重组人β-淀粉样蛋白1-42大规模发酵及纯化工艺

目的:在毕赤酵母（Pichia pastoris）中高效表达人β-淀粉样蛋白1-42(hAβ_1-42),用80 L的发酵罐大量制备hAβ_1-42。方法: 在成功构建表达载体pPICZα-hAβ_1-42并电转化至毕赤酵母X-33的基础上,筛选高表达hAβ_1-42工程菌,对发酵液的pH值、溶解氧、甲醇流加速度以及诱导表达的时间等发酵条件进行系统优化,通过阳离子交换层析和反向疏水层析对其进行纯化,实现其大规模制备。结果: 筛选出的高表达工程菌采用80 L发酵罐甲醇诱导补料批式发酵,在pH 4.0、溶解氧浓度20 %～30 %、罐内压力为10 psi、甲醇诱导48 h时产量最高可达150 mg•L^-1;纯化的hAβ_1-42经SDS-PAGE分析显示单一区带,相对分子质量约为4 200。结论:构建、筛选出高效表达hAβ_1-42的毕赤酵母工程菌,并建立稳定的发酵和纯化制备工艺。     

rhKPI/AβPP大规模发酵及纯化工艺

目的：在毕赤酵母（Pichia pastoris）中高效表达AβPP中的Kunitz型蛋白酶抑制剂的结构域（KPI/AβPP）,利用80 L的发酵罐优化发酵条件,制备rhKPI/AβPP。方法：克隆kpi基因插入到pPICZα,构建真核表达载体pPICZα-kpi,经核酸测序确证后,电转化毕赤酵母菌株X-33,筛选高表达rhKPI/AβPP工程菌。结果：筛选出的高表达工程菌采用80L发酵罐甲醇诱导补料批式发酵,在pH 3.3、纯氧浓度22％~30％、罐内压力为12psi、甲醇诱导60 h时产量1.0 g·L^-1。纯化的rhKPI/AβPP经SDS-PAGE分析显示单一区带,相对分子质量6 750。质谱测定其相对分子质量为6 750,抑制胰蛋白酶的比活性为8.4 EPU·mg^-1。结论：克隆、构建、筛选出高效表达rhKPI/AβPP的毕赤酵母工程菌,并建立了稳定的发酵和纯化工艺。     

rhHSP110毕赤酵母工程菌的大规模发酵及产物纯化

目的：探讨重组人HSP110（rhHSP110）毕赤酵母工程菌在80 L发酵罐中大规模发酵的工艺及发酵产物rhHSP110的纯化方法。方法：在摇瓶中制备rhHSP110工程菌种子2 L,将种子接种到80 L发酵罐中,采用补料分批培养方式对工程菌进行高密度发酵。控制和优化各种发酵条件,经历72 h后结束发酵。将发酵液离心,经阳离子交换层析对上清中的表达产物进行纯化。结果：控制发酵温度为30℃ ,pH值为4.2,溶氧值为20%以上,在酵母细胞湿重达到200 g•L^-1时开始甲醇诱导表达,72 h后结束发酵。发酵上清通过阳离子交换 层析纯化后获得纯度为80%的rhHSP110,产量为500 mg•L^-1。结论：rhHSP110酵母工程菌在80 L发酵罐高密度发酵成功,为rhHSP110的产业化生产及临床研究了奠定基础。     

不同构建策略对D-氨基酸氧化酶表达的影响及发酵调节

目的 构建不含编码β-内酰胺酶编码基因的D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase,DAAO)工程菌,对不同构建策略构建的重组菌进行发酵调节研究.方法 采用分子生物学手段,利用不同的策略、不同的毕赤酵母宿主菌,构建DAAO工程菌;利用微生物发酵和调节手段,对工程菌的发酵条件进行优化.结果 获得了表型不同的3株重组菌(Muts的PDK13和PDGA10,Mut 的PDG27),它们的最佳生长条件基本相似,诱导表达条件却不相同,在Basal salts培养基内,当生长时间为36 h,诱导培养基起始pH为6.0、甲醇浓度为0.5%时,最有利于DAAO表达.在菌体密度相同的条件下,Mut 表型(PDG27)甲醇代谢快,诱导24 h,DAAO活力达到最高;Muts型(PDK13和PDGA10)甲醇代谢慢,诱导36 h,DAAO活力达最高;通气量一定时,菌体密度增加,DAAO表达量增加,菌体增加到一定程度表达量反而下降,表明通气量应随菌体密度的增大而增加.结论 Muts型重组菌对通气量要求低且更有利于高密度发酵.     

重组SRH融合蛋白工程菌发酵的工艺研究

目的通过对影响表达SRH融合蛋白工程菌发酵的主要因素的研究,建立适宜SRH融合蛋白工程菌的发酵工艺。方法通过对发酵过程中的pH、溶氧调控、诱导温度、诱导时机及诱导时间进行优化建立SRH蛋白的发酵工艺,利用SDS-PAGE电泳分析表达情况。进一步利用离子交换和凝胶过滤层析对目的蛋白进行纯化,并对纯化后目的蛋白的溶栓活性和抗凝活性进行检测。结果优化后发酵条件为:发酵pH为7.0、溶氧为45%、菌体浓度达到OD600=8时开始诱导,诱导温度为41℃,诱导时间为4.5h。该发酵条件下得菌量为25g/L。SRH蛋白表达量为45%,并且90%以上为可溶性表达,纯化后蛋白纯度达95%以上,纯品SRH蛋白溶栓活性为1.80×104AU/mg,抗凝活性为100AU/mg。结论建立了SRH融合蛋白工程菌稳定的发酵工艺,该条件下SRH工程菌发酵蛋白表达量较高,多为可溶性表达,且杂蛋白较少,发酵产物具有生物学活性。     

重组毕赤酵母发酵表达人乳头瘤病毒病毒样颗粒培养工艺条件的优化

对重组毕赤酵母表达人乳头瘤病毒病毒样颗粒发酵条件进行了优化。在全合成摇瓶培养基的基础上,考察了诱导过程中培养液pH、温度、铵离子、油酸对人乳头瘤病毒病毒样颗粒发酵的影响。研究表明发酵过程中单体蛋白16L1的表达条件与组装条件不同:pH=4.5最适于单体L1表达,而pH=3.5则最适于VLPs组装;28℃利于单体L1表达,而30℃则促进VLPs组装;发酵指数生长期诱导时铵离子浓度为0.26~0.30mol/L,利于菌体生长、单体L1表达与组装;生长稳定期时铵离子浓度为0.34~0.42mol/L,最有利于单体的合成与组装。进一步研究发现,诱导初期添加油酸,会抑制单体L1表达,而在诱导中期添加φ=5%油酸则能够极大地促进L1自组装。毕赤酵母发酵过程中胞内单体L1表达与自组装的最优化工艺条件的考察,为工业发酵优化表达人乳头瘤病毒病毒样颗粒提供了应用基础。     

重组复合干扰素基因工程菌发酵培养条件的研究

目的:研究表达重组复合干扰素(con-IFN)的工程菌E.coliDH5α(pBV220/con-IFN)的发酵条件。方法:在摇瓶实验中,采用正交设计法和均匀设计法确定较佳培养基组分;使用20 L发酵罐进行补料分批发酵实验,研究影响菌体生长和con-IFN表达的因素(如溶氧、补料、温度和诱导时间)。结果:发酵培养基配方为蛋白胨10 g/L,酵母膏7.5 g/L,甘油0.5%,Na2HPO4.12H2O 20.13 g/L,KH2PO410.37 g/L,NaCl 9.31 g/L。确定了高密度发酵工艺,即优化的发酵培养基,初始pH7.2,接种量5%,溶氧15%,先经35℃培养4 h,后降温至30℃培养2 h,再以42℃诱导7 h,诱导的同时补料酵母膏0.5%。在此条件下,发酵液可得15.2 g/L湿菌体,con-IFN的表达量占菌体总蛋白的49.60%,每毫升发酵液的抗病毒活性为9.69×108IU。结论:获得了较满意的优化培养基配方和发酵条件,为下游纯化和进一步大规模生产奠定了基础。     

甘油对毕赤酵母高密度发酵表达重组水蛭素Ⅱ的影响

目的：考察甘油对毕赤酵母生长和重组水蛭素Ⅱ表达的影响。方法：在摇瓶和IOL发酵罐中用含有不同浓度甘油的培养基培养毕赤酵母，测定毕赤酵母的生长和重组水蛭素Ⅱ的表达。结果：发酵培养基中初始甘油浓度为5g／L时，毕赤酵母生长速度明显加快；补料过程中甘油浓度大于70g／L时，毕赤酵母生长受到抑制。与不加甘油相比较，诱导表达期维持培养基中甘油浓度在5g/L以下，重组水蛭素表达可提前4h，诱导30h其活性达13000 ATU／ml，比仅用甲醇诱导时效价提高了7．7％。结论：降低初始培养基中甘油浓度有利于毕赤酵母生长，补料过程中培养基甘油浓度应维持在押制毕赤酵母生长的浓度之下，诱导阶段培养基中少量的甘油有利于水蛭素的表达.     

用重组大肠杆菌生产rhG-CSF高密度发酵的方法

目的 :优化重组人粒细胞集落刺激因子 (recombinanthumangranulocytecolony stimulatingfactor,rhG CSF)的生产工艺 ,了解菌体生长和产物合成规律 ,为rhG CSF的工业化生产提供依据 .方法 :以摇瓶发酵的研究结果为基础 ,在 5L发酵罐中 ,测定工程菌rhG CSF的生长曲线 ,根据在不同pH值、溶氧和诱导时机时工程菌生长的情况 ,研究重组大肠杆菌DH5(/pBV2 2 0生产rhG CSF分批补料培养的工艺条件 ,确定 5L发酵罐稳定的发酵工艺参数 .结果 :培养工程菌的优化条件为 :发酵前期流加 2mol/L的氢氧化钠控制pH值为 7.2 ,当开始诱导表达时 ,控制pH为 6 .8;溶氧水平控制在 5 0 %以上 ;选择菌体在对数生长中期A60 0nm值为 1 2 .0进行诱导表达 .在此优化的培养条件下 ,菌体A60 0nm值达到 (2 1 .3± 0 .9) ,细胞干质量可达 (1 2 .3± 0 .7)g/L ,细胞湿体积质量为 (4 3.8± 0 .9)g/L ,rhG CSF的表达量为 (4 1 .9± 1 .6 ) % .结论 :pH值、溶氧和诱导时机等培养条件对工程菌生长和表达有显著影响     

人抑瘤素M在毕赤酵母中的高效分泌表达

目的：在毕赤酵母中高效分泌表达重组人抑瘤素M（rhOSM）。方法：以人胚胎组织DNA为模板通过PCR技术获得hOSM基因,构建毕赤酵母真核表达载体pPICZαC-hOSM,电转化毕赤酵母菌株X-33,PCR法筛选阳性克隆,SDS-PAGE和Western blotting方法筛选能够稳定、高效分泌表达rhOSM的酵母工程菌。结果：经PCR法获得了hOSM基因,培养液上清经SDS-PAGE和Western blotting证实获得了相对分子质量约为28 000的rhOSM,表达量为45　mg•L^-1。结论：毕赤酵母表达系统能够稳定、高效分泌表达rhOSM,摇瓶规模表达量为45 mg•L^-1。     

外源蛋白在毕赤酵母表达系统中高效表达的培养条件的优化策略

毕赤酵母表达系统是目前最为成功的真核外源蛋白表达系统之一。本文从培养基的成分、培养温度、培养基的pH值，溶解氧的量和甲醇浓度等角度对国内外在毕赤酵母表达系统中高效表达外源蛋白的培养条件的优化策略做了较详细的综述．     

人免疫缺陷病毒II型gag基因在毕赤酵母中表达条件的研究

目的 :提高人免疫缺陷病毒 II型 ( HIV- 2 ROD) gag基因在毕赤酵母中的表达量。方法 :研究了转化子生长的培养条件 ,包括不同的甲醇诱导浓度、诱导时间、溶解氧、摇瓶转速及不同 p H值对人 HIV- 2 gag表达的影响。表达产物进一步通过盐析和 Sephadex G- 1 0 0分子筛层析柱层析分离纯化。结果 :最佳表达条件是 1 .0 %甲醇诱导 ,诱导时间 3d,大于 85 %的溶解氧 ,摇瓶转速2 5 0 r·min-1,p H6.0～ 6.5 ,目的蛋白表达量达到 2 1 mg· L-1。同时 ,经纯化后得到了纯度大于95 %的目的蛋白。结论 :获得了 HIV- 2 RODgag重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中分泌表达的最佳表达条件。     

木聚糖酶高产菌株Pichia pastoris G12摇瓶发酵工艺的优化

目的研究甲醇诱导的Pichia pastoris G12在摇瓶发酵条件下产木聚糖酶的表达规律。方法以木聚糖酶酶活力为评价指标,通过单因素试验和L9(34)正交试验考察确定摇瓶发酵条件下pH、接种时间、甲醇体积分数、诱导时间等因素对酶活力的影响。结果各因素影响程度依次为pH>甲醇体积分数>诱导时间>接种时间,最优表达条件为接种时间21 h,pH为5.5,甲醇诱导体积分数为1.50%,诱导时间为162 h。在此最优条件下培养菌株酶活力可达395.124 U.mL-1。结论该研究为木聚糖酶的工业化生产和应用提供了依据。     

毕赤酵母菌分泌表达重组抑肽酶的高密度发酵工艺研究

目的:对毕赤酵母高密度表达重组抑肽酶的发酵工艺进行探讨。方法:先通过摇瓶培养方法,确定表达抑肽酶的毕赤酵母在BSM培养基中生长所需的最佳配方。在此基础上,采用分批补料培养方法,对毕赤酵母pSA/GS115进行高密度发酵。紫外吸收法测定重组抑肽酶竞争性抑制胰蛋白酶对底物BAEE的水解活性。结果:BSM培养基中毕赤酵母生长必需的最佳配方为甘油40 g.L-1、氨水单次补加量0.1%、甲醇流加量1%。经过毕赤酵母高密度发酵,发酵液上清中蛋白的表达量为37.08 mg.L-1,目的蛋白活性达到4 450 BAEEU.ml-1,比摇瓶培养表达提高了8倍。结论:本发酵工艺可实现酵母工程菌的高密度表达发酵,其发酵产物具有较高的生物活性,为下一步大规模化制备抑肽酶奠定了基础。     

rhKD/APPvar毕赤酵母分泌表达质粒的构建及其重组蛋白的表达和纯化

目的：构建高效分泌表达重组人淀粉样蛋白前体Kunitz型蛋白酶抑制剂结构域变异体（rhKD/APPvar）的毕氏酵母工程菌,建立适合大规模发酵、纯化rhKD/APPvar的工艺。方法：利用已构建的rhKD/APP表达质粒,在其活性中心两侧设计2个酶切位点（ApaⅠ和SacⅡ）,实现人KD/APP活性中心RAM与BPTI活性中心KAR的替换,构建rhKD/APPvar表达质粒。将重组质粒转化到酵母菌X-33中,优化rhKD/APPvar表达最佳pH值,使rhKD/APPvar获得高效表达。利用阳离子交换树脂和超滤除盐对重组蛋白进行纯化。结果：酶切鉴定和测序分析显示成功构建了KD/APPvar-pPICZαC重组质粒。经电转化成功地将重组质粒转化至酵母菌X-33中。SDS-PAGE分析,甲醇诱导表达后在相对分子质量约6 700处出现蛋白条带,pH 6.0、甲醇诱导 120 h蛋白表达水平最高,经纯化获得纯度达95%的重组蛋白。结论：成功构建KD/APPvar- pPICZαC重组质粒,经毕赤酵母表达和纯化获得了rhKD/APPvar蛋白。     

重组工程菌pET32a-CR1-SCR15-18/BL21(DE3)高密度发酵工艺研究

目的建立重组工程菌pET32a-CR1-SCR15-18/BL21(DE3)的高密度发酵工艺。方法以摇瓶发酵结果为基础,扩大至发酵罐发酵,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如发酵培养基、培养温度、pH值、活化时间、诱导时间及分批补加营养物质等条件进行优化。结果采用改良M9-CA培养基、37℃活化4 h后以0.2 mmol/L IPTG诱导表达4 h,以甘油为碳源,在生长期和诱导期分别以40 ml/h和70 ml/h的速率连续流加补料,全程滴加氨水保持培养基pH值保持在7.5,调节转速控制溶解氧在40%左右。最终菌体产量提高至40 g/L以上,CR1-SCR15-18蛋白表达率达28%以上。结论高密度发酵工艺显著提高了工程菌的产量和CR1-SCR15-18蛋白的表达水平。