两步多重聚合酶链反应对假肥大型肌营养障碍的基因诊断

作者应用分子生物学技术,用9组寡核苷酸引物分两步多重聚合酶链反应(mPCR扩增dystrophia基因的9对DNA序列。对19例Duchenne型肌营养不良(DMD)和2例Becker型肌营养不良(BMD)进行基国诊断。首先用缺失率较高的5对引物扩增,检出缺失者8例,再用4对引物扩增,检出缺夫者2例。这样,9 对引物多重PCR总缺失率占受检患者的47.2％,表明可检测出90％左右有基因缺失的患者。实验结果提示,两步多重PCR可用于DMD和(或)BMD的基因诊断。此法简便,快速又免除了使用同位素的困扰,不失为一种对DMD和(或)BMD快速诊断的好方法。     

基因缺失与DMD的关系研究及携带者筛查

目的:为了解国内Duchenne型肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)患者基因缺失的分布特点;探讨STR位点多态性对DMD基凶携带者的连锁分析.方法:根据DMD基因中外显子缺失的多发位点,在内标引物参照下,建立一个多重PCR体系对40例DMD患者进行多位点检测,同时用4个STR多态位点进行连锁分析.结果:40例患者中有32例为基因缺失.缺失率为80％.在本研究中,所选外显子45、48、51缺失率较高,分别占检出人数的56％、56％、16％.通过STR多态位点连锁分析检测出6名DMD患者母亲均为携带者.结论:本实验所选外显子对确定中国地区DMD患者的基因突变位点具有重要的临床参考价值,应用PCR-STR技术进行连锁分析可对DMD携带者进行筛查.     

产前基因检测杜氏肌营养不良

目的 产前基因检测杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)家系胎儿.方法 利用性别决定基因SRY引物PCR和羊水细胞培养染色体核型分析确定3例DMD家系胎儿性别,采用mPCR技术对3个DMD家系成员外周血及胎儿羊水和脐静脉血进行DMD基因内18个外显子位点扩增,STR-PCR结合聚丙稀酰胺凝胶技术对DMD基因3'端及基因内的44、45、49、50内含子的(CA)n短串联重复序列引物进行扩增,进行家系连锁分析和产前基因诊断.结果 共检出4例胎儿,其中2例单胎和1例双胎之甲胎为男性,之乙胎为女性.3个DMD家系2个检出为非缺失型,1个为缺失型.4例胎儿均继承了与同代先证者相同的母源致病单体型,除1例双胎之女胎为风险基因携带者外,其余3例男胎均为DMD风险胎儿,3例患儿母亲均为杂合型.结论 STR多态连锁分析不仅适用于常见缺失突变检测未发现缺失的DMD患者,同样适用于缺失型DMD患者的产前基因检测.     

假肥大型进行性肌营养不良患者的基因型、表型分析及随访研究

目的：总结假肥大型进行性肌营养不良(Duchenne/Becker muscular dystrophy, DMD∕BMD)患者的临床特征并进行基因诊断,分析基因型与表型的关系,以提高其诊疗水平。方法: 收集整理90例患者的临床资料,提取外周血基因组DNA,采用多重连接探针扩增 (multiplex ligation dependent probe amplification,MLPA)的方法进行抗肌萎缩蛋白基因DMD突变的检测,对未检测到缺失或重复的患儿扩增其肢带型肌营养不良2I型（limb girdle muscular dystrophy, LGMD2I）致病基因FKRP的外显子,然后进行DNA直接测序,并随访患者病情变化。结果:从临床确诊的90例DMD/BMD患者中检测出58例DMD基因外显子缺失（64.44%,58/90）,9例外显子重复(10.00%,9/90),检出突变的34例患儿的母亲中17例(50%,17/34)为缺失/重复的杂合性改变。对23例未检测到DMD基因重复或缺失的患儿进一步直接测序FKRP基因编码序列,未发现致病突变。对14例患儿按照国外文献方案进行小剂量泼尼松短期间歇治疗,随访发现短期内激素治疗未见明显疗效,因例数及疗程不够尚不能得出结论;其中1例患儿母亲再次怀孕后在北京大学第一医院行产前诊断,经MLPA检测羊水细胞,诊断胎儿为女性携带者。结论: 本组病例显示,DMD基因缺失突变主要发生在热点区45～54外显子之间,重复突变主要发生在基因的5′端。识别DMD∕BMD的临床特征及基因突变的类型有助于提高对该病的认识,判断预后。MLPA作为一种简便快速的诊断方法可对DMD∕BMD进行基因诊断,检出携带者,更好的进行遗传咨询。     

应用PCR技术检测假肥大型肌营养不良

目的应用PCR技术检测假肥大型肌营养不良(DMD/BMD)基因缺失和杂合子。方法根据DMD/BMD外显子缺失的多发位点,建立一个多重PCR体系,在不同的PCR条件下对23例DMD/BMD患者及其家系57名可疑女性携带者进行多重缺失的筛选、单链构象多态性(SSCP)/异源双链分析、连锁标记分析、限制性片段长度多态性(RFLPs)分析及微卫星分析。结果23例先证者中有14例为基因缺失,2例为基因重复,40例家系中女性亲属为杂合型。结论利用此PCR体系,可准确地检测出DMD/BMD的基因突变,可靠地筛选携带者并对其家系进行正确的分析。     

糖皮质激素对进行性肌营养不良的治疗机制

进行性肌营养不良(progressive muscular dystrophy,PMD)是一组原发性肌肉的遗传性病变,临床主要表现为进行性肌力减退和肌肉萎缩。临床上有很多分型,多见于Duch-enne型(Duchenne muscular dystrophy,DMD)及Becker型(Becker muscular dystrophy,BMD)两类,DMD是临床上最常     

应用PCR技术检测假肥大型肌营养不良

目的：应用PCR技术检测假肥大型肌营养不良（DMD／BMD）基因缺失和杂合子，方法：根据DMD／BMD外显子缺失的多发位点，建立一个多重PCR体系，在不同的PCR条件下对23例DMD／BMD的患者及其家系57名可疑女性携带者进行多重缺失的筛选，单链构象多态性（SSCP）／异源双链分析，连锁标记分析，限制性片段长度多态性（RFLPs)分析及微卫星分析。结果；23例先证者中有14例为基因缺失，2例为基因重复，40例家系中女性亲属为杂合剂，结论：利用此PCR体系，可准确地检测出DMD／BMD的基因突变，可靠地筛选携带者并 对其家系进行正确的分析。     

MLPA和多重PCR法检测假肥大性肌营养不良患者DMD基因

目的 应用多重连接依赖式探针扩增 (MLPA)和多重PCR法对临床诊断为假肥大性肌营养不良患者进行基因诊断,并比较两种方法检测DMD基因缺失和重复改变的效果。方法 选择2005年至2007年在中国医科大学盛京医院儿科就诊的51例DMD患者和8例BMD患者。采用MLPA法对经多重PCR法检测过的患者的DMD基因的缺失/重复突变进行突变筛查,同时对先证者的母亲进行基因的缺失/重复突变检测。结果 用多重PCR方法在59例假肥大性肌营养不良症患者中检测到31例患者有外显子缺失。MLPA检测出33例外显子缺失,6例外显子重复和1例点突变,同时检测出26例患儿的母亲为携带者。MLPA比多重PCR多检测出10例DMD基因突变,两种方法共同检测出的30例突变中MLPA 检测出16例基因突变范围比多重PCR大。结论 与多重PCR法相比,MLPA更加简便、快捷、可靠,同时可以对携带者进行诊断,是一种高效的遗传病基因诊断手段。 【关键词】假肥大性肌营养不良症;多重连接依赖式探针扩增;多重PCR;缺失/重复突变     

MLPA和多重PCR法检测假肥大性肌营养不良患者DMD基因突变

目的 应用多重连接依赖式探针扩增 (MLPA)和多重PCR法对临床诊断为假肥大性肌营养不良患者进行基因诊断,并比较两种方法检测DMD基因缺失和重复改变的效果。方法 选择2005年至2007年在中国医科大学盛京医院儿科就诊的51例DMD患者和8例BMD患者。采用MLPA法对经多重PCR法检测过的患者的DMD基因的缺失/重复突变进行突变筛查,同时对先证者的母亲进行基因的缺失/重复突变检测。结果 用多重PCR方法在59例假肥大性肌营养不良症患者中检测到31例患者有外显子缺失。MLPA检测出33例外显子缺失,6例外显子重复和1例点突变,同时检测出26例患儿的母亲为携带者。MLPA比多重PCR多检测出10例DMD基因突变,两种方法共同检测出的30例突变中MLPA 检测出16例基因突变范围比多重PCR大。结论 与多重PCR法相比,MLPA更加简便、快捷、可靠,同时可以对携带者进行诊断,是一种高效的遗传病基因诊断手段。 【关键词】假肥大性肌营养不良症;多重连接依赖式探针扩增;多重PCR;缺失/重复突变     

DMD／BMD基因诊断的新体系—Amp—FLP单体型连锁分析

应用同位素掺入的多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因内含子44、45、49、50中的CA重复序列,在聚丙烯酰胺凝胶电泳后放射自显影检测扩增产物。中国人在这4个位点均具有长度多态性:各位点等位片段数目分别为9、7、11、4,多态性信息含量(PIC)分别为0.872、0.772、0.870、0.710。应用这4个位点及先前报道的5‘CA及3‘CA进行了非缺失型DMD家系的单体型连锁分析及产前基因诊断,并用此方法检出了1例缺失。由此建立了以PCR为基础的DMD/BMD基因诊断新体系—Amp-FLP(扩增片段长度多态性连锁分析),此方法简便快速、灵敏高效,使缺失型与非缺失型DMD/BMD的基因诊断连贯性一次完成,有效地提高了DMD/BMD基因诊断的效率和成功率。     

多重PCR法检测东北地区Dystrophin基因缺失及其应用

目的：了解东北地区Dystrophin基因缺失分析特点及进行产前基因诊断。方法：用12对引物以多重PCR法检测98例DMD／BMD患：将高危男性胎儿行缺失检测。结果：缺失检出率为53％：22例高危胎儿中9例男性胎儿为缺失型，缺失位点与先证相同。结论：首次对东北地区筛查缺失发现Dystrophin基因缺失主要分布于两个热区内，外显子8附近区域可能是该地区缺失断裂高发区；多重PCR法为检测患及产前基因诊断提供了捷径，尤其对散发家系是可行的并且有其优越性。     

用银染Amp-FLP和多重PCR进行DMD和性连锁鱼鳞病的快速基因诊断

假性肥大型肌营养不良(Duchennemuscular dystrophy,DMD)是一种性连锁隐性遗传病,发病率约为出生男婴的1/3500,患者通常在20岁前死亡.DMD的病因是位于Xp21上编码dystrophin的基因发生突变。其突变方式中,基因缺失约占60%,其余为非缺失型。由于目前对DMD尚无有效的治疗方法,因而,通过产前基因诊断防止患儿出生具有重要意义。     

连接片段在Duchenne型肌营养不良症携带者检测中的应用

目的探讨连接片段在缺失型Duchenne 型肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）携带者检测中的应用价
值。方法对1个DMD家系和1例DMD散发病例进行研究。DMD家系中以确诊的患者Ⅲ2和待查携带者Ⅱ3为研究对象;散
发病例以患者Ⅱ1及其母亲Ⅰ2为研究对象。通过外显子检测确定家系中患者Ⅲ2第31~43外显子缺失,散发病例患者Ⅱ1第
45~54外显子缺失。然后以PCR步移法在相应内含子设计引物定位断裂点的位点,最后在尽量靠近断裂连接点处设计1对引物
直接对患者及其待查女性亲属进行连接片段的PCR扩增。结果对上述DMD家系中待查女性Ⅱ3的检测结果为PCR扩增出与
患者Ⅲ2一致的阳性片段,诊断其为DMD携带者。对散发病例患者母亲Ⅰ2的检测结果为PCR反应阴性,而对照的患者Ⅱ1扩
增出阳性结果,排除其母亲为DMD携带者。结论利用常规PCR技术直接检测缺失型DMD患者的女性亲属是否带有连接片
段,可以同样达到进行携带者检测的目的。该方法有别于目前DMD携带者检测中所使用的各种定量分析方法。
     

cDNA探针在Duchenne肌营养不良症基因诊断中的应用

Duchenne肌营养不良症(DMD)是男性最常见X-连锁致死性遗传病,新生男婴中的发生率为1/3500.DMD基因是已知基因中的最大者.长达2300kb,故该病基因诊断较困难.以往采用基因组克隆探针,结果缺失型DMD检出率较低.1987年Koeing等完成总长14kb的DMD cDNA全克隆.这一cDNA探针的应用大大提高了DMD缺失型的检测率.本文选择缺失热点区的cDNA片段1b-2a(1.0kb)、5b-7(2.5kb)和C8(0.9kb)为探针,应用限制性内切酶及Southern印迹杂交技术检测缺失型DMD.用1b     

二重二次PCR对外显子缺失型DMD患者单淋巴细胞遗传学诊断的研究

目的 对已知dystrophin基因50号外显子缺失的Duchenne型肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)患者及正常对照者进行单个淋巴细胞遗传学诊断,建立该病单细胞植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)方法,为携带者夫妇进行植入前遗传学诊断以提供细胞学基础.方法 在解剖显微镜下获取已经确诊为dystrophin基因50号外显子缺失型DMD患者和正常对照者的单个淋巴细胞,采用dystrophin基因50号外显子引物/SRY基因引物二重二次PCR的方法进行遗传学诊断.结果 男性患者单个淋巴细胞中SRY基因阳性同时50号外显子阴性的比例为92%;正常男性对照中SRY基因和50号外显子均阳性的比例为91%;正常女性对照中50号外显子阳性和SRY基因阴性的比例为93%.结论 通过二重二次PCR能够进行dystrophin基因50号外显子缺失型DMD患者和正常对照的单个淋巴细胞遗传学诊断,为PGD技术在该病遗传学诊断中的应用打下基础.     

应用10对引物多重PCR方法检测DMD基因缺失

目的 建立适合于Duchenne型进行性肌营养不良(DMD)临床基因诊断的10对引物多重PCR方法,并探讨其临床应用价值.方法 抽提55例DMD患者及正常对照者外周血DNA,选取肌营养不良蛋白基因的10对外显子引物,应用多重PCR反应方法,同时扩增10个特异性片段,扩增产物行聚丙烯酰胺凝胶电泳.结果 55例DMD患者中,28例(50.9%)存在外显子缺失.27例(49.1%)未检测到缺失;25例缺失片段集中于第45～53外显子,3例缺失片段集中于第12-19外显子.第50外显子缺失频率最高;其次为外显子45、47、51、52,再次之为外显子12、53.结论 DMD基因缺失片段主要分布于第45-53、12-19外显子2个缺失热点区域.该方法具有临床应用价值,是检测DMD基因缺失的首选方法.     

运用单细胞三重PCR对杜氏肌营养不良进行植入前遗传学诊断

目的:采用三重PCR技术检测缺失型杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy, DMD)基因部分外显子和性别鉴定位点amelogenin基因,探讨该技术对DMD家系中致病基因携带者进行植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis, PGD)的可行性.方法:显微操作取正常男性、正常女性和DMD基因8号、47号外显子缺失型DMD患者单个淋巴细胞及无DMD家族史夫妻行体外授精-胚胎移植(in vitro fertilization pre-embryo transfer,IVF-ET)术后废弃的单个卵裂球细胞,采用三重PCR技术扩增DMD基因8号、47号外显子和amelogenin基因.结果:64枚正常人单个淋巴细胞的DMD基因8号、47号外显子和amelogenin基因扩增阳性率分别为93.8%,93.8%和95.3%,假阳性率为2.8%;48枚8号外显子缺失型患者单个淋巴细胞的DMD基因47号外显子和amelogenin基因扩增阳性率均为95.8%,假阳性率为3.3%;48枚47号外显子缺失型患者单个淋巴细胞的DMD基因8号外显子和amelogenin基因扩增阳性率均为95.8%,假阳性率为0;40枚单卵裂球细胞DMD基因8号、47号外显子和amelogenin基因扩增阳性率分别为82.5%,80.0%和77.5%,假阳性率为0.结论:本研究所建立的单细胞三重PCR技术具有较高的扩增阳性率和特异性,有望在缺失型DMD家系中进行PGD的临床应用.     

Duchenne型肌营养不良特殊家系的调查

假性肥大型进行性肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy,简称DMD)为X连锁隐性遗传,男性患病,女     

应用分子标记对Duchenne型肌营养不良胎儿的产前基因诊断

目的:对未知遗传类型的Duchenne肌营养不良(DMD)家系早期妊娠风险胎儿进行产前基因诊断,确定能否接续妊娠,并探讨检测技术。方法:通过TRIzol方法从孕妇羊水中提取胎儿DNA,用Promega提血试剂盒提取家系其他成员外周血中的DNA。选取Xp21.1区附近的6对荧光引物对12个样本DNA进行PCR扩增和多态性连锁分析,以确定风险X染色体;通过DMD50和SRY2对引物的多重PCR扩增确定胎儿性别。连锁分析与性别鉴定相结合对胎儿进行产前诊断。结果:发现该胎儿为1正常女胎,未携带风险X染色体,且胎儿产后复查结果与产前检测一致。结论:这种方法提示对缺失或/和非缺失型DMD风险胎儿的检测可一步完成,而且扩大了基因的检测范围,诊断结果更为准确可靠。     

Duchenne型肌营养不良症患者32例基因缺失分析及产前诊断

目的:探讨Duchenne型肌营养不良症(DMD)基因缺失突变的类型,建立基因诊断技术平台.方法:应用寡核苷酸引物扩增DMD基因18个外显子区域,对27例家系32例DMD患者进行基因缺失分析,用4对二核苷酸重复序列多态引物对DMD家系进行扩增片段长度多态性连锁分析.并对10例先证者有DMD基因缺失的家系进行产前诊断.结果:27例DMD家系中19例(70.4%)有至少1个外显子缺失,且缺失热点区域集中在外显子12、13、45、47、48、49和50,所有携带者至少有1个或1个以上多态性位点为杂合态,缺失诊断结合多态分析进行诊断,10例男性胎儿中2例具有外显子缺失.结论:基因缺失诊断结合连锁分析可快速、准确地进行DMD的产前诊断.