乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白基因的筛选

目的筛选并克隆人肝细胞中与乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)相互作用的蛋白质基因。方法将重组诱饵质粒pGBKT7eAg转化酵母细胞AH109后与预转了人肝cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,提取质粒后转化大肠埃希菌并进行序列测定,进行生物信息学分析。结果配合后筛选出既能在4缺(SD/TrpLeuAdeHis)培养基又能在铺有Xα半乳糖(Xαgal)的4缺培养基上生长并变成蓝色的真阳性菌落245株。完成了101株克隆的测定,经过序列分析排除了重复同源序列后,最终确定其中有41株不同的基因,其中人类同源基因35条,其余6株为未知基因。结论成功克隆出肝细胞中的HBeAg结合蛋白基因,为进一步研究HBeAg的功能提供了新线索。     

乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白1“饵”载体的构建及在酵母中的表达

目的 构建乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白1（ HBEBP1）真核表达载体,并在酵母细胞中进行表达.方法 以HepG2细胞来源的eDNA为模板,PCR扩增获得HBEBP1基因,克隆至pGEM-T载体.测序正确后双酶切pGEM-T-HBEBP1,回收目的片段并连接至酵母表达载体pGBKT7中,转化酵母菌AH109,在色氨酸缺陷型培养基（SD/-Trp/卡那霉素）上筛选阳性菌落后大量表达并提取重组蛋白,再进行SDS-PAGE和Western Blot分析.结果 成功构建酵母表达载体pGBKT7-HBEBP1,Western Blot结果显示重组蛋白表达产物存在于胞内,条带清晰、大小正确,相对分子质量约33 × 103.结论 利用真核表达载体在酵母细胞中成功表达HBEBP1蛋白,为研究HBEBP1蛋白的生物学功能奠定了基础.     

乙型肝炎病毒preS抗原在大肠杆菌中的高效表达与鉴定

利用ＰＣＲ和基因重组技术构建了乙型肝炎病毒完整ｐｒｅＳ抗原高效表达克隆，该克隆在大肠杆菌中表达一分子量约３１ｋＤ的融合蛋白，由ＭＳ２、白细胞介素３Ｎ端１４个氨基酸接头和ｐｒｅＳ抗原组成，在ＩＬ－３Ｎ端与ＭＳ２连接处有凝血酶识别位点，可被该酶切开。     

乙型肝炎病毒前S1蛋白抗原检测的临床意义

目的通过分析HBV前S1（PreS1）蛋白抗原和血清标志物之间的关系,探讨PreS1蛋白抗原检测在临床上的应用价值。 方法收集382例HBV患者血清样本,采用ELISA法检测HBVPreS1蛋白抗原和血清标志物,采用荧光定量PCR法检测HBV—DNA,并比较所有检测结果。 结果382例HBV患者血清样本PreS1蛋白抗原和HBV-DNA的检出率分别为33．8％和40．8％;其中HBeAg阳性的144例中,PreS1抗原阳性为112例,HBV-DNA阳性为134例,阳性率分别为77．8％和93．1％;HBeAg阴性的102例中,PreS1抗原阳性为17例,HBV-DNA阳性为22例,阳性率分别为7．1％和9．2％。HBV-DNA检出率稍高于PreS1抗原的检出率,但两者间检出率差异均无统计学意义（P〉0．05）。 结论HBVPreS1蛋白可反映HBV复制的情况,与HBV-DNA结果有较好的一致性,可作为临床上HBV感染诊断或监测的指标。     

HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者血清乙型肝炎病毒外膜大蛋白检测分析

目的 探讨血清乙型肝炎病毒外膜大蛋白(HBV-LP)检测在HBeAg阴性慢性乙型肝炎中的诊断价值和临床意义.方法 分别采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法和实时荧光定量PCR法检测306份慢性乙型肝炎患者血清中HBV.M、HBV-LP和HBV.DNA.结果 (1)在未经过抗病毒治疗的患者中,HBV-LP阳性率和HBV DNA无明显差异,而且HBV-LP的吸光度(A值)和HBV DNA拷贝数呈正相关性;(2)在经过抗病毒治疗的患者中HBV-LP的阳性率明显高于HBV DNA.结论 血清中乙型肝炎病毒大蛋白水平能反映HBV感染者体内HBV复制程度,对于判断HBeAg阴性患者体内复制具有重要的临床意义.     

HBV携带者血清病毒标志物和HBV DNA与肝组织中HBVcccDNA相关性的研究

Objective To investigate the correlation of sera HBV DNA and serological makers with hepatic tissue HBVcccDNA in chronic HBV carriers. Methods Real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR) were used to detect HBV covalently closed circular DNA (cccDNA) and total intrahepatic HBV DNA from 30 needle-biopsy specimens as well as HBV DNA in sera in chronic HBV carriers. Quantification of the HBsAg, HBeAg in sera were quantified using Chemiluminescence immunoassay. Results HBVcccDNA can be detected in chronic HBV carriers, which rang from 3.15 × 103 copies/mg to 1.06 × 107 copies/mg. There was a positive correlation between the cccDNA and HBVtDNA (r =0. 375, P < 0. 05 ), but there was no correlation between the cccDNA and sera HBV DNA (P =0. 174). There was a positive correlation between cccDNA and sera HBsAg quantification (r =0. 562, P <0. 001 ) but no correlation with sera HBeAg qantification ( r = 0. 152, P > 0. 05 ). Conclusion HBV cccDNA can be replicated stably in hepatic tissue in all chronic HBV carriers. HBV DNA in sera can not be indicated hepatic tissue cccDNA level. While HBsAg quantification in sera can be used as a marker of cccDNA quantification in hepatic tissue to some extent.     

HBV携带者血清病毒标志物和HBV DNA与肝组织中HBVcccDNA相关性的研究

Objective To investigate the correlation of sera HBV DNA and serological makers with hepatic tissue HBVcccDNA in chronic HBV carriers. Methods Real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR) were used to detect HBV covalently closed circular DNA (cccDNA) and total intrahepatic HBV DNA from 30 needle-biopsy specimens as well as HBV DNA in sera in chronic HBV carriers. Quantification of the HBsAg, HBeAg in sera were quantified using Chemiluminescence immunoassay. Results HBVcccDNA can be detected in chronic HBV carriers, which rang from 3.15 × 103 copies/mg to 1.06 × 107 copies/mg. There was a positive correlation between the cccDNA and HBVtDNA (r =0. 375, P < 0. 05 ), but there was no correlation between the cccDNA and sera HBV DNA (P =0. 174). There was a positive correlation between cccDNA and sera HBsAg quantification (r =0. 562, P <0. 001 ) but no correlation with sera HBeAg qantification ( r = 0. 152, P > 0. 05 ). Conclusion HBV cccDNA can be replicated stably in hepatic tissue in all chronic HBV carriers. HBV DNA in sera can not be indicated hepatic tissue cccDNA level. While HBsAg quantification in sera can be used as a marker of cccDNA quantification in hepatic tissue to some extent.     

HBeAg阴性慢性乙型肝炎9年前瞻性研究

目的对乙型肝炎病毒e抗原(Hepatitis B e antigen,HBeAg)阴性慢性乙型肝炎(chronichepatitis B,CHB)患者的临床特征及转归进行随访。方法前瞻性地观察93例HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者(9·4±6·9)年,对患者的临床特征及转归进行研究。结果93例患者多数平均随访9·4年,23·66%发展成肝硬化,6·45%发生原发性肝癌,4·30%死亡。通过单因素分析表明年龄、是否有嗜酒史、ALT活动形式与HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者发生肝硬化和原发性肝癌的比例相关,差异有统计学意义。结论HBeAg阴性乙型肝炎患者平均随访9·4年转归不佳。年龄、是否有嗜酒史、ALT活动形式与HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者发生肝硬化和原发性肝癌相关。     

慢性乙型肝炎外周血单个核细胞内HBV-DNA与血清HBV-DNA及HBeAg表达关系的研究

目的研究慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)内HBV-DNA和血清中HBV-DNA表达量、e抗原表达的关系。方法采用聚合酶链反应(PCR)检测208例慢性乙型肝炎患者PBMC内HBV-DNA,应用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测血清中HBV DNA含量,应用酶联免疫吸附(ELISA)法检测乙肝血清标志物。结果208例慢性乙型肝炎患者PBMC内HBV-DNA阳性106例、阴性102例。HBV-DNA(PBMC)阳性组、阴性组血清HBV-DNA定量≥1.0E5患者比例分别为91.5%(97例)、45.1%(46例)(χ2=52.12,P<0.01);HBeAg阳性率分别为76.4%(81例)、50.9%(52例)(χ2=21.55,P<0.01)。结论PBMC内HBV-DNA的检测与血清中HBV-DNA定量检测及HBeAg阳性率存在明显的正相关。提示血清HBV-DNA高载量的HBeAg阳性患者外周血单个核细胞感染HBV-DNA明显增加。     

酵母双杂交技术筛选乙型肝炎病毒DNA聚合酶TP结合蛋白的研究

目的　筛选与乙型肝炎病毒 (HBV)DNA聚合酶-N末端蛋白 (TP)相互结合的肝细胞蛋白 ,进一步探讨TP的生物学功能。方法　用聚合酶链反应 (PCR)技术扩增TP片段 ,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒 ,转化酵母细胞AH 10 9并在其内表达 ,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合 ,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖苷酶 (X-α-gel)上进行双重筛选阳性菌落 ,DNA序列测定并进行生物信息学分析。结果　成功获得了 4 7个与TP特异性结合的阳性克隆 ,包括人类固醇调节元件结合蛋白 1(SREBP1)、RNA聚合酶Ⅱ亚单位 (hsRPB7)、血浆铜蓝蛋白(CP)等 2 1种已知功能蛋白质基因和 19个假设蛋白基因。结论　HBVDNA聚合酶-TP可以与某些已知和未知功能蛋白相互结合 ,提示其具有较广泛的生物学功能     

乙型肝炎病毒e抗原基因作为酵母双杂交体系结合域载体的构建及表达

目的　以乙型肝炎病毒e抗原 (HBeAg)全基因为外源片段 ,构建酵母双杂交体系中结合域载体 ,研究其在酵母细胞中的表达 ,排除自身激活作用及毒性作用 ,验证其适用性。方法　根据报道序列设计、合成HBeAg全基因巢式引物 ,取患者血清 ,通过PCR方法分离HBeAg全基因片段 ,克隆入T载体 ,酶切鉴定及序列测定后 ,克隆入酵母双杂交体系结合域载体pGBKT7,构建pGBKT7 eAg载体。再次酶切鉴定阳性克隆后转入酵母 ,验证毒性作用 ;通过Western blot实验证实外源基因在酵母中的表达 ;并进一步验证自身激活作用。结果　由血清中分离的及 2次酶切鉴定的片段大小分别为 6 5 7bp和 6 39bp ,与预期大小一致 ;序列测定与报道的HBV分离株核酸及氨基酸同源性分别为96 %和 10 0 % ;转人酵母后无毒性及自身激活作用 ;Western blot实验出现阳性与预期大小 (2 4 .3× 10 3)一致的条带。结论　pGBKT7 eAg载体在酵母细胞中表达出融合蛋白 ,进一步验证无自身激活及毒性作用 ,此载体构建成功 ,适用于酵母双杂交体系。     

慢性乙型肝炎患者肝脏病理特点与血清HBeAg和HBV DNA的关系

目的 了解慢性乙型肝炎患者病理特点与血清HBeAg和HBVDNA的关系.方法对1057例慢性乙型肝炎患者进行肝脏病理检查,采用荧光定量PCR法检测血清HBV DNA,用化学发光法检测血清HBeAg.结果 HBeAg阴性的慢性乙型肝炎患者的炎症及纤维化程度(G4和S4分别为7.83%和12.17%)较HBeAg阳性的慢性乙型肝炎患者高(G4和S4分别为3.39%和5.44%);HBeAg阳性的患者中HBV DNA滴度低的患者炎症及纤维化程度较高(HBV DNA 104～105 G3G4和S3S4分别为45.64%和30.20%),而HBeAg阴性的患者则是HBV DNA滴度高的炎症及纤维化程度较高(HBV DNA106～107 G3G4为54.55%和HBV DNA 108～109S3S4为42.85%).结论慢性乙型肝炎患者的肝脏病理与血清HBeAg及HBV DNA水平有不同相关性,对HBeAg阴性的慢性乙型肝炎患者要及早进行肝脏病理检查和抗病毒治疗.     

e抗原阳性慢性乙型肝炎患者血清HBV-DNA与HBsAg、HBeAg的相关性分析

目的 研究e抗原阳性慢性乙型肝炎患者外周血中HBV-DNA载量与乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）的相关性,及其在不同性别、年龄群体中的差异.方法 收集319例e抗原阳性慢性乙肝患者血清,采用实时荧光定量PCR法检测HBV-DNA载量,用时间分辨免疫荧光法检测HBsAg和HBeAg的浓度,利用SPSS软件做统计分析.结果 HBV-DNA载量与HBsAg含量有良好的相关性（r=0.514,P〈0.001）;与HBeAg含量有相关（r=0.337,P〈0.001）;女性的HBeAg水平要高于男性患者（P〈0.05）;年龄（31～50）岁组、〉50岁组的HBV-DNA、HBsAg 及HBeAg值皆高于年龄 〈30岁组 （P〈0.001）.结论 e抗原阳性慢性乙型肝炎患者血清中HBV-DNA载量与HBsAg、HBeAg定量水平皆有相关性,其中与HBsAg相关性更佳.     

重组乙肝病毒核心基因DNA与表面抗原-抗体共免疫应答研究

目的:了解小鼠对乙肝病毒核心抗原(HBcAg)基因免疫及与乙肝表面抗原-抗体复合物(HBsAg-抗HBs)联合免疫的应答。方法:用表达乙肝病毒核心抗原N端144个氨基酸的重组质粒DNA(简称pHBc144)100μg及含1μgHBsAg的重组乙肝表面抗原-鼠抗体组建的复合物(简称sIC)免疫Balb/c小鼠。用ELISA法检测血清抗体IgG和IgG1、IgG2a亚类的效价。用半定量PCR法分别检测鼠脾细胞IFN-γ及IL-4的mRNA。结果:pHBc144及sIC联合免疫鼠的抗HBs IgG、IgG1、IgG2a效价均显著高于sIC组(P＜0．05)。同时小鼠还可产生抗HBc及由HBsAg、HBcAg特异诱生的IFN-γ及IL-4。但与sIC共免疫,小鼠对HBcAg诱生的IFN-γ mRNA有所降低。结论:可用HBcAg基因与sIC共免疫,以获得针对乙肝病毒2种结构蛋白的免疫应答。     

慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞基因表达谱的研究

目的 分析慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞差异表达基因，探索慢性乙型肝炎形成的分子机制。方法 应用含14000条人体cDNA的微阵列芯片和来自外周血单个核细胞的标记cDNA，分析了10例慢性乙型肝炎患者和10例健康人基因表达谱。通过应用GenePix 4000B扫描仪和ImaGene3．0分析软件比较cy5标记的慢性乙型肝炎来源cDNA与Cy3标记的健康人来源cDNA的杂交结果，获得个体基因的相对表达比值。结果 在分析的14000条基因中，差异表达的基因有92条，占0．66％。其中51条基因表达水平显著上调，41条基因表达水平显著下调。这些差异表达的基因主要为细胞信号转导，细胞周期和代谢，凋亡及炎症相关类基因。结论 在乙型肝炎病毒致慢性乙型肝炎过程中，涉及到了众多基因的差异表达，为进一步阐明慢性乙型肝炎形成的分子机制提供基础。     

慢性乙肝患者血清趋化因子RANTES水平与肝功能生化指标等的相关性研究

目的 了解慢性乙型肝炎(慢性乙肝)患者血清趋化因子RANTES水平,探讨血清RANTES水平与丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素(TBil)、凝血酶原活动度(PTA)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)及乙型肝炎病毒(HBV DNA)载量的相关性.方法 选择144例慢性乙肝患者(观察组)和18名健康人(对照组),采取静脉血并应用ABC-ELISA方法 检测其血清中趋化因子RANTES浓度,并与两组的肝功能检测生化指标、HBeAg和HBV DNA载量进行相关性分析,利用SPSS13.0软件进行统计分析.结果 慢性乙肝患者血清RANTES的浓度比正常对照组升高,血清RANTES浓度分别为(3930.12±2856.96)ng/ml和(329.46±152.23)ng/ml,两组之间差异比较均有统计学意义(P<0.05);RANTES水平与ALT(r=0.197,P:0.018)、AST(r=0.239,P=0.004)和Tnil(r=0.316,P=0.001)呈显著正相关;RANTES水平与PTA(r=-0.078,P=0.357)无显著相关;HBeAg阴性组与HBeAg阳性RANTES水平比较无统计学意义(P=0.407);HBV DNA低载量组(<105拷贝/ml)和HBVDNA高载量组(≥105拷贝/ml)RANTES水平比较无统计学意义(P=0.185).结论 慢性乙肝患者血清中RANTES表达水平增高,血清RANTES水平与ALT、AST和TBIL呈正相关,与PTA无相关性.RANTES水平可反映肝脏炎症活动及损害情况,不受HBeAg、HBV DNA载量影响,可能参与慢性乙肝发病.