神经胶质瘤基因治疗中旁观者效应的动物试验

目的：探讨单纯疱疹病毒（ＨＳＶ）Ｉ型胸苷激酶（ＴＫ）基因逆转录病毒载体生长细胞（ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ）和更昔洛韦（ＧＣＶ）系统杀伤大鼠脑内神经胶质瘤细胞的旁观者效应。方法：用Ｃ６，Ｃ６ＸＳＮ，Ｃ６ＴＫ及不同比例的ＴＫ（＋）和ＴＫ（－）混合细胞接种于大鼠右侧额叶脑内，５ｄ后动物腹腔内注射ＧＣＶ溶液，剂量为１５ｍｇ／ｋｇ，每日２次，共１０ｄ。细胞接种后３周，所有动物处死，测量肿瘤大小，计算各组动物的     

疱疹病毒I型中国株胸苷激酶基因治疗脑瘤的临床前研究

目的验证胸苷激酶（ＴＫ）基因介导的羟甲基无环鸟苷（ＧＣＶ）系统对人脑恶性神经胶质瘤基因治疗的有效性及安全性。方法从中国疱疹病毒Ｉ型（ＨＳＶ－Ｉ）株（１７）中分离了胸苷激酶（ＴＫｃ）基因，并作了ＤＮＡ序列分析，组建了含ＴＫｃ基因的逆转录病毒重组载体（ｐＬＴＫｃＳＮ）及其含ｐＬＴＫｃＳＮ病毒的病毒生产细胞（ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ）。体外有效性试验：应用ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ与大鼠脑瘤Ｃ６细胞共培养后用ＧＣＶ处理。体内有效性试验：以ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ原位注入大鼠颅内移植的Ｃ６脑瘤。安全性试验：通过小鼠、大鼠和猴植入ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ并注射ＧＣＶ观察其毒副作用。结果ＨＳＶ－ＩＴＫｃ基因与ｐＯＰＦＨＳＶ－１ＴＫ基因比较有５个核苷酸和２个氨基酸的变异。ｐＬＴＫｃＳＮ及其ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ，在体内外能有效地介导ＧＣＶ对Ｃ６产生细胞毒作用。其病毒滴度为２×１０６ＣＦＵ／ｍｌ。经过４８只小鼠、２４只大鼠和６只猴体内未见严重毒副作用和不可逆的病理改变。结论疮疹病毒胸苷激酶基因治疗脑肿瘤是有效和安全的，通过药审后可用于临床试验。     

旁观者效应在HSV1—TK／GCV杀灭肺癌细胞A549中的作用

目的 研究旁观者效应在ＴＫ／ＧＣＶ系统杀灭肿瘤细胞中的作用。方法 转ＴＫ基因肺癌细胞Ａ５４９－ＴＫ与亲代细胞Ａ５４９分别以不同比例、高低密度混合培养,加５０μｍｏｌ／Ｌ ＧＣＶ作用５ｄ,ＭＴＴ法测活。结果 当细胞以高密度接种（１０＾４／孔）,ＴＫ＾＋细胞占２０％就能观察到较对照细胞出现明显的生长抑制（Ｐ〈０．０５）,而细胞以低密度接种（１０＾３／孔）,ＴＫ＾＋细胞占５０％出现较对照细胞明显地生长抑制（Ｐ〈０．０５）。结论 旁观者效应在ＴＫ／ＧＣＶ系统杀灭瘤中起重要作用,且这一效应与细胞间密切接触有关。     

表皮生长因子受体反义基因转染对人恶性胶质瘤细胞体外生长的影响

目的探讨表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）反义基因转染对人恶性胶质瘤细胞Ｕ８７ＭＧ体外生长的影响。方法构建ＥＧＦＲ反义基因表达载体，应用脂质体转染法将其导入Ｕ８７ＭＧ细胞；ＰＣＲ方法鉴定转染克隆；Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹杂交检测ＥＧＦＲ蛋白表达水平；通过绘制生长曲线和软琼脂集落形成实验测定反义ＥＧＦＲ基因对恶性胶质瘤细胞体外生长的抑制作用。结果转染反义ＥＧＦＲ基因的细胞克隆株ＡＳ１ＡＳ６的ＥＧＦＲ蛋白表达水平均有不同程度的降低；ＡＳ１ＡＳ６细胞体外生长明显减慢，ＡＳ１ＡＳ６细胞克隆形成率明显降低。表明Ｕ８７ＭＧ细胞体外生长速度和恶性转化能力均与ＥＧＦＲ表达呈正相关。结论反义ＥＧＦＲ基因转染可以明显抑制Ｕ８７ＭＧ细胞生长，ＥＧＦＲ对Ｕ８７ＭＧ细胞生长具有重要的调控作用     

人参皂甙与LAK细胞联合治疗恶性脑胶质瘤的实验研究

目的：探索提高恶性脑胶质瘤治疗效果的新途径。方法：用人参皂甙（Ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ,ＧＳ）与白细胞介素２（ＩＬ－２）协同诱导人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）制成ＧＣ－ＬＡＫ细胞,用ＭＴＴ法测定其对恶性脑胶质瘤细胞（ＢＴ３２５）的杀伤活性,并与ＬＡＫ细胞相比较;结果：效应细胞ＧＳ－ＬＡＫ在增殖数量和杀伤恶性脑胶质瘤细胞活性等方面均优于ＬＡＫ细胞,且ＩＬ－２用量减少;     

疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因和更昔洛韦系统对恶性胶质瘤患 …

目的 探讨疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因和更昔洛韦（ＨＳＶ－ＴＫ／ＧＣＶ）系统对恶性胶质瘤患者体液免疫和细胞免疫功能的影响。方法 对１２例恶性胶质瘤患者采用ＨＳＶ－ＴＫ／ＧＣＶ试验治疗。分别于治疗前、治疗过程中和治疗后采外周血和脑脊液,用流式细胞仪检测外周血Ｔ淋巴细胞亚群,用免疫比浊法测定血清和脑脊液免疫球蛋白的含量。结果：血ＣＤ４＾＋Ｔ细胞在治疗开始后２周显著升高;自然杀伤（ＮＫ）细胞在治疗过程中明显     

实验性IgA肾病足细胞的超微病变

研究ＩｇＡ肾病时肾小囊足细胞的病变。方法：用右旋糖酐诱发小鼠ＩＧａＪＣＥ ＵＧＭ 。ＸＦＪＳ：ＡＰＯ ＩＱ ＪＯ ＴＭＧ ＱＵＪ ＧＨ ＰＵＣＷＸＥＧ ＩＨ ＶＮＵＮＪＣＥ ＩＨ ＧＦＩＹＭＷ Ｅ ＪＳＤＭＯＵＧ ＵＤＹ ＱＫＵＭＴＪＴ ＷＧＫ ＴＲ ＩＰＭＮＴＫＷ ,ＴＥＰ ＴＭＤＦＪＮ ＱＵＪ ＧＨ ＢＭＧＭＧａＪＣＥ ＵＧＭ Ｒ ＭＡ     

一种快速筛选基因转染阳性细胞的标志基因-GFP

目的：寻求基因转移中快速检测转染阳性细胞的方法。方法：采用逆转录病毒介导的基因方法，将Ｉ型单纯疱疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶ－ＴＫ）基因、绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）基因及抗新霉素（ＮｅｏＲ）基因插入人外周血单个核细胞（ＰＢＭＮＣ），利用ＧＦＰ在细胞内的表达所产生的绿色荧光，经流式细胞仪测定基因转移效率。结果：被转染结胞以Ｔ淋巴细胞为主，占１１．３９％，而且被转化的Ｔ细胞中ＣＤ４阳性细胞转化率较高，占７．６１％，ＣＤ８，ＣＤ１９和ＣＤ３３阳性细胞转化率分别为２．９％，２．１％和４．７２％，ＰＣＲ鉴定表明转染的人外周血单个核细胞中含量有ＮｅｏＲ基因。结论：在基因转移中ＧＦＰ可作为一种标记基因，快速检测转染阳性细胞。     

长春新碱诱导人脑胶质瘤细胞的耐药性

本文报告以细胞周期特异化疗药长春新碱（ＶＣＲ）对人脑胶质瘤Ｕ２５１ＭＧ细胞进行体外分步诱导法造成细胞的耐药性。细胞集落实验表明，经ＶＣＲ诱导的胶质瘤细胞Ｕ２５１ＶＲ—４０在１０～４０ｎｇ／ｍＬＶＣＲ培养液中，其细胞形成相当率是未诱导组Ｕ２５１ＭＧ细胞的２～１３倍（Ｐ＜０．０１）。同时，耐ＶＣＲ的Ｕ２５１ＶＲ—４Ｑ细胞对阿霉素（ＡＤＭ）亦有交叉耐药性，但与卡氮芥（ＢＣＮＵ）无耐药性产生。另外，５ｕｇ／ｍＬ尼卡地平（ＮＣＤＰ）能使其反转成药敏细胞。诱导过程中还发现，Ｕ２５１ＭＧ胶质瘤细胞直接在高浓度ＶＣＲ（６０ｎｇ／ｍＬ培养液中被杀伤和发生明显形态变化后，仍有少数细胞在无化疗药培养环境７～１０天可以复苏并且再增殖。研究结果不仅表明ＶＣＲ诱导的胶质瘤细胞能够产生多药耐受性（ＭＤＲ），而且提示该胶质瘤细胞中可能还存在一种修复微管系统的抗药机理。     

表皮生长因子受体反义基因转染对人恶性胶质细胞体外生长的影响

目的 探讨表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）反义基因转染对人恶性胶质瘤细胞Ｕ８７ＭＧ体外生长的影响,方法 构建ＥＧＦＲ反义基因表达载体,应用脂质体转染法将其导入Ｕ８７ＭＧ细胞,ＰＣＲ方法鉴定转染单克隆,Ｗｅｓｔｅｍ印迹杂交检测ＥＧＦＲ蛋白表达水平。通过绘制生长曲线和软琼脂集落形成实验测定反义ＥＧＦＲ基因对恶性胶质瘤细胞体外生长的抑制作用,结果 转染反义ＥＧＦＲ基因的细胞克隆株ＡＳ１－ＡＳ６的ＥＧＦＲ蛋白     

哺乳动物性别决定基因的研究进展

目的了解哺乳动物性别决定基因的作用与功能。方法查阅本领域国内外文献并进行综述。结果SRY、SOX9、WT1、SF1、AMH及DAX1等基因都参与哺乳动物性别决定。结论性别决定基因的研究对性分化与发育异常等临床疾病的诊断和治疗具有十分重要的意义。     

Ｌｉｍｓ Ｅ：一个新的ＬＩＭ同源域基因的克隆和初步分析

目的:克隆与分析小鼠不同剪切的Lims基因.方法:应用巢式RT-PCR,以小鼠cDNA为模板,扩增Lims基因不同剪切子,构入PinPointTM Xa-1T质粒,测序鉴定.结果:测序表明克隆了新的Lims基因变异剪切体Lims E,该变异剪切体编码区为1 164 bp.编码387个氨基酸.结论:比较基因组学分析显示,成功地克隆了一新的小鼠Liras基因剪切子Lims E,为进一步研究Lims基因在细胞发育中的功能打下了基础.     

沙眼衣原体ompA基因克隆及其在真核细胞中的表达

目的克隆D型沙眼衣原体(Ct)ompA基因,构建真核表达重组质粒,转染真核细胞,为核酸疫苗的研制作准备.方法用PCR技术从D型Ct基因组DNA中扩增ompA基因片段,重组入pUCm-T克隆载体.将pUCm-T/ompA中的ompA外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体,进行序列分析和酶切鉴定后,运用脂质体将重组体pcDNA3.1/ompA转染HeLa细胞,免疫组化法观察目的的基因的表达.结果从D型Ct基因组DNA中扩增出特异的ompA基因片段;序列测定证实与GenBank登陆的D型Ct一致;重组质粒pcDNA3.1/ompA在HeLa中获得表达.结论Ct ompA基因能够在体外真核细胞表达,为进一步研究Ct致病机制及DNA疫苗的研究提供理论依据.     

Rh(-)献血者128例基因分型

目的：探讨Rh(-)献血者RhD基因分型的临床意义。方法：采用PCR－－SSP技术检测郑州市128例Rh（－）献血者的RhD基因结构，用氯仿／三氯甲烷法放散检测D^u检测，结果：RhD基因多态性存在3种基本形式，其中外显子完整存在32例（25．00％），全部为D^u型，完全缺失85例（66．41％），部分缺失11例（8．59％），其中2例为D^u型。结论：RhD基因的丰富多态性对于确保输血安全具有指导意义。     

穿梭质粒pZH32的构建

以pS189、pSV_2gpt、pMCi5为材料,构建了以EB病毒为基础,以酪氨酸tRNA琥珀突变校正基因SupF为靶基因,以黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因Eco gpt为选择标记基因的穿梭质粒pZH32。pZH32长9.4kb,克服了以SV40为基础的穿梭质粒自发突变率高以及宿主范围局限的缺点。SupF基因遗传背景清楚,长度126bp,便于进行序列分析。gpt基因使转化克隆的筛选更加方便。有利于建立一种化学诱变剂的分子检测系统,研究基因突变的类型和突变机制。     

人B7-1/Sart3融合基因的克隆和表达

目的：构建人共刺激分子CD80(B7-1)、T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(Sart3)融合基因真核表达载体，并分别在原核和人成纤维细胞中表达。方法：采用RT-PCR技术，从人胎盘组织抽提的总RNA中克隆Sart3基因的部分cDNA序列(第1～1281bp)．此段序列包括已报道的能诱导HLA限制性细胞毒性T淋巴细胞的抗原表位。然后将不含终止密码子的B7-1 cDNA和Sart3 cDNA共克隆入真核表达载体pEGFP-N1，测定核苷酸序列确定重组成功后，分别转染大肠杆菌和人成纤维细胞，利用流式细胞仪和Western blot检测B7和Sart3的表达。结果：构建人B7、Sart3融合基因真核表达载体B7sart3／pEGFPN。测序结果与GenBank的B7、Sart3相应序列(NM_005191、NM_014706)一致．阅读框无改变。流式细胞仪测定发现在转染的人成纤维细胞表面有明显的荧光增强．免疫印迹发现融合蛋白可以与抗B7抗体反应，融合蛋白分子量与B7-Sart3-EGFP的预测分子量相当。结论：成功构建真核表达载体B7Sart3／pEGFPN，并在人成纤维细胞中表达。为下一步研究将SART3蛋白作为肿瘤疫苗应用于骨肉瘤的生物治疗打下基础。     

GFP-pl6融合基因表达载体的构建

本文报道了以ＧＦＰ（绿色荧光蛋白）基因为报告基因，ｐｌ６基因为目的基因，将ｐｌ６基因分别插入ＧＦＰ基因的上游和下游，构建成ＧＦＰ－ｐｌ６融合基因表达载体ｐＣｐｌ６Ｇ和ｐＣＧｐ１６，并通过酶切、电泳技术对重组体进行了鉴定。该表达载体的构建成功为开展ｐｌ６转基因动物模型的建立及其特性研究奠定了基础     

慢性胃炎胃粘膜上皮细胞中bax、fas、p16基因的表达

目的:探讨bax、fas和p16在胃粘膜病变发生发展过程中的作用及意义.方法:应用免疫组织化学方法,检测慢性浅表性胃炎(CSG)和轻、中、重度慢性萎缩性胃炎(CAG)患者胃粘膜上皮细胞中bax、fas(促凋亡基因)和p16(增殖负调控基因)基因蛋白的表达情况.结果:CSG和轻、中、重度CAG胃粘膜中bax的表达率分别为41.75%、72.41%和78.26%,fas的表达率分别为39.81%、65.52%和78.26%,p16的表达率分别为9.71%、24.14%和30.43%.轻、中、重度CAG与CSG比较,bax、fas、p16的表达差异有显著性意义P<0.05～0.01.轻、中、重度CAG间比较,差异无显著性意义.结论:bax、fas和p16的高表达,使得细胞增殖/凋亡的比例失衡,在胃粘膜病变的发生发展中可能有重要意义.     

子宫肌瘤基因芯片的研究

基因芯片是一种能快速检测大量基因表达的分子生物学研究工具。子宫肌瘤基因芯片的研究发现,肌瘤中与细胞生长、增殖、凋亡、代谢、细胞运动性、血管发生、细胞外基质形成、细胞分化和免疫相关的基因表达发生了改变。文章综述子宫肌瘤基因芯片的研究进展,从分子水平探讨子宫肌瘤的发病机制。     

可诱导型真核表达载体的构建及其表达效率的测定

目的：利用ＭＴ－Ⅱ启动子的Ｚｎ＾２＋诱导表达特性,构建含多克隆位点的可诱导型真核表达载体ｐＭＤＮＡ３－ｎｅｏ,并用荧光素酶报告基因（ｌｕｃ）检测其表达效率。方法：用分子克隆方法构建载体,并将ｌｕｃ基因克隆到其多克隆位点内,转染胃癌细胞ＳＧＣ７９０１,Ｇ４１８筛选出稳定克隆,分别在不同浓度ＺｎＳＯ４级不同诱导时间下进行诱导表达和测定,并检测不同单细胞株的表达效率。