增强型绿色荧光蛋白-C1转染示踪骨髓间充质干细胞

目的：应用增强型绿色荧光蛋白-C1（enhanced green fluorescent protein,pEGFP-C1）标记骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells,MMSCs）,以期为MMSCs的体内移植提供示踪方法。方法：在体外分离培养大鼠MMSCs,流式细胞仪检测细胞表型,以脂质体介导法转染质粒增强型绿色荧光蛋白基因,荧光显微镜观察基因表达。结果：pEGFP-C1在基因转染24 h后开始表达,48-72 h达高峰,12-14 d后有较多的表达。结论：由脂质体介导的质粒pEGFP-C1可较为安全、有效地转染MMSCs,是一种较为理想的干细胞示踪方法。     

脂质体介导的hBMP-2基因转染兔骨髓间充质干细胞的实验研究

目的 观察脂质体介导的人骨形态发生蛋白-2(human bone morphogenetic protein-2,hBMP-2)基因转染兔骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)后mRNA及其蛋白的表达.方法 采用脂质体介导的真核细胞转染技术,将含hBMP-2编码序列的真核表达质粒转染兔BMSCs,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组化及免疫印迹法(Western blot)等手段检测转染后hBMP-2 mRNA及其蛋白的表达.结果 通过脂质体介导的真核转染方法能成功将外源hBMP-2基因转入兔BMSCs,并经RT-PCR、免疫组化和蛋白印迹法证实,转染pcDNA3.1-hBMP-2 后的兔BMSCs内有大量hBMP-2 mRNA 的转录和蛋白的表达.结论 通过脂质体介导的真核转染方法可以将外源hBMP-2基因转染BMSCs,并使其获得较为稳定的表达.     

经转染人骨形态发生蛋白7基因后骨髓间充质干细胞mRNA的表达

目的 构建人骨形态发生蛋白（human bone morphogenetic protein7，hBMP－7）逆转录病毒载体并检测经逆转录病毒介导基因转染的兔骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell,MSCs)mRNA的表达。方法 构建hBMP-7逆转录病毒载体后利用脂质介导的基因转移技术转染包装细胞PT67，制备含目的基因的重组逆转录病毒液并感染兔骨髓间充质干细胞，采用原位杂交、RT－PCR检测hBMP－7mRNA在MSCs中的表达。结果 成功构建了hBMP-7逆转录病毒载体，经hBMP－7基因转染的MSCs可表达外源性BMP－7mRNA。结论 采用逆转录病毒介导的方法可以将hBPM－7转染至MSCs中并表达外源性基因。     

氮磷比对PEI介导BMP-7基因转染骨髓间充质干细胞的影响

目的:研究氮磷比(N/P值)对非病毒基因载体聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)介导骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)基因转染骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,MSC)的影响,优化PEI/DNA复合物制备参数,为其应用于骨组织工程提供实验基础.方法:制备不同N/P值的含BMP-7基因的PEI/DNA复合物,测定复合物的粒径、Zeta电位以及PEI保护DNA抵御DNA酶消化的能力,检测复合物对MSC细胞的毒性以及转染表达BMP-7蛋白量.结果:当N/P值在3-30范围时,形成微粒粒径稳定在100 ～ 150 nm;当N/P值在5～ 30范围时,Zeta电位稳定在30 ～ 40 mV.当N/P值＞3时,随着PEI的增加,PEI对DNA的保护功能增强.当N/P值为7～10时,可以获得最高的基因转染效率.当N/P值大于10时,细胞毒性明显增加.结论:N/P值为7～ 10时,含BMP-7基因的PEI/DNA复合物细胞毒性小,转染效率高.     

腺病毒介导血管内皮细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞

【目的】探讨腺病毒介导血管内皮细胞生长因子（VEGF165）基因转染大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）后目的基因表达情况及对MSCs增殖分化的影响。【方法】构建含VEGF基因的腺病毒表达载体，利用贴壁法分离培养MSCs后，用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效果和转染率，用免疫组化、Western—Blot和ELISA方法分别检测VEGF基因转染MSCs后VEGF的表达情况。【结果】腺病毒介导的VEGF基因对于MSCs具有很高的转染效率，转染效率与病毒感染复制数（multipcyties of infection，MOI）具有量效关系。MOI为150倍时，转染效率〉95％，转染VEGF后，MSCs可有效表达VEGF，9d时达到表达高峰（1125pg／mL），13d后仍可检测到VEGF的表达。转染VEGF对MSCs的增殖分化没有明显影响。【结论】腺病毒介导的VEGF基因可以有效的转染MSCs，MSCs是一种理想的基因载体细胞，其携带的VEGF基因可获得较高的表达水平。     

hBMP-7基因转染对骨髓间充质干细胞增殖和碱性磷酸酶合成的影响

目的探讨逆转录病毒介导的人骨形态发生蛋白7(humanbonemorphogeneticprotein7,hBMP-7)基因转染对兔骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcell,BMSc)增殖和向成骨细胞分化的影响。方法构建hBMP-7逆转录病毒载体,使用含目的基因的病毒液感染BMSc,免疫组织化学方法检测hBMP-7蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖能力,使用流式细胞仪检测细胞周期,NPP法检测碱性磷酸酶合成情况。结果经BMP-7基因转染的兔BMSc有hBMP-7的阳性表达,增殖能力无明显改变(P>0.05),但其合成碱性磷酸酶的能力得到显著提高,与空载体病毒液转染、未经转染的BMSc相比差异有显著性(P<0.01)。结论经BMP-7基因转染的BMSc能够表达外源BMP-7,hBMP-7基因转染能够促进体外培养的BMSc向成骨细胞转化,可用于以BMSc为种子细胞的组织工程化骨组织的构建。     

超声辅助VEGF165转染骨髓间充质干细胞的实验研究

目的：探讨骨髓间充质干细胞定向分化血管内皮细胞的可行性研究。方法：采用超声辅助电穿法，将VEGF165基因的质粒PEGFP—Cl转染至骨髓间充质干细胞，转染后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况。结果：超声辅助转染5h后可见细胞内有GFP表达，10h后可达高峰。结论：VEGF基因转染骨髓间充质干细胞后，骨髓间充质干细胞内有GFP表达，提示细胞转染成功，骨髓间充质干细胞定向分化为血管内皮细胞具有可行性。     

兔腰椎融合术中BMP和bFGF对骨髓间充质干细胞的作用

目的评价骨形态发生蛋白(BMP)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的兔骨髓间充质干细胞(MSC)复合多孔生物陶瓷对提高腰椎融合率的作用。方法将32只家兔随机分为4组(n=8),用下列移植物分别进行腰椎后外侧路融合:Ⅰ组单独应用MSC;Ⅱ组以bFGF作用MSC;Ⅲ组用BMP-2作用MSC;Ⅳ组用BMP-2和bFGF共同作用MSC。实验动物术后6周处死,利用放射学、手工生物力学和组织学方法观察和分析椎体融合的情况。结果影像学和手工力学检测,Ⅳ组椎体融合情况要比其它3组好得多;组织学检测示,在Ⅳ组中,可以看到在融合区周围出现大量的新生成的骨小梁。Ⅱ,Ⅲ组在融合区新生骨小梁较Ⅳ组少,而是新生骨小梁与纤维结缔组织混杂出现;Ⅰ组新生骨小梁显著减少,生物陶瓷微孔内多为纤维结缔组织。结论经BMP和bFGF体外培养的MSC可取得比单独应用MSC更好的融合效果。     

pcDNA3-EGEP基因转染骨髓间充质干细胞的实验研究

目的探讨外源性pcDNA3-EGFP基因转染修饰兔骨髓间充质干细胞的可行性.方法用增荧光绿色蛋白(enhanced greenfluorescent protein,EGFP)cDNA作为报告基因,采用重组真核表达载体系统(pcDNA3-EGFP)以脂质体法转染原代骨髓间充质干细胞,观察转染结果、表达情况及对靶细胞活力的影响.结果经荧光显微镜下观察证实成功地对骨髓间充质干细胞实现了基因转染,持续表达时间超过8周;没有发现明显的细胞毒作用及对细胞活力的显著影响.结论采用真核转染技术可以介导外源基因转染骨髓间充质干细胞,为今后采用基因增强组织工程方法治疗肌肉、骨骼系统疾病提供了实验基础.     

腺病毒介导血管内皮细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞

 【目的】探讨腺病毒介导血管内皮细胞生长因子(VEGF165)基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)后目的基因表达情况及对MSCs增殖分化的影响。【方法】构建含VEGF基因的腺病毒表达载体,利用贴壁法分离培养MSCs后,用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效果和转染率,用免疫组化、Western-Blot和ELISA方法分别检测VEGF基因转染MSCs后VEGF的表达情况。【结果】腺病毒介导的VEGF基因对于MSCs具有很高的转染效率,转染效率与病毒感染复制数(multiplicyties of infection,MOI)具有量效关系。MOI为150倍时,转染效率>95%,转染VEGF后,MSCs可有效表达VEGF,9d时达到表达高峰(1125pg/mL),13d后仍可检测到VEGF的表达。转染VEGF对MSCs的增殖分化没有明显影响。【结论】腺病毒介导的VEGF基因可以有效的转染MSCs,MSCs是一种理想的基因载体细胞,其携带的VEGF基因可获得较高的表达水平。     

重组hCDMP1腺病毒转染骨髓间充质干细胞对其向软骨分化的影响

目的探讨人软骨源性形态发生蛋白1(CDMP1)基因转染对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及分化的影响。方法采用腺病毒转染方法将重组人CDMP1(hCDMP1)基因转入体外培养的兔BMSCs,用免疫印迹法(Western blot)检测hCDMP1蛋白质的表达,并通过检测细胞增殖能力(MTT法)、Ⅱ型胶原(ColⅡ)以及蛋白多糖的表达,分析转染hCDMP1对BMsCs增殖、分化的影响。结果 hCDMP1蛋白在基因转染细胞内得到正确表达;hCDMP1基因转染组和对照组相比,ColⅡ、蛋白多糖表达水平显著增高(P<0.05),而细胞增殖能力无明显变化(P>0.05)。结论外源基因转染可以使BMSCs表达有生物活性的hC-DMP1,高表达的hCDMP1可以促进BMSCs向软骨表型分化,但对细胞增殖无明显影响。     

hPDGF-A/hBD2双基因转染对大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

目的 探讨hPDGF-A/hBD2腺病毒双基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenehymal stem cells,BMSCs)后,对BMSCs本身生物学特性的影响.方法 体外分离培养大鼠BMSCs,应用GFP标记的腺病毒表达载体系统Adv-hPDGF-A-IRES-hBD2.以脂质体法转染293细胞,再以病毒上清液感染BMSCs,对转染目的 基因后的BMSCs进行形态学观察,绘制生长曲线,测定其细胞周期以及向成脂、成骨、成肌诱导分化和鉴定.结果 hPDGF-A/bBD2双基因成功转入BMSCs后,未发现其对细胞活性有明显作用,基因修饰后的BMSCs仍具有成体干细胞所具备的增殖能力,以及向成脂、成骨、成肌等方向分化的潜能.结论 BMSCs是重组腺病毒转染的良好靶细胞,hPDGF-A/hBD2基因修饰的BMSCs仍可作为满意的细胞治疗的种子细胞.     

人骨形成蛋白7基因的克隆及其在兔骨髓基质干细胞中的瞬时表达

目的克隆人骨形成蛋白7(BMP-7基因,并构建其真核表达载体,观察其在兔骨髓基质干细胞(rBMSC)中的表达并探讨其应用于骨科局部基因治疗的可能性.方法用RT-PCR法从人胎肾组织中克隆人BMP-7基因全长cDNA并测序.将BMP-7基因cDNA克隆到穿梭载体pShuttle中构建表达载体pShuttle-BMP-7,经鉴定后利用LipofectAMINE2000瞬时转染rBMSC,用RT-PCR方法及免疫组化检测BMP-7基因的表达.结果用RT-PCR法从胎肾组织中克隆出1296 bp的cDNA,测序证实为人BMP-7基因.RT-PCR方法及免疫组化检测证实其能在rBMSC中表达.结论成功克隆人BMP-7基因并证实其在rBMSC的表达,为下一步腺病毒介导的局部基因治疗打下基础.     

兔骨髓间充质干细胞定向诱导分化为成骨细胞的研究

目的 探讨兔骨髓间充质干细胞﹙bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs﹚体外分离培养、诱导分化为成骨细胞的方法,并研究其生物学特性.方法 采用体外细胞培养技术自兔股骨、胫骨及肱骨中分离BMSCs进行纯化、培养.用地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C定向诱导BMSCs分化为成骨细胞,改良MTT法测定其生长曲线,NBT/BCIP染色法、P-对硝基苯基质法及茜素红染色法检测BMSCs的成骨能力.结果 成骨诱导1～5 d,培养的细胞增殖旺盛,3～5 d即可融合成单层,随着诱导时间的延长,细胞增殖速度减慢,出现细胞聚集的现象,培养细胞逐渐汇合呈铺路石状,细胞形态变为胞体较小的立方形,继续诱导,可出现多角形成骨样细胞,胞外基质分泌逐渐增多,胶原堆积、钙盐沉积,10～12 d形成不透光矿化结节,ALP活性增高,茜素红染色阳性,表示BMSCs向成骨细胞分化.结论 兔BMSCs经体外分离、诱导培养,可以定向分化为成骨细胞.     

增强型绿色荧光蛋白基因转染兔间充质干细胞的实验研究

目的建立增强型绿色荧光蛋白标记间充质干细胞（MSCs）的方法,并观察标记方法对MSCs的分化功能影响。方法应用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、培养兔外周阻MSCs,以携带EGFP的腺病毒（Ad-CMV-EGFP）转染MSCs,荧光倒置显微镜下观察其瞬时表达及转染效率,并对转染后的MSCs进行诱导分化为内皮细胞以观察其部分分化功能。结果①MSCs于体外培养14～20d可达到80％～90％融合,细胞形态为梭形、多角形及纺锤状等。传代MSCs变为形态均一、排列有序的长梭形细胞,增殖活跃;②MSCs经携带EGFP腺病毒转染后24h即可表达EGFP,4～5d时表达最强,此后逐渐减弱,2wk时明显减弱,到4wk时无EGFP表达;③测定腺病毒转染MSCs效率约为60％;④经诱导后分化的内皮细胞呈铺路石样排列,CD31呈阳性表达。结论Ad．CMVoEGFP转染后的MSCs可有效表达EGFP,且本法转染效率较高,基本不影响细胞分化功能,是一种较好的MSCs标记方法。     

兔骨髓间充质干细胞的筛选与体外培养

目的 :探讨兔骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcells ,MSCs)体外分离筛选及扩增的条件 ,同时观察骨髓细胞体外培养的生物学特性。方法 :无菌条件下采集兔骨髓 ,肝素抗凝 ,经淋巴细胞分层液 (相对密度为 1 .0 77)密度梯度离心分离骨髓单个核细胞 ,进而贴壁培养 ,获得MSCs。采用常用细胞培养技术和细胞培养的研究方法 ,观察不同贴壁时间、不同种植密度、有无包被成分及不同蛋白包被培养板对MSCs生长增殖的影响。结果 :预先蛋白包被培养板有利于MSCs贴壁。在细胞生长和增殖方面 ,纤粘连蛋白优于明胶和Ⅰ型胶原 ,以贴壁 48～ 72h ,种植密度 (3～ 9)× 1 0 4 /ml为最适条件 ,有利于梭形细胞形态和快速增殖能力的维持 ,保持成体干细胞的多向分化性。结论 :建立了MSCs体外分离和培养的最适条件 ,为进一步研究MSCs的诱导分化和应用提供了保证     

hBMP-7修饰的骨髓间充质干细胞对肾脏BMP-7的影响

目的观察人骨形态发生蛋白-7(hBMP-7)基因修饰的骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)移植对缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)肾脏内源和外源BMP-7表达的影响,探讨其对IRI肾脏的保护作用。方法 45只兔采用随机数字表的方法分为对照组(Ⅰ组)、单纯BM-MSCs移植组(Ⅱ组)和基因修饰的BM-MSCs移植组(Ⅲ组)(n=15)。构建hBMP-7重组腺病毒并转染兔BM-MSCs,建立肾脏IRI模型后,移植组于肾血流恢复后经肾动脉推注单纯和基因修饰的自体BM-MSCs,对照组同法推注等量生理盐水。3组分别于术后3、7、14 d采用随机数字表的方法取5只兔经耳缘静脉采血,检测血清肌酐(Crea)和尿素(Urea),观察肾功能情况;同时取肾组织进行HE染色行肾小管损伤评分,ELISA和RT-PCR法分别检测肾脏hBMP-7和BMP-7的蛋白浓度和mRNA表达。结果肾脏IRI后3、7、14 d,Ⅲ组Crea和Urea明显低于Ⅰ组和Ⅱ组(P<0.05);Ⅲ组肾小管损伤评分均低于Ⅰ组和Ⅱ组(P<0.05);Ⅲ组检测到第3、7、14天hBMP-7蛋白[(81.8±25.5)、(107.8±33.4)、(49.6±17.8)pg/mg]和mRNA(0.82±0.12、0.69±0.13、0.42±0.10)的表达并维持至少2周;Ⅲ组第3、7、14天BMP-7 mRNA(1.08±0.33、1.36±0.17、1.64±0.21)和BMP-7蛋白(95.9±21.3、137.0±14.9、192.1±18.0)的表达均高于Ⅰ组和Ⅱ组(P<0.05)。结论 hBMP-7基因修饰的BM-MSCs移植既能携带外源性hBMP-7在缺血再灌注损伤肾脏中表达,又能提高内源性BMP-7的表达,减轻肾脏损伤,促进肾脏修复,改善肾脏功能。     

重组腺病毒介导的绿色荧光蛋白基因转染大鼠间充质干细胞的实验研究

目的 体外研究重组腺病毒载体介导绿色荧光蛋白基因转染大鼠间充质于细胞(MSCs)的方法.方法 用密度梯度离心及贴壁法相结合的方法分离纯化大鼠MSCs并进行鉴定,重组绿色荧光蛋白的腺病毒载体Ad-GFP转染,荧光显微镜检测其转染效率,CCK-8法检测转染细胞的增殖能力.结果 Ad-GFP对大鼠MSCs的感染率高达90.0%,感染1月后仍有稳定表达;转染细胞的增殖能力与未转染细胞相比,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 重组腺病毒载体Ad-GFP可高效感染MSCs,基因转染后细胞的增殖能力不受影响,可作为一种高效的大鼠MSCs的标记方法.     

EphrinB2基因工程的骨髓间质干细胞对分化成血管内皮细胞的影响

目的 观察研究ephrinB2基因转染对体外诱导环境大鼠骨髓问质干细胞(BMSCs)分化成血管内皮细胞的促进作用.方法 采用密度梯度离心-贴壁培养法从Wistar大鼠骨髓中得到BMSCs.采用lenti-virus载体装载人ephrinB2基因转染大鼠BMSCs.采用流式细胞计数测定CD105、CD73、CD44、八因子(VWF)和血管内皮生长因子受体(KDR)等标志物在ephrinB2-BMSCs中的表达,并探讨其向成骨细胞及脂肪细胞体外分化的多向分化潜能.以2％FBS和50ng/ml血管内皮生长因子(VEGF)的培养条件,体外诱导ephrinB2-BMSCs向血管内皮细胞分化,并测定相应标志物的表达.结果 未经诱导分化的ephrinB2-BMSCs表达CD105、CD73和CD44,不表达血管内皮细胞特异性标志物VWF和KDR.转染后的ephrinB2-BMSCs依然具有分化成脂肪细胞和成骨细胞的多向分化潜能.经诱导,ephrinB2-BMSCs表达VWF与KDR,并且其生成血管内皮细胞的比率及在Matrix基质上形成毛细血管样结构的比率均显著高于未转染ephrinB2的BMSCs.结论 ephrinB2基因工程的BMSCs具有极高的向血管内皮细胞分化的潜能.这种基因工程细胞为建立冠心病患者的临床治疗新方法提供了有意义的资源.     

体外诱导人骨髓间充质干细胞定向肝细胞分化

目的:研究人骨髓间充质干细胞向肝细胞的诱导分化,为肝组织工程提供理想的细胞来源。方法:以肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4对种植于基底膜基质中的人骨髓间充质干细胞进行三维立体诱导培养,在培养后不同时间,分别进行形态观察、AFP、Alb的免疫组化荧光染色及靛青绿的摄取与排泌试验。结果:该条件下诱导后的人骨髓间充质干细胞生成肝细胞样细胞,阳性表达肝细胞特有表面标志AFP、Alb,并具备肝细胞特有的摄取与排泌靛青绿的活性功能。结论:肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4及基底膜基质可能在体外人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的过程中提供适宜的微环境并起重要作用,这为间充质干细胞在肝组织工程中的应用提供了理论与技术上的支持。