牵张刺激诱导心肌细胞NF—κB激活及其机制研究

目的：探讨牵张刺激对心肌细胞NF－κB的激活作用及激活机制。材料与方法：在硅橡胶膜上培养心肌细胞,在无NAC和有NAC的条件下对细胞施加牵张刺激,用免疫组织化学方法观测NF－κB的激活情况。结果：牵张心肌细胞5小时后,NF－κB被显著激活;15mM N-乙酰半胱氨酸（NAC）阻断牵张诱导的NF－κB的激活。结论：牵张刺激能够诱导心肌细胞NF－κB的激活,活性氧介导了这种激活作用。     

核因子κB在妊高征患者胎盘组织的定位及定量研究

目的探讨核因子κB(NF-κB)在妊高征患者胎盘血管平滑肌及内皮细胞中表达的变化及其在妊高征发病过程中的作用.方法 HE染色后镜下观察胎盘组织及血管的病理变化,免疫组织化学方法及Western blot检测妊高征患者胎盘组织I-κB、NF- κB的表达.结果 HE染色显示妊高征胎盘绒毛血管变细、数目减少、血管合体膜增厚、胎盘细小血管平滑肌细胞增生、纤维素样坏死明显多于正常妊娠;免疫组织化学显示妊高征患者胎盘血管平滑肌细胞及内皮细胞NF-κB胞浆、胞核染色较正常妊娠明显增强;Western bl ot显示妊高征患者胎盘组织胞浆、胞核NF-κB含量、胞核/总NF-κB含量比值明显高于正常妊娠;妊高征患者胎盘组织胞浆I-κB含量明显低于正常妊娠.结论 NF-κB的激活及增加可能为妊高征发病机制的重要信息途径之一.     

肿瘤坏死因子-α激活大鼠心肌细胞核转录因子-κB活性

目的 探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对大鼠心肌细胞(H9C2)核转录因子-κB(NF-κB)活性的影响.方法 体外培养大鼠心肌细胞(H9C2),以TNF-α刺激,凝胶迁移滞后实验(EMSA)检测NF-κB活性,Westen blot及Alamarblue法分别检测P65蛋白与细胞增殖.结果 TNF-α刺激后NF-κB活性明显增高,且TNF-α对细胞生长有抑制作用.结论 TNF-α对大鼠心肌细胞(H9C2)的调节作用,部分是通过激活NF-κB信号通路实现的.     

NBD多肽预处理对局灶脑缺血再灌注大鼠脑内核因子-κB核转位活化的影响

目的探讨NBD多肽预处理对局灶脑缺血再灌注大鼠大脑缺血皮质细胞内核因子-κB活化的影响。方法将SD健康雄性大鼠（280～300g）共36只随机分为假手术组（n=6）、模型组（n=15）、药物组（n=15）。缺血模型制备前2h经右侧侧脑室注射NBD多肽25μl进行预处理。运用改良线栓法制备右侧大脑中动脉闭塞再灌注大鼠模型。运用免疫组化检测再灌注后72hNF-κBp65在胞浆／胞核的蛋白表达变化;运用免疫荧光定位及Western印迹（半定量）检测NF-κB p65及IκBα的蛋白表达情况。结果免疫组化结果显示与假手术组比较,再灌注72h模型组胞浆／胞核内NF-κB p65大量表达（P〈0．05）;NBD多肽预处理后NF-κB p65主要在胞浆表达,胞核内表达明显减少（P〈0．05）;免疫荧光双标定位及Western印迹半定量检测显示模型组胞浆／胞核内NF-κB p65蛋白均大量表达（P〈0．05）,IκBα蛋白呈现低表达（P〈0．05）;NBD多肽预处理后胞核内NF-κB p65蛋白表达明显减少,主要以胞浆表达为主（P〈0．05）,IκBα胞浆／胞核内表达显著增加（P〈0．05）。结论局灶脑缺血再灌注72hNF-κB p65蛋白胞核表达明显增加．NF-κB核转位／活化过程被激活：NBD多肽预处理后通过增加胞核／胞浆内IκBα表达有效阻止NF-κB的核转位／活化过程,从而有效地减轻再灌注后72h局灶脑缺血再灌注对脑组织的损害。     

NF-κB信号通路基本元件调节机制的研究进展

核因子-kappaB（NF-κB）信号通路广泛参与调节免疫反应、炎症反应、细胞分化与凋亡、肿瘤形成等多种生物学功能。在非激活细胞中,NF-κB转录因子通常与其抑制物结合形成复合物,并在胞浆与胞核间达到平衡,但这种复合物主要存在于胞浆中。当受到胞外信号刺激后,复合物可以在NF—κB信号通路的多个信号转导途径中发生降解,使得抑制物从复合物中解离,释放出的大量活性NF—κB迅速转移入核,从而调控相应靶基因的表达。目前发现的和NF—κB的调节紊乱有关的疾病谱在不断扩大,这也使得对于NF—κB信号通路功能和调节的研究得到了深入发展,对通路中一些基本元件的调节也有了较为充分的了解。     

呼吸道合胞病毒激活靶细胞NF-κB的机制及途径研究进展

NF-κB是一个重要的转录调节因子,调控许多生物活性介质基因的转录和表达.静息时,NF-κB与IκB结合以非活性异寡聚体的形式存在于胞浆中,胞外刺激通过不同的信号转导途径激活NF-κB.本文主要介绍了呼吸道合胞病毒作用于靶细胞通过蛋白激酶C、磷脂酰肌醇激酶3、丝裂原活化蛋白激酶及蛋白磷酸酶2A等介导的信号级联反应活化NF-κB的机制及途径的研究进展.     

脂多糖诱导大鼠心肌细胞NF-κB、IκB-α的表达及意义

目的研究脂多糖(LPS)诱导大鼠心肌细胞NF-κB,IκB-α的表达及意义。方法100ng/mlLPS刺激心肌细胞0、0.5、1、2、4、6、8h和0、10、50、100ng/mlLPS刺激1h,免疫细胞化学检测NF-κBp65的表达,Westernblot检测IκB-α表达。结果LPS的刺激迅速激活心肌细胞NF-κBp65的表达,于1h时达高峰;IκB-α的表达先降低,后升高。结论LPS可诱导大鼠心肌细胞NF-κB的激活,并通过激活心肌细胞核因子-κB途径从而促进细胞损伤。     

Fractalkine对类风湿关节炎患者成纤维样滑膜细胞中NF-κB活化及内源性fractalkine mRNA表达的影响

目的:观察Fractalkine(FKN)对类风湿关节炎(RA)患者成纤维样滑膜细胞(FLS)核转录因子κB (NF-κB)活化以及内源性FKN mRNA表达的影响.方法:通过组织块法培养RA-FLS.在RA-FLS中加入100 μg/L FKN,分别作用0 h、1 h及2 h,用Western blotting检测RA-FLS胞浆及胞核中NF-κB p65蛋白表达量变化以明确NF-κB的活化情况;加入100 μg/L重组人FKN分别作用0 h、12 h、18 h后,用RT-PCR检测FKN mRNA表达的变化.结果:重组人FKN刺激1 h后,RA-FLS胞浆中NF-κB p65蛋白水平明显低于无FKN刺激的对照组(P<0.05);FKN刺激后2 h,细胞核中NF-κB p65蛋白水平较对照组明显升高(P<0.05).100 μg/L重组人FKN刺激RA-FLS,呈时间依赖方式诱导内源性FKN mRNA表达.FKN刺激RA-FLS18 h,细胞中FKN mRNA的表达水平明显升高(P<0.05).结论:外源FKN可刺激RA-FLS内源性的FKN mRNA表达上升,提示RA-FLS中可能存在FKN的正反馈现象.FKN对NF-κB有活化作用,可能对RA患者关节中炎症的启动、血管生成和骨质破坏有重要作用.     

血管紧张素Ⅱ刺激血管平滑肌细胞表达TSLP及信号通路研究

目的:观察血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)是否可以刺激血管平滑肌细胞(VSMC)表达胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP),探讨核因子-κB(NF-κB)信号途径在这一过程中的作用.方法:原代培养VSMC,分别用Ang Ⅱ及Ang Ⅱ联合 NF-κB 特异性抑制剂PDTC干预.采用免疫组织化学染色检测胞浆中TSLP的表达,用ELISA法检测细胞培养上清液中TSLP的浓度,用电泳迁移率实验(EMSA)检测 NF-κB的结合活性.结果:正常未经处理的VSMC几乎不表达TSLP,经Ang Ⅱ刺激后胞浆及上清中的TSLP明显增加,并有浓度和时间依赖性,经PDTC预处理后TSLP表达量明显减少.相同条件下Ang Ⅱ可激活VSMC的NF-κB信号通路,PDTC可抑制这一过程.结论:Ang Ⅱ能够刺激血管平滑肌细胞表达TSLP,其作用机制可能是上调了NF-κB的结合活性.     

血管紧张素Ⅱ对人内皮细胞转录因子NF-κB的激活机制及其对血小板源生长因子B链基因转录的影响

目的研究血管紧张素Ⅱ对ECV304细胞中转录因子NF-κB的作用和对血小板源生长因子B链(PDGF-B)基因表达的影响.方法采用电泳迁移率移动分析法(EMSA),免疫组织化学方法,共聚焦显微镜及金颗粒标记免疫电镜技术;荧光素酶报告基因与变异型激酶质粒共转染的方法及Northern印迹法研究血管紧张素Ⅱ激活ECV304细胞NF-κB的信号传递路径和检测了血管紧张素Ⅱ刺激前后ECV304细胞PDGF-BmRNA的表达水平.结果血管紧张素Ⅱ刺激后,在ECV304细胞内有NF-κB的激活及核易位过程,应用免疫荧光共聚焦显微镜,免疫电镜及Northern印迹等方法均可观察到PDGF-B或其基因表达增高.变异型激酶质粒IKKα-KM,IKKβ-KM及NIK-Km可抑制经血管紧张素Ⅱ刺激的转染细胞内与NF-κB启动相连的荧光素酶的表达.结论血管紧张素Ⅱ可激活胞质内NF-κB并出现核易位,激酶NIK、IKKα和IKKβ参与了此信号传递路径.血管紧张素Ⅱ刺激后PDGF-B链mRNA水平增高.     

HSP72过度表达对脂多糖刺激的巨噬细胞中NF-κB活性的影响

目的研究过度表达的热休克蛋白72(heat shock protein,HSP72)对脂多糖(lipopolysaccha-ride,LPS)刺激的巨噬细胞中NF-κB活性的影响.方法构建pCD-hsp72重组质粒,转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,G418筛选稳定转染hsp72基因的细胞,Western印迹检测转染细胞HSP72的表达水平及LPS刺激后RAW264.7细胞内HSP72的表达水平、LPS刺激后转染细胞中IκBα的含量和胞核中NF-κB的含量的变化.结果构建pCD-hsp72重组质粒并转入巨噬细胞,获得稳定转染hsp72基因的细胞株,LPS刺激细胞内HSP72表达增加;HSP72可通过减少LPS刺激的巨噬细胞中IκBα的降解而抑制NF-κB活性.结论HSP72能抑制LPS激活的巨噬细胞中NF-κB的活化.     

MRP8通过TLR4/NF-κB信号途径刺激培养星形胶质细胞分泌IL-1β

目的:探讨MRP8刺激星形胶质细胞(astrocyte,AS)释放IL-1β的信号途径。方法:利用MRP8刺激培养AS,运用Lipo2000脂质体转染发卡样小干扰RNA(shRNA)使TLR4沉默、二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)预处理阻断NF-κB,运用免疫印迹(Western Blot)、电泳迁移率变动分析(EMSA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接荧光免疫双标法等实验方法检测TLR4、NF-κB以及IL-1β的表达变化及相互作用关系。结果:利用MRP8刺激培养AS,细胞内的TLR4、NF-κB以及IL-1β表达增加,并且NF-κB由胞浆向胞核内转移,IL-1β在细胞上清液中含量增加;抑制TLR4可以下调MRP8所致的NF-κB和IL-1β表达增加,NF-κB向胞核内转移;抑制NF-κB只能下调MRP8所致的IL-1β表达增加。结论:MRP8可能通过TLR4/NF-κB信号途径促进刺激星形胶质细胞分泌IL-1β。     

抗氧化剂PDTC抑制氧化的低密度脂蛋白诱导的人肾小球系膜细胞NF-κB活化

目的研究氧化的低密度脂蛋白(Ox-LDL)对体外培养的人肾小球系膜细胞(HMC)核因子-κB(NF-κB)活化的影响,以及抗氧化剂吡咯二硫氨基甲酸酯(PDTC)对NF-κB活化的抑制作用,探讨Ox-LDL介导肾损害的基因调控机制及抗氧化剂PDTC防治脂质肾损害的可能性.方法将Ox-LDL或PDTC与HMC共培养后,提取细胞核蛋白进行凝胶迁移率变动分析(EMSA)检测NF-κB的活化,用细胞ELISA法检测细胞内IκBα蛋白含量的变化,反映IκBα的降解及免疫组化染色检测细胞内的P65向核转位.结果正常对照组未见NF-κB活化,当用不同浓度(10、25、50及100mg/L)的Ox-LDL,刺激肾小球系膜细胞1h后,均可引起细胞NF-κB活化及IκBα降解.与对照组相比较差异显著(p<0.05),以50 mg/L的Ox-LDL刺激HMC1h,NF-κB活化及IκBα降解最明显.NF-κB活化的同时,伴有P65由胞浆向胞核的转位.100μmol/LPDTC,能明显抑制NF-κB的活化、IκBα降解(p<0.01)及P65的核转位.结论 Ox-LDL能诱导HMC的IκBα降解、P65的核转位,最终使NF-κB活化.提示NF-κB参与了脂质肾损害的发病过程,抗氧化剂PDTC能抑制NF-κB活化.     

LPS通过p38MAPK-CBP诱导巨噬细胞RAW264.7表达和释放HMGB1

 目的 检测LPS刺激后小鼠腹腔巨噬细胞HMGB1和相关信号分子p38MAPK、NF-κB、CBP的表达,探讨脓毒症时巨噬细胞表达和释放HMGB1的信号传导机制。 方法 采用LPS刺激RAW264.7细胞,在不同的时间点用免疫细胞化学、激光共聚焦显微镜观察细胞内相关信号分子p38MAPK、NF-κB、CBP的变化,ELISA检测培养上清HMGB1的含量,Real-time PCR检测培养细胞HMGB1的mRNA水平,Western blot检测胞浆和胞核内HMGB1的含量。 结果 随着LPS的刺激,细胞浆内p38MAPK的绿色荧光逐渐增强,NF-κB的绿色荧逐渐减弱,而细胞核内NF-κB绿色荧光逐渐增强,CBP的绿色荧光逐渐增强,三者均于刺激后6 h达高峰。LPS刺激后12-48 h培养细胞胞浆和上清中HMGB1蛋白含量逐渐增加,而12-24 h胞核内HMGB1含量逐渐减少,36 h后又逐渐增多,各不同时间点差异具有显著性(P<0.01);而细胞内HMGB1 mRNA表达在LPS刺激后0-12 h无明显变化, 24 h、36 h和48 h明显增高,与0h相比差异有显著性(P<0.01)。 结论 LPS通过依次激活巨噬细胞内信号分子p38MAPK、NF-κB及CBP来诱导HMGB1的合成、转位和释放表达的。     

双歧杆菌对大鼠腹腔巨噬细胞NF-κB和IκB的影响

目的：探讨双歧杆菌对大鼠腹腔巨噬细胞核转录因子 NF-κB和IκB调控。 方法： 收集大鼠腹腔巨噬细胞，实验分为正常对照组、双歧杆菌刺激组，以不同浓度的双歧杆菌106、107、108和109cells/L刺激细胞60 min,或以108cells/L的浓度刺激细胞不同时间(15、30、60、120和180 min)，分别收集细胞以提取总蛋白及核蛋白。用凝胶电泳迁移分析法（EMSA）测定NF-κB的结合活性；用Western印迹分析巨噬细胞胞浆内相应的IκBα蛋白表达。 结果： 双歧杆菌处理后，巨噬细胞 NF-κB向核内转移，结合活性明显增加，相应的IκBα表达降低。 结论： 双歧杆菌可以通过激活腹腔巨噬细胞核转录因子 NF-κB来发挥调作控用。     

镧抑制内毒素/脂多糖激活NF-κB信号通路的分子机制探讨

目的 分析镧调控内毒素/脂多糖(LPS)激活巨噬细胞核因子-κB(NF-κB)信号通路的分子机制.方法 体外培养RAW264.7小鼠巨噬细胞,随机分为:LaCl3 +LPS组、LPS对照组、LaCl3对照组和空白对照组.免疫细胞化学法分析p65蛋白核转位情况;分别提取细胞总蛋白或胞核胞质蛋白,ELISA法测胞核蛋白中p65蛋白与靶基因结合的活性;Western blot分析胞核蛋白中p65蛋白、胞质中核因子抑制蛋白α(IκBα)和磷酸化的核因子抑制蛋白α(p-IκBα)水平,及总蛋白IKK激酶的表达和磷酸化情况.结果 镧可阻断LPS诱导p65蛋白活化,如抑制其核转位、降低其在胞核中的表达并减弱其与靶基因结合活性.镧可抑制LPS诱导的IκBα降解,但LPS诱导IKKβ磷酸化不能为镧所阻断,且p-IKKβ磷酸化IκBα的能力亦未受到镧的影响.结论 镧可通过抑制LPS激活巨噬细胞IκBα蛋白降解、p65蛋白核易位及与靶基因结合,从而抑制LPS诱导NF-κB信号通路的活化,这可能是镧抑制LPS活化NF-κB通路分子机制之一.     

NF-κB在某些心血管疾病中的作用

核因子-κB(NF-κB)作为一种重要的转录因子在通常情况下对心肌细胞起保护作用,但在不同的刺激下,NF-κB表现出的作用不尽相同。NF-κB参与心血管疾病病理过程的多个环节,包括细胞生存、增殖和分化,调节细胞对各种刺激的反应,如低氧、压力和缺血等。NF-κB在众多心血管疾病如动脉粥样硬化、心肌缺血再灌注损伤、缺血预处理、心肌肥大和心力衰竭等的发生和发展中发挥重要作用。     

姜黄素通过上调miR-124抑制牙龈卟啉单胞菌LPS诱导的人牙龈成纤维细胞炎症反应

目的:探究姜黄素(Cur)对牙龈卟啉单胞菌(Pg)脂多糖(LPS)诱导的人牙龈成纤维细胞(HGFs)炎症反应及微小RNA-124(miR-124)的影响。方法:将HGFs分为对照(control)组、LPS组(10 mg/L LPS)及LPS+Cur(20、40和80μmol/L)组(10 mg/L LPS+对应剂量Cur)。各组处理24 h,CCK-8法检测细胞活力;ELISA检测上清液中炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平;RT-qPCR法检测细胞中miR-124的水平;Western blot检测胞浆和胞核中核因子κB(NF-κB)p-p65蛋白水平;激光共聚焦显微镜检测NF-κB p-p65蛋白的入核情况。转染mimic-NC和miR-124 mimic,检测细胞中miR-124及胞浆和胞核中NF-κB p-p65蛋白水平。结果:LPS组细胞活力、miR-124水平和胞浆NF-κB p-p65蛋白水平低于control组(P<0.05),上清液IL-1β和TNF-α水平及胞核NF-κB p-p65蛋白水平高于control组(P<...     

小檗碱对糖尿病大鼠血管平滑肌细胞增殖影响研究

目的:观察小檗碱(Berberine)对糖尿病大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖影响及对核因子-κB(NF-κB)的影响。方法:采用一次性腹腔注射链脲佐菌素55mg.kg-1诱发糖尿病大鼠模型,取建模成功大鼠胸主动脉中膜血管平滑肌细胞进行培养,倒置显微镜下观察细胞形态,SMA免疫组化染色鉴定细胞,计数法观察细胞的生长曲线,CCK-8法测定小檗碱IC50,共聚焦显微镜下观察小檗碱对VSMC中NF-κB核转移的影响。结果:与正常组对比,糖尿病组VSMC生长速度快,小檗碱能明显抑制糖尿病血管平滑肌细胞增殖,IC50为6.001±0.853μmol.L-1,而对正常大鼠VSMC增殖的IC50为18.229±0.434μmol.L-1(P<0.05)有剂量依赖性;小檗碱能抑制糖尿病VSMC中NF-κB从胞浆转移到胞核。结论:小檗碱呈剂量依赖性能抑制糖尿病VSMC增殖与NF-κB的核转移。揭示小檗碱可能有抑制糖尿病大血管病变作用,而此作用可能与抑制NF-κB激活有关。     

siRNA对小鼠血管内皮细胞NF-κB p65表达的抑制作用

探索RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术在抑制血管内皮细胞激活中的应用前景.利用阳离子脂质体LipofectamineTM000作为转染试剂将化学合成的小鼠NF-κB p65的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染人小鼠EOMA细胞,RT-PCR测定细胞内NF-κB p65 mRNA表达,Westem blot检测细胞内NF-κB p65蛋白水平.同时观察siRNA对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的NF-κB激活的抑制作用.结果显示在转染siRNA后的第24小时,细胞内NF-κB p65mRNA水平降低,蛋白表达量明显减少,而在第48小时、72小时细胞内NF-κB p65蛋白已经无法测出;在TNF-α刺激后,转染siRNA的细胞组内NF-κB p65的表达也明显受到抑制.说明RNAi技术可以抑制NF-κB p65的表达,为进一步研究血管内皮细胞的保护提供了有效的方法.