MDC、STxB与CVB3 VP1融合DNA疫苗的免疫效果比较

目的比较小鼠巨噬细胞源趋化因子（macrophage-derived chemokine,MDC）和志贺毒素B亚单位（Shiga toxin B subunit,STxB）与柯萨奇病毒B组3型（coxsackievirus B3,CVB3）VP1融合DNA疫苗的免疫效果。方法将120只雄性BALB／c小鼠分为6组,每组20只,分别肌内注射pcDNA3、pcDNA3／MDC、pcDNA3／STxB、pcDNA3／VP1、pcDNA3／MDC-VP1和pcDNA3／STxB-VP1,每3周1次,共3次,每次免疫后20d取血清,用微量中和试验检测CVB3中和抗体,第3次免疫后3周,每组取3只小鼠,取脾脏制备脾细胞,用CCK-8法检测特异性CTL杀伤活性,其余小鼠用10LD50的CVB3攻击,观察小鼠的生存情况。结果pcDNA3／VP1、pcDNA3／STxB-VP1和pcDNA3／MDC-VP1组均能诱导小鼠产生中和抗体;除pcDNA3／STxB-VP1组外,另两组抗体滴度随免疫次数增加而提高;第3次免疫后,pcDNA3／MDC-VP1组平均抗体滴度和脾淋巴细胞特异性CTL杀伤活性高于pcDNA3／VP1（P〈0．05）。病毒攻击后,pcDNA3／MDC-VP1组21d生存率高于其他各组（P〈0．05）。pcDNA3／STxB-VP1组抗体滴度和生存情况与pcDNA3／VP1组无明显差异。结论融合基因疫苗pcDNA3／MDC-VP1能诱导小鼠产生较强的体液和细胞免疫,提高了小鼠生存率,免疫效果优于pcDNA3／STxB-VP1。     

小鼠IFN-γ基因佐剂对分泌型柯萨奇病毒B3 VP1核酸疫苗免疫作用的影响

目的: 构建小鼠IFN-γ真核表达质粒,观察其对分泌型柯萨奇病毒B3(CVB3)核酸疫苗的影响. 方法: 以RT-PCR扩增小鼠IFN-γ基因,构建真核表达重组质粒pcDNA3/mIFN-γ,检测其在cos-7细胞内的表达;将分泌型pcDNA3/sVP1, pcDNA3/sVP1 pcDNA3/mIFN-γ肌注免疫小鼠,每2 wk注射1次,共3次,每次免疫后13 d取血测血清抗体水平. 末次免疫后2 wk,以500 TCID50的CVB3腹腔内感染,观察小鼠的存活情况. 结果: 成功构建了pcDNA3/mIFN-γ并能有效表达;pcDNA3/sVP1组和pcDNA3/sVP1 pcDNA3/mIFN-γ组均能诱导小鼠产生中和抗体,抗体滴度随免疫次数的增加而提高,但两组小鼠抗体滴度和生存率无显著性差异;混合质粒注射组血清的病毒滴度明显低于pcDNA3/sVP1组,且心肌病理损伤明显减轻. 结论: IFN-γ作为基因佐剂,在一定程度上增强了分泌型 CVB3 VP1基因疫苗的免疫保护作用.     

柯萨奇病毒B组3型VP1基因真核表达重组质粒的构建及免疫效果

目的构建柯萨奇病毒B组 3型 (CoxsackievirusesgroupB3,CVB3)VP1基因的真核表达重组质粒pcDNA3/VP1,并观察它对小鼠的免疫保护作用。方法从CVB3感染细胞中扩增出VP1片段 ,构建真核表达重组质粒 pcDNA3/VP1,经大量扩增纯化后 ,肌内注射免疫BALB/c小鼠 ,每次免疫后的第 6天 ,断尾取血检测CVB3中和抗体 ;3次免疫后用致死量 (10 0 0TCID50 )的CVB3感染小鼠 ,观察 pcDNA/VP1对小鼠的免疫保护作用。 结果pcDNA3/VP1重组质粒免疫小鼠后 ,能诱导机体产生中和抗体 ,各次免疫后抗体滴度分别为 <1∶5 ,1∶5 .7和1∶34.8;用致死量CVB3感染小鼠 ,pcDNA3/VP1重组质粒免疫组、pcDNA3质粒对照组及生理盐水对照组生存率分别为 30 %、2 0 %及 15 % ,3组小鼠生存率无明显差异 (P >0 .0 5 )。结论 pcDNA3/VP1重组质粒在小鼠体内能够表达并能诱导机体产生中和抗体 ,抗体滴度随免疫次数增加 ,但免疫小鼠对致死量的CVB3感染无明显保护作用     

GM-CSF表达质粒对pcDNA3/MDC-VP1 DNA疫苗的增强作用

目的:观察粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)对pcDNA3/MDC-VP1DNA疫苗免疫作用的影响,为柯萨奇病毒B组3型(CVB3)疫苗的研制提供理论和实验依据。方法:4～6周龄雄性BALB/c小鼠随机分成pcDNA3组、pcDNA3/MDC-VP1组、pcDNA3/mGM-CSF组、pcDNA3/MDC-VP1与pcDNA3/mGM-CSF混合注射组,每组10只。每3周接种1次,共3次。每次接种的第20天眼眶采血,用微量中和试验(固定病毒-稀释血清法)检测血清中和抗体效价。第3次免疫后3周,每组取3只小鼠脾脏制备淋巴细胞悬液,检测淋巴细胞增殖活性与特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性。结果:pcDNA3/MDC-VP1+pcDNA3/mGM-CSF组的血清中和抗体滴度明显提高,小鼠脾脏淋巴细胞增殖活性和特异性CTL杀伤活性均有增强。结论:GM-CSF可以增强pcDNA3/MDC-VP1DNA疫苗的特异性免疫应答。     

CVB3VP1与IL-2基因双表达重组质粒的构建及免疫效果

目的 探讨白细胞介素-2(intefleukin-2，IL-2)基因佐剂对柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3，CVB3)基因疫苗的免疫增强作用。方法 从CVB3VP1基因的重组质粒peDNA3／VP1上扩增出带有完整表达构件的VP1基因，克隆至pcDNA3／IL-2，构建成CVB3VP1基因和IL-2基因双表达质粒pcDNA3／VP1-IL-2，转化DH5a大肠杆菌。将peDNA3／VP1-IL-2、peDNA3／IL-2 peDNA3／VP1、pcD．NA3／VP1、peDNA3／IL-2、空白质粒peDNA3和生理盐水分别肌肉注射BALB／C小鼠，每周注射1次，共注射3次，每次注射后的第6天，断尾取血，用微量中和试验方法检测血清中和抗体；第3次注射后的第7天，用800TCID50CVB3感染小鼠，观察各组小鼠的生存情况。结果pcDNA3／VP1-IL-2、pcDNA3／IL-2 pcDNA3／VP1和pcDNA3／VP1组小鼠能产生中和抗体，抗体滴度随免疫次数增加而提高，pcDNA3／VP1-IL-2和pcDNA3／IL-2 pcDNA3／VP1组抗体水平高于同期pcDNA3／VP1组抗体水平，但各组小鼠的生存率无明显差异。结论IL-2基因单独或与VP1基因共表达对pcDNA3／VP1诱导抗体产生均有一定免疫增强作用。     

柯萨奇病毒B组3型VP1和IL-15双表达基因疫苗对小鼠的免疫效果

目的构建柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3,CVB3)VP1与白细胞介素-15(interleukin-15,IL-15)双表达基因疫苗,并观察其对小鼠的免疫效果.方法从CVB3 VP1基因的重组质粒pcDNA3/VP1上扩增出带有完整表达构件的VP1基因,克隆至IL-15基因重组质粒pcDNA3/IL-15,构建成双表达重组质粒pcDNA3/VP1-IL-15,转化DH5a大肠杆菌,大量扩增后,肌内注射Balb/c小鼠, 1次/周,共3次,每次免疫后第6天取血清,用微量中和试验方法检测血清中和抗体.第3次免疫后的第7天,用800TCID50 CVB3 感染小鼠,观察各组小鼠的生存情况.结果构建的pcDNA3/VP1-IL-15重组质粒目的基因与CVB3-VP1和IL-15的序列相同;免疫小鼠后pcDNA3/VP1-IL-15重组质粒能诱导机体产生中和抗体,抗体滴度随免疫次数增加而提高;病毒攻击后pcDNA3/VP1-IL-15和pcDNA3/VP1+pcDNA3/ IL-15组较其他组生存时间明显延长(P<0.05).结论本研究成功构建了pcDNA3/VP1-IL-15真核双表达重组质粒;该质粒能诱导机体产生中和抗体,对CVB3毒株的攻击有一定程度的保护作用.     

柯萨奇病毒B组3型VP1和IL-15双表达基因疫苗对小鼠的免疫效果

目的构建柯萨奇病毒B3(CoxsackievirusB3,CVB3)VP1与白细胞介素 15 (interleukin 15 ,IL 15 )双表达基因疫苗 ,并观察其对小鼠的免疫效果。方法从CVB3VP1基因的重组质粒 pcDNA3/VP1上扩增出带有完整表达构件的VP1基因 ,克隆至IL 15基因重组质粒 pcDNA3/IL 15 ,构建成双表达重组质粒 pcDNA3/VP1 IL 15 ,转化DH5a大肠杆菌 ,大量扩增后 ,肌内注射Balb/c小鼠 ,1次 /周 ,共 3次 ,每次免疫后第 6天取血清 ,用微量中和试验方法检测血清中和抗体。第 3次免疫后的第 7天 ,用 80 0TCID5 0CVB3感染小鼠 ,观察各组小鼠的生存情况。结果构建的 pcDNA3/VP1 IL 15重组质粒目的基因与CVB3 VP1和IL 15的序列相同 ;免疫小鼠后 pcDNA3/VP1 IL 15重组质粒能诱导机体产生中和抗体 ,抗体滴度随免疫次数增加而提高 ;病毒攻击后 pcDNA3/VP1 IL 15和 pcDNA3/VP1 pcDNA3/IL 15组较其他组生存时间明显延长 (P <0 .0 5 )。结论本研究成功构建了 pcDNA3/VP1 IL 15真核双表达重组质粒 ;该质粒能诱导机体产生中和抗体 ,对CVB3毒株的攻击有一定程度的保护作用。     

白细胞介素-2基因佐剂对柯萨奇病毒B3 VP1基因疫苗的免疫增强作用

目的探讨白细胞介素 2 (interleukin 2 ,IL 2 )基因佐剂对柯萨奇病毒B3(CoxsackievirusB3,CVB3)基因疫苗的免疫增强作用。方法将 pcDNA3/IL 2 pcDNA3/VP1、pcDNA3/VP1、pcDNA3/IL 2、空白质粒 pcDNA3和生理盐水分别肌内注射免疫BALB/C小鼠 ,1次 /周 ,共注射 3次 ,每次注射后的第 6天断尾取血 ,用微量中和试验方法检测血清中和抗体 ;第 3次注射后的第 7天用 80 0TCID50 CVB3感染小鼠 ,观察各组小鼠的生存情况。结果pcDNA3/IL 2 pcDNA3/VP1和 pcDNA3/VP1组小鼠能产生中和抗体 ,抗体滴度随免疫次数增加而提高 ,pcDNA3/IL 2 pcDNA3/VP1组抗体水平高于同期 pcDNA3/VP1组抗体水平 ,但各组小鼠的生存率无显著性差异(P >0 .0 5 )。结论IL 2基因佐剂对 pcDNA3/VP1诱导抗体产生有一定免疫增强作用。     

汉坦病毒H8205株G1-人源IL-2融合基因疫苗的免疫效应

目的探讨汉坦病毒H8205株G1-人源IL-2融合基因疫苗（pcDNA3．1／HisB-IL-2-G1）的免疫效应。方法将pcDNA3.1／HisB-IL-2-G1融合基因疫苗通过肌肉注射途径免疫BALB／c小鼠，每隔3周免疫1次，共免疫3次；酶联免疫法（ELISA）检测抗汉坦病毒（HTNV）抗体；空斑减少中和试验检测免疫血清中和抗体效价；淋巴细胞增殖试验（MTT法）检测免疫小鼠的细胞免疫反应；动物保护试验以BALB／c小鼠为感染动物模型，在第3次免疫后2周，腹腔内注射100TCID50（半数感染量）HTNV，然后以免疫荧光法观察鼠肾切片，评价其保护力。结果pcDNA3．1／HisB—IL—2—G1融合基因疫苗免疫后可刺激机体产生特异性抗体和中和抗体，中和效价为1：20～1：80。MTT法结果表明，免疫小鼠的脾淋巴细胞有特异性增殖反应。动物试验表明pcDNA3．1／HisB—IL—2—G1融合基因疫苗能保护小鼠免受HTNV感染。结论pcDNA3．1／HisB—IL—2—G1融合基因疫苗可诱导特异性体液免疫应答和较强的细胞免疫应答。     

柯萨奇病毒B组3型VP1基因真核表达重组质粒诱导小鼠中和抗体反应

以构建的柯萨奇病毒Ｂ 组３ 型（ＣＶＢ３）ＶＰ１ 基因的真核表达重组质粒ｐＣＥＰ４ＣＶＢ３ＶＰ１ 作为候选的基因疫苗,评价其诱导小鼠产生的中和抗体反应。大量制备并提纯ｐＣＥＰ４ＣＶＢ３ＶＰ１ ＤＮＡ,用其接种ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠,取血清进行病毒中和试验。结果证明其可诱导小鼠机体产生特异性中和抗体,并能中和ＣＶＢ３ 毒力,起到基因疫苗的预防作用。     

分子佐剂C3d增强人绒毛膜促性腺激素β基因避孕疫苗的免疫效应及转变免疫应答模式的研究

目的　研究分子佐剂C3d能否增强人绒毛膜促性腺激素 (hCG) βDNA疫苗的免疫原性 ,并转变Th1/Th2型免疫应答模式。方法　抽提纯化pcDNA3、pcDNA3 hCGβ、pcDNA3 hCGβ C3d3、pCMV4 hCGβ C3d34种质粒。将 12只 6周龄BALB/c雌性小鼠分为 12组 ,A1～ 3组各 6只以pcDNA3免疫 ,作为空白对照组 ;B1～ 3组各 6只以pcDNA3hCGβ免疫 ,作为阴性对照组 ;C1～ 3组各 6只以pcDNA3 hCGβ C3d3免疫 ,作为实验 1组 ;D1～ 3组各 5只以pCMV4 hCGβ C3d3免疫 ,作为实验 2组。免疫前 1周 ,于小鼠左后腿肌肉注射 0 2 5 %普鲁卡因 0 1ml。 1周后 ,在相同部位分别肌注前述 4种质粒 ,剂量分别为 :5pmol(A1～D1组 )、10pmol(A2～D2组 )、2 0pmol(A3～D3组 )。 3周后 ,再次给予相同剂量质粒加强免疫。于第 2次免疫后 3周 ,处死小鼠。用ELISA法测定外周血抗hCGβ抗体效价和经hCG抗原体外刺激脾细胞培养上清中Th1型 (IL 2、INF γ、TNF α) /Th2型 (IL 4、IL 10 )细胞因子分泌水平。结果　C3d分子佐剂能明显提高抗hCGβ抗体滴度。当免疫剂量为 2 0pmol时 ,与B3组比较 ,C3组抗hCG抗体最大效价达到 1∶4 5 0 ,提高了 9倍。D3组抗hCG抗体最大效价达到 1∶12 15 0 ,提高了 2 4 3倍。D3组与C3组相比较 ,抗hCG抗体水平提高了 2 7倍。受     

柯萨奇病毒B1/B3型二价VP1基因疫苗的构建及其免疫试验

目的 构建柯萨病毒（CV）B1／B3型二价VP1免疫质粒,并探讨其免疫原性。方法 通过逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术扩增CVB1的主要中和抗原VP1基因,将分别由CMV和SV40启动子控制的 CVB1和CVB 3的VP1基因反向串联插入到真核表达载体pCR3-Uni中。将该质料一转染鼠NIH3T3细胞,于转染后24、48、96h进行免疫荧光及RT－PCR检测,应用重组质粒免疫BALB／c小鼠,于免疫前、免疫后2 、4、6周分别断尾采血,用ELISA方法检测CVB特异性抗体。结果 获得了含有CVB1和CVB3的VP1南粒,RT－PCR及免疫荧光检测结果表明该质粒在NIH3T3细胞获得瞬时表达,小鼠免疫后4、6周均有特异性抗体产生。结论 本研究构建的CVB1／B3型二价VP1基因疫苗能诱导小鼠产生CVB特异性抗体,可以作为候选基因疫苗。     

新生鼠呼吸道感染CVB3致气道炎症的病理学观察

目的：观察病毒感染对气道炎症、肺炎形态学的影响以及持续的气道反应性增高,探讨病毒感染与呼喘的关系。方法：建立新生儿大鼠病毒感染模型,出生5d新生鼠超声雾化吸入柯萨奇病毒B3（CVB3）,接种后10d取血查CVB3－IgM;接种后10d,30d分别观察湿肺质量与鼠体质量比值（LW／BW）、气道肺病理学改变。结果：病毒组新生鼠血清中CVB3－IgM的D值均在对照组-/x 2s以上接种后10dLW/BW比值病毒组明显高于对照组（P＜0．01）。病理学检查：急性期炎症改变显;接种后30d仍有持续的形态学及细胞学改变。结论：新生鼠吸入CVB3模型成立,并有持续的气道炎症及肺形态学改变。     

丙型肝炎病毒多CTL表位DNA疫苗免疫学特性的初步研究

目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)疫苗研制并为抗HCV感染提供实验依据。方法:从HCV J株基因组中,选取小鼠(H-2d)CTL表位基因序列,以pcDNA3.1(+)质粒为载体,构建相应的真核表达质粒,经肌肉免疫后,取受免疫小鼠血清和脾细胞,用ELISA及MTT法检测小鼠血清中IL-2和IFN水平及小鼠脾细胞的增殖活性。结果:实验组小鼠血清中IL-2及IFN水平明显高于对照组[IL-2:(208±8.88)比(106±6.06);IFN:(179.5±2.52)比(90.5±2.52),P<0.05];实验组淋巴细胞增殖指数明显高于对照组(1.56比1.13,P<0.05)。结论:本实验构建的pcDNA3.1(+)/HCV CTL真核表达质粒,经肌肉免疫后可以使受免疫小鼠细胞免疫应答水平提高,淋巴细胞增殖活性增高。     

突变型与野生型HPV16 DNA疫苗的免疫原性

目的评价突变人乳头瘤病毒16(HPV16)E7锌指结合区后HPV16E7 DNA疫苗的免疫原性.方法将构建的野生型(pcDNA3.1/16E7)和突变型(pcDNA3.1/16ME7)DNA疫苗经肌肉免疫C57BL/6小鼠,分离脾单个核细胞,用E7特异性多肽刺激后,测定E7特异性白介素-2(IL-2)和干扰素-γ(IFN-γ)的水平及细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应.同时以未加E7多肽组作对照组.结果经E7特异性多肽刺激后,pcDNA3.1/16ME7产生IL-2的斑点数明显高于pcDNA3.1/16E7、pcDNA3.1和空白对照组.pcDNA3.1/16ME7的斑点数是pcDNA3.1/16E7的5倍多,两组间差异有显著性(P＜0.05);pcDNA3.1/16ME7产生的IFN-γ是pcDNA3.1/16E7的2倍,差异有显著性(P＜0.05);LDH结果显示在E:T为45:1时,pcDNA16/E7、pcDNA16/ME7、pcDNA3.1及未经免疫的小鼠4组之间CTL细胞杀伤率分别为(28.7±1.2)%、(55±2.2)%、(12.5 2.0)%和(11.5±1.2)%,前两组与后两组中任一组之间差异均有显著性,前2组之间差异亦有显著性(P＜0.05).而未加E7多肽组,各组间差异均无显著性(P＞0.05).结论突变HPV16E7锌指结合区能显著增强DNA疫苗的免疫原性,是提高DNA疫苗免疫原性的策略之一.