Ⅰ型脊髓灰质炎野病毒实时荧光RT-PCR快速检测方法的评价

目的 评价和探讨Ⅰ型脊髓灰质炎(脊灰)野病毒快速检测策略.方法 采集671名来自脊灰野病毒流行疫区的在京学生粪便标本,采用一组实时荧光RT-PCR代替标准方法分别进行肠道病毒通用型检测、脊灰病毒分型检测、Ⅰ型脊灰疫苗株和野毒株鉴别检测.并利用Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型脊灰病毒标准株(Sabin株)和Ⅰ型野毒株对实时荧光RT-PCR和标准方法的灵敏度进行比较和评价.结果 (1)新脊灰病毒检测流程(肠道病毒通用型检测+脊灰病毒分型检测+脊灰野毒鉴别检测)检出非脊灰肠道病毒33例;脊灰病毒疫苗株16例,其中Ⅰ型5例、Ⅱ型1例、Ⅲ型3例、Ⅰ+Ⅱ型1例、Ⅰ+Ⅲ型4例、Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ型2例;脊灰病毒Ⅰ型野毒株3例.(2)3种实时荧光RT-PCR检测脊灰病毒比标准方法敏感1～ 100倍.其中肠道通用型检测和脊灰病毒分型检测2种方法对Ⅱ型脊灰病毒疫苗株的检测,比标准方法敏感100倍;脊灰病毒分型检测能准确区分Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型脊灰疫苗株,脊灰野毒株鉴别检测对Ⅰ型疫苗株的检测比标准方法敏感10倍;3种实时荧光RT-PCR均能有效检测出Ⅰ型脊灰野毒株,比标准方法敏感10倍.结论 新的脊灰病毒检测流程,可大幅缩短检测时间,提高检测通量,且灵敏度高于标准方法,适合于脊灰应急检测应对突发疫情.     

中国急性弛缓性麻痹病例中脊髓灰质炎病毒分离优势型别株的性状分析

中国自 1994年 10月以后 ,成功地阻断了脊髓灰质炎 (脊灰 )野病毒在自然环境中的传播 ,虽然云南、青海两省发现过由境外输入的脊灰野病毒病例或输入的脊灰野病毒引起的病例 ,但并未出现由此引发的第二代病例。与此同时 ,全国对每年 5 0 0 0多例急性弛缓性麻痹 (AFP)病例的病毒学监测发现 ,脊灰Ⅱ型疫苗病毒株的分离数逐年增加 ,1994年Ⅱ型株第一次超过了Ⅰ型或Ⅲ型株 ,1997年以来 (除 2 0 0 0年外 )Ⅱ型株多于Ⅰ型加Ⅲ型株之和。同时在病毒基因编码区VP1和 3D区的分析表明 ,中国Ⅱ型病毒株有接近半数均为在 3D基因编码区与不同型别的疫苗重组脊灰病毒 (VRPV)。VRPV ,特别是Ⅱ型VRPV ,除个别北方省份外 ,在全国大部分地区均有发现。序列分析表明 ,除在江苏、贵州、云南省发现过疫苗衍生脊灰病毒 (VDPV)外 ,大部分病毒在基因序列VP1段与脊灰疫苗参考株的差异率均 <1% ,表明VDPV虽然在中国有过局限性的循环 ,但并非优势型别株。占优势的是Ⅱ型VR PV ,这一类病毒是否能引起脊灰流行是共同关切的问题。该文就中国Ⅱ型VRPV的性状做了分析 ,并探讨了其发展趋势。     

Ⅰ型脊髓灰质炎野病毒实时荧光RT-PCR快速检测方法的评价

目的 评价和探讨Ⅰ型脊髓灰质炎(脊灰)野病毒快速检测策略.方法 采集671名来自脊灰野病毒流行疫区的在京学生粪便标本,采用一组实时荧光RT-PCR代替标准方法分别进行肠道病毒通用型检测、脊灰病毒分型检测、Ⅰ型脊灰疫苗株和野毒株鉴别检测.并利用Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型脊灰病毒标准株(Sabin株)和Ⅰ型野毒株对实时荧光RT-PCR和标准方法的灵敏度进行比较和评价.结果 (1)新脊灰病毒检测流程(肠道病毒通用型检测+脊灰病毒分型检测+脊灰野毒鉴别检测)检出非脊灰肠道病毒33例;脊灰病毒疫苗株16例,其中Ⅰ型5例、Ⅱ型1例、Ⅲ型3例、Ⅰ+Ⅱ型1例、Ⅰ+Ⅲ型4例、Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ型2例;脊灰病毒Ⅰ型野毒株3例.(2)3种实时荧光RT-PCR检测脊灰病毒比标准方法敏感1～ 100倍.其中肠道通用型检测和脊灰病毒分型检测2种方法对Ⅱ型脊灰病毒疫苗株的检测,比标准方法敏感100倍;脊灰病毒分型检测能准确区分Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型脊灰疫苗株,脊灰野毒株鉴别检测对Ⅰ型疫苗株的检测比标准方法敏感10倍;3种实时荧光RT-PCR均能有效检测出Ⅰ型脊灰野毒株,比标准方法敏感10倍.结论 新的脊灰病毒检测流程,可大幅缩短检测时间,提高检测通量,且灵敏度高于标准方法,适合于脊灰应急检测应对突发疫情.     

青海省2000～2009年急性驰缓性麻痹病例与健康人群病原学监测

[目的]分析开展急性驰缓性麻痹(AFP)病例、健康人群粪便标本病原学监测结果,为保持无脊灰状态提供实验室依据。[方法]病毒分离及鉴定,脊灰病毒株型内鉴别,确定疫苗株或野病毒株。[结果]青海省2000～2009年AFP病例、健康人群粪便标本1613份,分离出脊髓灰质炎病毒22株,分离率为1.36%,其中脊灰I型疫苗株3株,脊灰II型疫苗株2株,脊灰III型疫苗株9株,脊灰混合型疫苗株8株,无脊灰野病毒株。分离到非脊灰肠道病毒(NPEV)187株,分离率为11.59%。[结论]该省2000～2009年无本地脊灰野毒株病例流行,阻断了脊灰本地野病毒的传播,保持了无脊灰状态。     

2016年河南省急性弛缓性麻痹病例中脊髓灰质炎病毒监测结果分析

目的鉴定分析河南省15岁以下儿童疑似急性弛缓性麻痹(acute flaccid paralysis,AFP)病例中实验室确诊感染脊髓灰质炎(脊灰)病毒(Poliovirus,PV)的型别,为河南省制定更完善的脊灰防控策略及维持"无脊灰野病毒状态"提供科学依据。方法依据《WHO脊髓灰质炎实验室手册第4版》操作规程,使用RD和L20B两种细胞对河南省2016年AFP标本进行病毒分离,采用荧光定量PCR法及逆转录PCR法进行病毒序列鉴定和分析。结果共检测453例疑似AFP病例,其中有7例(1.55%)病例分离出10株脊灰病毒,其中Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅰ+Ⅲ型分别为5株,3株和2株。分离到脊灰毒株与Sabin株相比,核苷酸VP1区发生0、1、2、4和6个变异的数量分别为3、1、3、2和1株。结论 2016年河南省分离出脊灰病毒均为脊灰疫苗株,毒株型别以Ⅰ型为主,VP1区核苷酸以低变异为主,未发现疫苗衍生脊灰病毒(Vaccine-derived poliovirus,VDPV)及脊灰野病毒(Wild poliovirus,WPV)。     

青海省发现脊髓灰质炎Ⅰ型野病毒的意义

在全国已经连续 5年多未发现脊髓灰质炎 (脊灰 )本土野病毒病例以后 ,1999年 10月在青海省卫生防疫站送检的脊灰毒株中 ,经中国预防医学科学院国家脊灰实验室检定 ,发现了脊灰Ⅰ型野病毒。病毒分子生物学鉴定结果证明 ,该毒株不同于我国1994年以前流行的野病毒 ,也不同于青海省以往(1993年 )流行的野病毒。资料证实 ,此株野病毒的发现 ,并非是由于 1994年以来我国监测系统不敏感 ,以致对境内循环的病毒漏检所致。众所周知 ,自1994年以来 ,我国每年约报告 50 0 0例急性弛缓性麻痹 (ＡＦＰ)病例 ,每年约有 1万份以上的ＡＦＰ病例粪便标本进行…     

江西省脊髓灰质炎病毒的型内分析

目的：建立快速准确的方法鉴别脊灰病毒的疫苗株、野毒株和变异株。方法：RT—PCR—RFLP法进行脊灰型内鉴别。结果：216例AFP病例粪便标本，经鉴定为：脊灰Ⅰ型3株，Ⅱ型12株，Ⅲ型7株，均为疫苗相关株，未发现脊灰野毒株和变异株或衍生株。结论：在省级脊灰实验室建立脊灰型内鉴别方法，不仅可以提高脊灰野病毒和变异株或衍生株的检测速度，更有利于维护无脊灰状态，为该疾病预防控制提供重要的科学依据。     

广东省1985～1993年脊髓灰质炎流行野毒株的基因分析

广东省是脊髓灰质炎（脊灰）高发区，１９８５～１９９３年各年都有流行，历年流行的脊灰野毒株均为Ｉ型病毒。在历年来分离的流行病毒株中，选择不同时期的Ｉ型脊灰病毒２２株做ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析，发现广东省脊灰Ｉ型流行株共有９种电泳图谱类型，显示了在基因水平上的多样性。根据ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析结果又选择了其中９株代表株，对其ＶＰ１编码区３００个核苷酸进行序列分析，结果显示各年的流行株间序列有差异。此结果表明，广东省脊灰流行与多种基因型脊灰病毒的存在有关，但口服脊灰疫苗（ＯＰＶ）形成的免疫屏障可阻断脊灰野病毒的传播。     

江西省2000年～2006年急性迟缓性麻痹病例病原学结果分析

目的：通过对江西省2000年～2006年急性迟缓性麻痹病例的病原学监测，为证实江西省消灭脊髓灰质炎提供准确的、可靠的科学依据。方法：按照WHO扩大免疫规划和传染性疾病部《脊髓灰质炎病毒经验手册》推荐的方法进行病毒的分离与鉴定。脊髓灰质炎病毒阳性标本送国家脊髓灰质炎实验室用FIT—PCR—RFLP法和ELISA法进行型内鉴定。结果：1312例AFP病例粪便标本，经病毒的分离与鉴定为：脊灰病毒110株，其中脊灰I型13株，Ⅱ型44株，Ⅲ型28株，PV混合15株，P＋E混合10株。除Ⅱ型均为疫苗相关株外，I型1株有3个核苷酸序列变异，Ⅲ型有7株有1～6个核苷酸序列变异，未发现脊灰野毒株和疫苗衍生脊灰病毒（VDPV）。分离非脊灰肠道病毒193株。结论：江西省2000年-2006年急性迟缓性麻痹病例中未发现脊灰野病毒存在，且实验室的各项监测指标都达到控制标准，从而证实江西省消灭了脊灰野病毒。2006年脊灰Ⅲ型的核苷酸变异，提示我们要警惕疫苗变异循环的发生，一定要提高脊灰疫苗免疫覆盖率，预防VDPV。     

采用PCR-RFLP法对脊髓灰质炎病毒分子特征的初步研究

[目的]对急性驰缓性麻痹病例粪便标本分离的脊髓灰质炎病毒进行型内鉴定。[方法]采用PCR—RFLP技术,对分离毒株进行鉴定。[结果]1999—2002年福建省脊灰分离株在3D区有5株Ⅱ型病毒发生重组或变异,表现为Ⅲ型;在VP1区有3株发生变异,不同于经典Ⅱ型病毒,未发现脊灰野病毒。[结论]PCR—RFLP技术能快速确认脊灰毒株的基因特征,初步区分脊灰病毒是否为野病毒或发生重组变异．及时为采取相应防治策略提供支持。     

1996年输入病例Ⅲ型脊髓灰质炎野毒的分子病毒学检测

１９９６年３月和４月，我国云南省边境德宏傣族景颇族自治州人民医院收治了２名在缅甸勐古镇发病，来我国求治的急性弛缓性麻痹儿童。云南省卫生防疫站分别从２名病儿的粪便标本中分离到Ⅲ型脊髓灰质炎（脊灰）病毒；国家脊灰实验室经用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法检测，定为脊灰Ⅲ型野毒株，又经核酸序列测定，与ＳａｂｉｎⅢ型疫苗株有明显差异，但又有别于我国１９９５年新疆分离的Ⅲ型脊灰野毒株的序列。初步判定该２株脊灰Ⅲ型野毒株不属于中国本土的野毒株。     

脊髓灰质炎疫苗重组株病毒在我国的循环及其致病性

我国自1994年10月以后已无脊髓灰质炎(脊灰)本土野病毒引起的病例.现在从急性弛缓性麻痹病例粪便标本中分离到的脊灰病毒都是3个血清型的疫苗衍生株,并以Ⅱ型为主.近几年每年Ⅱ型分离株的数量均多于同年I型株加Ⅲ型株之和.1997～1999年从贵州、云南省分离到的Ⅱ型疫苗株中,除了疫苗变异株外,还发现了不同血清型间的重组株,如VP1片段来自SabinⅡ,而3D片段分别来自SabinⅢ(S2×S3)和SabinI(S2×S1),它们的基因序列与脊灰疫苗株SabinⅡ型有差异.能从未服苗儿童的粪便标本中分离到这类毒株,表明在外环境中有这类毒株在循环.这些毒株可以致病,其致病性与该儿童是否接受了疫苗全程免疫有很大的相关性.重组株的发现提示我们,它们在自然环境中已有循环.从贵州省Ⅱ型病例发生时间和区域上看,病例有聚集分布的趋势,但目前尚处于小范围的循环中,其原因与对策有待进一步研究.     

广西壮族自治区1990～1995年急性弛缓性麻痹病例病原学监测分析

１９９０～１９９５年广西壮族自治区报告急性弛缓性麻痹（ＡＦＰ）病例１１８９例，采集粪便标本９９４例，分离出病毒２２４株，阳性率２２．５４％。其中脊髓灰质炎（脊灰）病毒１５３株，分离率１５．３９％；非脊灰肠道病毒（ＮＰＥＶ）７１株，分离率７．１４％。１５３株脊灰病毒中，Ⅰ型８８株（５７．５２％），Ⅱ型４３株（２８．１０％），Ⅲ型１４株（９．１５％），混合型８株（５．２３％）。经国家脊灰实验室鉴定：１９９９０～ｌ９９２年分离到１７株Ⅰ型野毒株，ｌ株Ⅰ＋Ⅱ型野毒株；ｌ９９３～ｌ９９５年分离３１株脊灰病毒均为疫苗株。结果表明Ⅰ型是我区主要的流行毒株。     

四川省两株脊髓灰质炎Ⅰ型野病毒的核酸序列分析

目的：探讨脊髓灰质炎（脊灰）流行与野毒株性状的关系。方法：选择了1991年安岳县和1992年会东县各一例临床诊断为脊灰的患者，从其粪便标本中各分离出一株病毒，用微量中和试验进行血清学鉴定，PCR－RFLP法进行型内鉴定，对VP1区300个核苷酸进行测序，结果：血清学定型均为脊灰I型病毒，经PCR－RFLP法检测，判为野病毒，核酸序列分析证实两株病毒与Sabin I有明显差异为野病毒，两毒株间核酸序列不完全一致。有20个核苷酸的差异，结论：不同年份，不同地方流行株间的序列有差异，四川省脊灰流行与毒株间核酸序列的差异有关，但我国现行疫苗OPV能有效预防我省脊灰，基础免疫和强化免疫是预防和消灭脊灰的有力武器。     

1985～1992年广东省脊髓灰质炎病原流行病学研究

应用单克隆抗体对广东省１９８５～１９９２年脊髓灰质炎（下称脊灰）流行区的急性迟缓性麻痹（ＡＦＰ）病例粪便标本中分离出的２５４株脊灰病毒作病原分析．结果Ⅱ、Ⅲ型均未发现野毒株，而Ⅰ型２０５株中有１１９株为野毒株，７１株的抗原排列具野毒株和疫苗株的双重抗原位点，且有逐年增加的趋势，表明此期间广东的脊灰流行株主要为Ⅰ型。抽取具双重抗原位点毒株中的２株同时用Ⅰ型野毒株及ＳａｂｉｎⅠ疫苗株的特异ＰＣＲ检测，并进行核甘酸测序，发现其基因组在３２６２／３２６３处重组，证实为后二者的重组株，此２例患者均有服苗史，早期检测有高滴度抗体，提示其可能成为消灭脊灰不可忽视的障碍。     

重庆市2008-2011年急性驰缓性麻痹病例监测结果

目的 评价重庆市2008-2011年急性驰缓性麻痹(AFP)病例监测运转情况.方法 按照《脊灰病毒检验手册》操作规程进行病毒分离与鉴定,由国家脊灰实验室用PCR-RFLP法和ELISA法对分离到的脊灰病毒株进行型内鉴定.结果 从307例AFP病例粪便标本中分离到脊灰病毒(PV)10株,分离率为3.26％,其中脊灰Ⅱ型5株,Ⅲ型3株,PV混合2株,Ⅱ型为我市的主要型别占50.00％,其次是Ⅲ型、PV混合型分别占30.00％、20.00％.所有PV经国家脊灰实验室进行型内鉴定,有9株为疫苗相关株,另外有1株Ⅱ型有6个核苷酸序列变异,鉴定为疫苗高变异株.分离非脊灰肠道病毒(NPEV) 26株,分离率为8.47％.结论重庆市2008-2011年急性驰缓性麻痹病例中未发现脊灰野病毒,维持了无脊灰状态.在实现无脊灰目标后,仍应加强AFP病例的病毒学监测工作,以确保最终实现全球消灭脊灰的目标.     

山东省急性弛缓性麻痹病例疫苗变异脊髓灰质炎病毒的分子生物学性状分析

目的对山东省1997~2004年急性弛缓性麻痹(AFP)病例中疫苗变异脊髓灰质炎(脊灰)病毒的分子生物学性状进行分析,以提高对疫苗衍生脊灰病毒(VDPV)的认识,从而增加AFP病例监测系统检出VDPV的灵敏度。方法分离的脊灰病毒血清定型采用中和试验的方法,型内鉴定采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性分析(PCR-RFLP)两种方法,疫苗变异脊灰病毒分子生物学性状分析采用VP1区序列测定的方法。结果山东省1997~2004年未分离到脊灰野病毒,分离到的脊灰疫苗病毒以Ⅱ型为主(173株),接近Ⅰ型和Ⅲ型之和。其中疫苗变异脊灰病毒10株,仍以Ⅱ型为主(8株),且有1株(CHN1025)VP1区变异率达到1%,为VDPV,但该毒株无2代病例发生。结论在山东省连续多年的口服脊灰疫苗免疫已经阻断了脊灰野病毒在人群中的传播,但从AFP病例中曾分离到1株VDPV,结合流行病学分析发现,局部地区仍存在免疫空白,因此存在着VDPV以及发生循环的VDPV潜在的可能,应引起相关部门的关注。     

山西省2007年Ⅰ型疫苗衍生脊髓灰质炎病毒的鉴定和基因特性分析

目的描述山西省2007年Ⅰ型疫苗衍生脊髓灰质炎（脊灰）病毒（Vaccine-derived Poliovirus,VDPV）的基因特征,分析该VDPV的来源及对当地维持无脊灰的影响。方法对山西省2007年1例急性弛缓性麻痹（Acute Flaccid Paralysis,AFP）病例采集的双份粪便标本进行病毒分离,并对分离到的脊灰病毒（CHN11061株）进行VP1编码区基因核苷酸序列测定和分析,然后与国内外报道的其它Ⅰ型VDPV构建亲缘进化树。结果从该AFP病例的双份粪便标本中分离到2株Ⅰ＋Ⅱ＋Ⅲ混合型脊灰病毒,其中Ⅰ型毒株的VP1编码区基因核苷酸序列与PⅠ/赛宾（Sabin）疫苗株相比变异率≥1.0%,根据世界卫生组织（WHO）的标准鉴定为Ⅰ型VDPV。VP1编码区基因进化树图表明,山西省2007年Ⅰ型VDPV与国内外至今发现的其它VDPV进化距离较远,是新发现的VDPV,不属于循环着的（Circulating）VDPV（cVDPVs）,同时无证据证明患儿为免疫缺陷患者,因此将这2株VDPV归类为Ⅰ型未分类的（Ambiguous）VDPV（aVDPV）。结论结合山西省2007年Ⅰ型VDPV的基因特征和当地口服脊灰减毒活疫苗（Oral Poliomylitis Attenuated Live Vaccine,OPV）免疫覆盖率情况,推测在当地存在1例免疫缺陷患者,由他/她长期携带并向外排泄变异的脊灰病毒,引起了山西省2007年VDPV感染事件。在脊灰消灭后期,应加强对可能存在的长期排毒者的发现和管理。     

青海省1996～1999年脊髓灰质炎病毒学监测

目的：掌握消灭脊灰工作进展情况和不同人群中脊灰野病毒和消亡状态，为制定有效免疫策略提供依据。方法：在1996－1999年所有AFP病例和AFP病例密切接触，重点地区5岁以下健康儿童中，采集粪便标本776份检测脊灰病毒，应用2种以上敏感传代细胞培养，用基因序列分析方法判断病毒型别。结果：共检测脊灰病毒24株，非脊灰肠道病毒81株，分离率分别为3．09％与13．53％，经国家脊灰实验室和美国CDC最终鉴定：脊灰野病毒Ⅰ型2株，与印度1998年Ⅰ型野病毒符合率＞98％，判定由印度传入野病毒，其它脊灰病毒均为疫苗病毒。结论：1994年以来全省无本土脊灰野病毒流行，各项监测指标达到和接近国家要求，主实我省已阻断本土脊灰野病毒传播，达到无脊灰标准。传入野病毒的及时发现，反映出AFP病例监测系统敏感性和及时性较高，但该病例的发生提示局部地区存在着脊灰疫苗免疫空白或低接种率水平。     

急性驰缓性麻痹病例的监测及注意事项

10年来 ,我国通过提高基础免疫接种率、开展强化免疫和加强监测工作使得脊髓灰质炎 (简称脊灰 )发病率明显下降 ,自1994年以来未发现本土野毒株脊灰病例。 2 0 0 0年 10月 2 9日(WHO)西太平洋区 (日本京都会议 )正式宣布包括中国在内的(WHO)西太平洋区所有国家和地区无本土脊灰野病毒传播。但是脊灰野病毒在我国部分周边国家仍然存在 ,1995、1999年我国曾发现输入脊灰野病毒病例。另外 ,近年来国内外有从AFP病例中分离到脊灰疫苗衍生株。因此 ,要维持无脊灰状态 ,在落实常规免疫工作的基础上进一步加强急性弛缓性麻痹(AFP)病例监测至关…