及与β-淀粉样前体蛋白（APP）代谢之间的关系。方法不同浓度的尼古丁分别单独或与Aβ25～35同时作用于PC12细胞24h,然后采用MTT法检测细胞活力;WesternBlot法检测PC12细胞上清液中的可溶性β-淀粉样前体蛋白α片段（sAPPα）和细胞内胰岛素降解酶的表达水平。结果（1）尼古丁浓度于0.10～500μmol/L时,对PC12细胞无明显毒性作用（均P〉0.05）,当浓度升至1000μmol/L时则产生一定的毒性作用（P≤0.05）;Aβ25～35浓度于1～100μmol/L时对PC12细胞具有明显毒性作用（均P≤0.01）,Aβ25～35浓度降至0.10μmol/L时则失去其毒性作用（P〉0.05）。（2）尼古丁浓度于0.10～1000μmol/L时,对Aβ25～35诱导的细胞毒性呈现不同的作用：尼古丁浓度于0.10～100μmol/L时可部分拮抗Aβ25～35诱导的细胞毒性作用（均P〈0.01）,但不能使PC12细胞活力恢复至正常细胞水平（均P〈0.01）;而当尼古丁浓度于500μmol/L和1000μmol/L时则不产生拮抗Aβ25～35诱导的细胞毒性作用（均P〉0.05）。（3）Aβ25～35（20μmol/L）和尼古丁（100μmol/L,1000μmol/L）单独或联合作用均可引起PC12细胞可溶性β-淀粉样前体蛋白α片段分泌水平升高（均P〈0.01）,其中以尼古丁浓度为100μmol/L时可溶性β-淀粉样前体蛋白α片段的分泌水平最高。（4）浓度为20μmol/L的Aβ25～35可导致胰岛素降解酶表达水平降低（P〈0.01）,而浓度为100μmol/L的尼古丁可明显拮抗这种作用（P〈0.01）,1000μmol/L的尼古丁则无明显拮抗作用（P〉0.05）;将浓度为100μmol/L和1000μmol/L的尼古丁分别单独作用于PC12细胞时,胰岛素降解酶表达水平明显升高,与正常对照组相比差异有统计学意义（P〈0.01）。结论尼古丁对Aβ25～35诱导的细胞毒性的拮抗作用与可溶性β-淀粉样前体蛋白α片段的分泌水平并无直接关系,而可能与胰岛素降解酶的表达水平相关。     

EGb761对慢性低氧低糖培养的大鼠海马神经元β分泌酶的影响

目的 研究银杏叶制剂EGb761（金钠多）对慢性低氧低糖培养大鼠海马神经元β分泌酶的影响，探讨其防治痴呆的可能机制。方法 取新生24h的Wistar大鼠海马神经元原代培养，培养第7d行低氧低糖培养和EGb 761（金纳多100ug/ml）药物干预，以荧光法检测β分泌酶活性，Western blot检测β分泌酶BACE1蛋白表达。结果 低氧低糖培养12 h、24 h、36 h组海马神经元较正常培养对照组β分泌酶活性升高（P＜0.05）；金纳多药物干预12 h、24 h、36 h组与相应时间非药物干预组相比海马神经元β分泌酶活性降低（P＜0.05）。低氧低糖培养12 h、24 h、36 h组海马神经元β分泌酶BACE1表达水平升高（P＜0.05）；金纳多药物干预12 h、24 h、36 h组与相应时间非药物干预组相比β分泌酶BACE1表达水平降低（P＜0.05）。结论 金钠多对慢性低氧低糖培养海马神经元β分泌酶活性和表达的影响是其防治痴呆的可能机制之一。     

缺氧及复氧对去整合蛋白和金属蛋白水解酶10和淀粉样β分泌酶mRNA水平的影响

目的研究缺氧及复氧损伤对去整合蛋白和金属蛋白水解酶10（ADAM10）和淀粉样β分泌酶（BACE1）mRNA的影响。方法研究分为缺氧12h组，缺氧24h组及各自对照组。缺氧组在缺氧条件下（95％N2，5％CO2）分别培养SH-SYSY细胞12h和24h后复氧，分别于0、12、24h利用逆转录一聚合酶链反应（BT-PCB）方法检测ADAM10、BACE1 mRNA水平；对照组在正常情况下培养，与缺氧组同一时间进行接种和处理。结果缺氧培养12h后复氧各时间点ADAM10 mRNA表达下调（分别较对照组下降19．8％、41．4％、64．6％；P=0．005、0．038、0．001），缺氧培养24h后复氧各时间点ADAM10 mRNA表达下调更明显（分别较对照组下降30．1％、75．9％、86．5％；P=0．009、0．005、0．043）；BACE1 mBNA在缺氧24h后复氧12h和24h表达上调（分别较对照组上调31．5％和35．1％；P=0．028、0．005）。结论缺氧及复氧可以降低ADAM10转录水平和增加BACE1转录水平。     

阿尔茨海默病的干预与α分泌酶ADAM10

阿尔茨海默病（Alzheimer＇s Disease, AD）是老年人最常见的神经变性疾病.整合素和金属蛋白酶10（ADAM10）是一种α分泌酶,也是淀粉样前体蛋白（APP）的代谢中的一种关键蛋白酶,在AD中具有重要作用.在过表达ADAM10的动物模型中发现这种金属蛋白酶可以促进学习记忆和突触生成.因此,ADAM10在神经退行性病（如AD）中是一个有价值的靶点.ADAM10有很多底物,其中以APP最为显著.因此在治疗性提高ADAM10α分泌酶活性时任何副作用都要纳入考虑的范畴.这篇综述总结了目前有关ADAM10的结构和功能的信息,并进一步探讨提高α分泌酶的表达和/或活性作为治疗靶点的可能性.     

脑老化与β淀粉样蛋白沉积

在脑老化的进程中，β淀粉样蛋白（Aβ）的沉积引起认知功能的下降，其机制尚不清楚。文章从β淀粉样蛋白沉积对脑萎缩程度、脑细胞相互作用、氧化应激反应、分泌酶活性的影响等方面对脑老化的进程、认知功能下降与淀粉样蛋白的关系进行了综述。     

尼莫的平对Alzheimer病大鼠海马和额叶细胞外液氨基酸的影响

目的 研究尼莫的平对Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病大鼠海马和额叶兴奋性氨基酸的影响。方法 在立体定位下于迈内特基底核（ＮＢＭ）注入β淀粉样蛋白（β－ＡＰ）１０μｇ建立Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病模型，对照组在ＮＢＭ注入生理盐水，治疗组在建立模型后腹腔注射尼莫的平，每天注射１次至实验结束，模型组不给任何药物。脑内微透析技术采集大鼠海马、额叶细胞外液、反相高效液相色谱技术测定氨基酸类神经递质。结果 模型组海马和额叶细胞外液４种氨基酸浓度均较对照组升高，谷氨酸最明显。尼莫的平治疗后谷氨酸明显降低。结论 由β－ＡＰ产生的Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病大鼠痴呆与兴奋毒性有关，其作用可能是由钙离子介导。     

胰岛素降低糖尿病大鼠大脑皮质β-淀粉样蛋白含量的可能机制

目的探讨胰岛素降低糖尿病大鼠大脑皮质神经元中β淀粉样蛋白(amyloidbeta peptide,Aβ)的可能机制。方法雄性SD大鼠15只,随机分为正常对照组、糖尿病组、糖尿病+胰岛素组,每组5只。用链脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型,用32P放射性配体结合实验检测3组大鼠大脑皮质神经元中糖原合酶激酶3(GSK3)的活性,酶联免疫吸附(ELISA)法检测Aβ的产量及Western blot检测淀粉样前体蛋白(APP)的表达。结果与对照组[GSK3(1.04±0.11),Aβ40(40.92±5.34)pg/μl,Aβ42(29.64±3.19)pg/μl,APP(1.05±0.08)]相比,糖尿病组GSK3活性(2.02±0.12)和Aβ生成[Aβ40(67.53±11.69)pg/μl,Aβ42(45.02±4.10)pg/μl]明显增加(P<0.01),APP(1.52±0.16)表达增加(P<0.05);应用胰岛素后能明显降低GSK3活性(1.21±0.17,P<0.01)和糖尿病大鼠大脑皮质Aβ[Aβ40(42.96±6.03)pg/μl,P<0.05;Aβ42(31.09±3.94)pg/μl,P<0.01]水平,但APP的表达(1.39±0.13)无明显改变。结论糖尿病大鼠皮质神经元Aβ生成增加,GSK3在这一过程中起着重要作用;胰岛素通过抑制GSK3可降低Aβ的生成。     

Alzheimer病与老年脑中β-淀粉样蛋白免疫组化的研究

目的探讨β－淀粉样蛋白（β－ＡＰ）与Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病（ＡＤ）、脑老化之间的关系。方法采用免疫组化方法检查经过临床与病理确诊的３例ＡＤ与６例非痴呆老年对照（ＮＡＤ）脑组织广泛部位中β－ＡＰ的沉积，并且与淀粉样蛋白组化染色的方法如刚果红、爱先蓝（ＳＡＢ）染色相对比。结果发现１ＡＤ脑组织中β－ＡＰ的沉积较ＮＡＤ不仅部位广泛，而且程度严重。２β－ＡＰ的免疫组化染色方法较淀粉样蛋白组化染色方法敏感而可靠。结论β－ＡＰ在脑中的沉积可能与神经元的变性以致智能衰退、ＡＤ的发生有关。β－ＡＰ的免疫组化检测可作为ＡＤ组织学诊断的重要参考。     

血浆Aβ40、Aβ42水平与无认知功能障碍抑郁症 患者的相关性

目的 探讨血浆β淀粉样蛋白40、42（Aβ40、Aβ42）水平及两者比值与无认知功能障碍 抑郁症患者的相关性。方法 收治无认知功能障碍未接受过系统治疗的抑郁症患者70 例，纳入患者 组，同期健康体检者70 例作对照组。测量每组血浆Aβ40、Aβ42 水平。采用汉密尔顿抑郁量表24 项 （HAMD-24）评估抑郁严重程度。结果 患者组血浆Aβ40 水平和对照组比较差异无统计学意义（P=0.39）； 患者组血浆Aβ42 水平明显低于对照组（P=0.02），Aβ40/Aβ42 水平明显高于对照组（P=0.01），且不受年龄 影响，差异有统计学意义。Aβ42 水平与HAMD24 总分呈负相关关系（r=-0.401，P=0.015），Aβ40/Aβ42 与 HAMD-24 总分呈正相关关系（r=0.461，P=0.005）。结论 认知功能正常的抑郁症患者血浆Aβ42 水平降 低，Aβ40/Aβ42 水平增高，Aβ42、Aβ40/Aβ42 水平变化可能与抑郁症发病有关。     

QDs-SA和Cy3荧光标记阿尔茨海默病细胞模型β淀粉样蛋白的比较研究

目的：观察利用量子点（QDs）标记的链霉亲和素复合物（QDs—SA）和传统荧光染料Cy3分别标记的阿尔茨海默病（AD）转基因细胞模型β淀粉样蛋白（AD）在荧光强度和抗光漂白性能的差异。方法：将pcDNA3．1／APP质粒转染至HEK293细胞建立稳定表达株,Western blot法检测转染细胞APP蛋白的表达,细胞免疫荧光检测AD蛋白生成。建立AD转基因细胞模型,分别应用QDs—SA和Cy3细胞免疫荧光染色技术靶向标记转基因细胞模型的Aβ蛋白,激光共聚焦显微镜下对荧光强度和抗光漂白特性进行检测。结果：Western blot法在稳定转染pcDNA3．1／APP质粒的细胞中检测到APP目的蛋白谱带,而未转染的空载体转染组细胞未见APP蛋白表达。共聚焦荧光显微镜下观察到：①APP基因转染后能够生成大量Aβ蛋白;②QDs—SA特异标记的Aβ蛋白主要分布在细胞膜和胞质,显现出均匀分布的高密度橙红色强荧光;③Cy3特异标记AD蛋白荧光强度较QDs—SA标记弱,且细胞膜染色不均匀,部分细胞膜区域有染料少量团聚;④QDs—SA相较于传统Cy3荧光染料的平均荧光强度值更大（P〈0．05）,488nm激发光连续激发12min,QDs—SA荧光标记的Aβ蛋白仍发射较强的橙红色荧光,荧光强度下降了29．25％,而传统荧光染料Cy3荧光强度下降幅度达76．82％。结论：QDs—SA能有效识别AD转基因细胞模型中AD蛋白,且在光稳定性和荧光强度等方面均优于传统的Cy3荧光染料标记的免疫荧光成像。