培养在壳聚糖-明胶膜片材料上人黑色素细胞的生物学特性初步研究

目的 研究培养在壳聚糖-明胶膜片材料上黑色素细胞的生物学特性.方法 取幼儿包皮,酶消化成单细胞悬液,接种后在黑色素细胞条件培养液中静置培养.黑色素细胞纯化、扩增后接种于壳聚糖-明胶膜片上.定期观察细胞形态变化及生长增殖情况,应用MTT测定、黑色素瘤抗体(Melan-A)免疫荧光染色、DOPA反应以判断黑色素细胞在壳聚糖-明胶膜片上的增殖及分化情况.结果 分离、纯化的黑色素细胞接种于壳聚糖-明胶膜片上生长良好,Melan-A免疫荧光染色及DOPA反应为阳性.结论 壳聚糖-明胶膜片是支持人黑色素细胞生长的良好材料,这一体系为色素脱失症的治疗提供了新的途径.     

利用聚羟基乙酸构建组织工程皮肤的实验研究

目的 以聚羟基乙酸(PGA)为培养支架，用组织工程方法在体外构建双层、有活性皮肤。方法应用酶消化法分别获取人成纤维细胞(FB)和表皮角质形成细胞(KC)，体外扩增培养。接种HF与PGA上1周后，在复合物表面接种KC，共培养1周将复合物置于气-液界面继续培养。于不同时间段取材。行组织学、超微结构及免疫组织化学检测。结果接种表皮角质形成细胞在“FB-PGA”复合物表面1周后可见2～3层连续的HK在复合物上生长良好；4周时PGA已部分降解，表皮分层分化较完善，抗involucrin染色阳性，透射电镜观察可见表皮细胞分层分化良好。细胞的相邻面有桥粒连接。结论 采用组织工程技术可以在体外构建双层、有活性的人工皮肤；组织工程皮肤具有和正常皮肤相似的组织学特征及生化成分。     

人表皮干细胞的体外分离培养和鉴定

目的:探讨人表皮干细胞的体外快速分离培养及鉴定方法。方法:中性蛋白酶和胰蛋白酶两步法从手术切除的人包皮组织中分离表皮层和真皮层,并获得表皮单细胞悬液,采用Ⅳ型胶原铺板选择性粘附、分离和角质形成细胞无血清培养基(K-SFM)培养表皮干细胞。倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况,检测细胞克隆形成率,免疫组化染色观察表皮干细胞标志物β1整合素和角蛋白19(K19)的表达;以角质形成细胞作为对照。结果:组织学观察显示,培养24h后细胞呈克隆状生长;所分离、培养细胞的克隆形成率高于对照角质形成细胞组;免疫组化染色显示,培养细胞β1整合素及Kl9均呈阳性表达。结论:运用Ⅳ型胶原粘附结合K-SFM培养可以实现人表皮干细胞的体外快速分离和培养。     

表皮细胞、成纤维细胞和几丁质-胶原蛋白复合人工皮的体外构建

目的 探讨几丁质—胶原蛋白膜作为表皮细胞、成纤维细胞培养支架的可能性，体外构建包含双层细胞的复合皮。方法 取健康成人环切包皮，分离成纤维细胞、表皮细胞，分别制成单细胞悬液，将几丁质-胶原蛋白膜(有孔面向上)平铺于60mm培养皿中，首先接种成纤维细胞，培养2d后，将含10％小牛血清的DMEM更换成完全型DMEM，翻转膜，使光滑面朝上，再种植表皮细胞，每日换液。定期观察细胞与材料的粘附、细胞贴壁及其生长增殖情况。结果 几丁质—胶原蛋白膜对成纤维细胞、表皮细胞无明显毒性作用，成纤维细胞培养1d后，细胞贴附于材料支架，细胞胞体较大，呈典型的梭形。加入表皮细胞复合培养2d示表皮细胞贴壁生长，并分化、增殖。复合皮构建2周，网格支架及孔内均有大量细胞生长，膜表面细胞融合成片，表皮细胞分化形成复层。结论 几丁质—胶原蛋白膜对细胞无毒性，有利于培养细胞的粘附、生长。在体外可以构建成功类似生理性皮肤的人工皮肤。     

构建含黑色素细胞组织工程皮肤的研究

目的 探讨运用组织工程方法构建含有黑色素细胞的组织工程皮肤。方法 以包皮组织作为细胞来源，采用消化法获得角朊细胞、成纤维细胞和黑色素细胞，在自行设计的组织工程皮肤培养系统构建组织工程皮肤。行Dopa染色、透射电镜和S-100免疫组织化学检测构建的皮肤中黑色素细胞的分布和状态。结果 构建的组织工程皮肤结构完整，细胞状态良好，Dopa染色、透射电镜和S-100免疫组织化学检测均显示含有大量黑色素细胞并处于良好状态。结论 构建了含黑色素细胞的组织工程皮肤，可用于下一步的动物实验和临床实验。     

荷载角质细胞生长因子纳米微囊组织工程皮肤修复裸鼠皮肤缺损

目的 研究荷载角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor,KGF)纳米微囊的新型组织工程皮肤对裸鼠皮肤缺损的修复效果及特点.方法 采用超声乳化一溶剂挥发法及低温干燥法,制备KGF纳米微囊,并构建KGF-脱细胞真皮基质(acellular dermal matrix,ADM);分离培养和鉴定人表皮干细胞群和成纤维细胞;接种表皮干细胞群于KGF-ADM之上,观察其生长情况;将荷载KGF纳米微囊的组织工程皮肤移植于裸鼠皮肤缺损处,以无KGF纳米微囊的组织工程皮肤为空白组,以其自体皮肤移植作对照组.于术后2,6周时分别观察修复区组织学愈合及皮片挛缩情况,并应用抗人角蛋白10及β1-整合素免疫荧光检测修复区表皮和真皮层细胞来源、分化及生长情况.结果 表皮干细胞群在KGF-ADM表面生长良好,粘贴紧密,可见到多角形的终末表皮细胞及小圆形的表皮干细胞,活性良好,有连接成片的趋势,部分形成克隆团块.以荷载KGF纳米微囊组织工程皮肤修复裸鼠皮肤缺损,2、6周时修复效果均优于空白组及对照组,移植的组织工程皮肤边缘可与邻近皮肤完全融合,但存在一定的挛缩.镜下可见修复区组织工程皮肤表皮细胞分层良好,与ADM紧密结合,能产生正常角质层.6周时实验组修复区组织工程皮肤切片免疫荧光检测,基底层仍存有少量β1-整合素阳性的表皮干细胞或短暂扩充细胞.结论 所构建的荷载KGF纳米微囊组织工程皮肤修复裸鼠皮肤缺损的效果,优于无KGF纳米微囊的普通组织工程皮肤及裸鼠自体全厚皮片移植修复效果.     

组织工程皮肤种子细胞的同期快速分离

目的 寻找一种快速可行的同期分离组织工程皮肤种子细胞——表皮细胞及成纤维细胞的方法。方法 取手术切除包皮，利用Ⅰ型胶原酶结合胰蛋白酶消化法，同期分离表皮细胞及成纤维细胞，观察细胞形态。对表皮细胞及表皮干细胞行PAN—FITC、K19-FITC荧光免疫染色及K19流式细胞仪鉴定；对成纤维细胞行波形蛋白FITC免疫荧光鉴定。并分别对两种细胞培养7d，观察其生长情况。结果 应用Ⅰ型胶原酶结合胰蛋白酶，在3h内快速分离得到表皮细胞及成纤维细胞，免疫荧光染色表皮细胞PAN—FITC染色均为阳性、K19-FITC染色部分阳性，流式细胞仪鉴定其K19阳性表达的细胞接近17％。表皮细胞培养48h开始呈克隆样增长，至7d生长停滞，向终末的角细胞分化。成纤维细胞体外培养7d可扩增100倍，波形蛋白FITC免疫荧光染色呈阳性。结论 利用胶原酶结合胰蛋白酶消化法可在3h内同期分离到用于构建复合型组织工程皮肤的种子细胞，为复合组织工程皮肤的快速构建提供了可能。     

高钙培养对表皮角质细胞形态和生长特点及角蛋白表达的影响

目的：观察高钙培养后表皮角质细胞的形态、生长特点及角蛋白表达的变化，进一步探讨钙在促进表皮角质细胞分化过程中的重要作用。方法：表皮角质细胞分别在低钙（0.05mmol/L）和高钙（1.2mmol/L）环境条件下培养1-2d，光镜下观察细胞的形态和生长特点，并采用免疫组织化学方法检测表皮角质细胞中角蛋白10（K10）、K14和K19的表达水平。结果：低钙培养的表皮角质细胞散在生长，分布均匀，细胞间隙较大，胞膜圆滑，边界清楚。高钙培养后，细胞胞体变得扁平，细胞间隙消失，并且细胞出现明显的成簇生长趋势。在正常培养即低钙培养条件下，K10和K19阳性细胞比例较少，所培养的细胞几乎全为K14阳性细胞；在高钙培养条件下，K10和K19阳性细胞比例明显增加，而K14的表达没有明显变化。结论：高钙培养能改变表皮角质细胞的形态和生长特点并提高细胞内角蛋白的表达水平，从而促进表皮角质细胞的分化成熟。     

有颜色的含黑素细胞表皮替代物构建和对UVA照射的反应

目的：体外构建不同颜色的含黑素细胞表皮，检验其作为研究色素形成和光防护新模型的可行性。方法：把角质形成细胞和黑素细胞混合培养，消化后和胶原凝胶复合，接种于已经凝固的胶原凝胶支架上，置于37℃，凝胶凝固后形成一个含黑素细胞的表皮替代物。两天后移至气液面培养，观察所制表皮的颜色变化。多巴染色检测该表皮替代物结构和黑素细胞定位。用UVA照射所制表皮，观察有无颜色改变。结果：含黑素细胞的组织工程表皮在气液面上培养一周左右出现黄褐色或棕褐色，细胞浓度越高，颜色越深。构建的表皮类似正常表皮呈三维结构，在基底部可见散在分布的黑素细胞，多巴染色阳性；有的角质形成细胞核上方有黑素帽结构。构建的表皮经UVA照射后可出现色素沉着。结论：已经成功构建含黑素细胞的表皮替代物，随细胞数量和培养时间能呈现出不同深浅的黄褐色，可以作为研究色素形成和光防护的体外模型。     

以活性复合真皮基质为载体构建组织工程皮肤的研究

目的 构建含活性真皮基质的组织工程皮肤. 方法将人成纤维细胞(Fb)与Ⅰ型牛胶原混合接种于猪脱细胞真皮基质(PADM)的表面,构建活性真皮替代物.其上接种人表皮细胞进行气-液面培养,获得组织工程皮肤,进行组织学观察. 结果 Fb在胶原内结构完整,与PADM形成复合真皮基质.所构建的组织工程皮肤表皮层结构与人正常皮肤相似,具备基底层、棘层、颗粒层和角质层,细胞之间有桥粒连接,细胞分化良好. 结论 Fb-胶原-PADM真皮替代物可作为较好的构建组织工程皮肤的真皮支架.     

胫骨干骨折的手术治疗对策

目的：明确不同固定器械在胫骨干不同骨折类型固定中的特点，以指导临床应用。方法：68例胫骨干骨折，行加压钢板螺钉、交锁髓内钉、单侧外固定架固定后，作临床疗效分析。结果：加压钢板固定组42例，感染5例，骨不连1例，平均愈合时间3．8个月；交锁髓内钉固定组13例，无感染及骨不连，平均愈合时间5．4个月；单侧外固定架组13例，骨不连1例，踝关节背伸受限3例，平均愈合时间4．5个月。结论：胫骨骨折交锁髓内钉固定并发症少，功能恢复好，适用范围广，但要注意及时进行动力加压。加压钢板及外固定架固定应选择各自的最佳适应证，以达到理想的疗效。     

不同方法重建指尖离断静脉回流的疗效分析

目的：探讨不同方法重建指尖离断静脉回流的疗效。方法：2008年3月-2013年2月收治指尖离断患者80例,38例吻合指侧方静脉重建回流,术中吻合动静脉比例1：1或1：2或2：2,平均1：2;22例吻合指腹静脉重建回流,术中吻合动静脉比例1：1;20例未吻合静脉,术中仅吻合1条动脉,行侧切口或甲床放血。观察各组治疗效果。结果：吻合指侧方静脉组手指全部成活,无一例发生回流障碍;吻合指腹静脉组19例发生静脉危象,其中4例手指坏死;未吻合静脉组20例均发生回流障碍,其中6例手指坏死。58例获随访,随访时间6~28个月。吻合指侧方静脉组32例,指尖外形佳、指腹饱满;吻合指腹静脉组14例,指体轻度萎缩,指甲生长不平整;未吻合静脉组12例,指体萎缩明显。吻合指侧方静脉组指甲生长近平整,长度长于其他两组[（14.4±3.2）mm比（12.5±2.3）mm和（12.2±2.2）mm],远侧指间关节活动度大于其他两组[（63±5）°比（48±3）°和（45±7）°],两点分辨觉小于其他两组[（4.6±0.4）mm比（7.1±1.2）mm和（7.3±0.6）mm],感觉级别高于其他两组[S（3.45±0.39）级比S（2.57±0.42）级和S（2.55±0.49）级],差异均具有显著性（P〈0.05）。吻合指腹静脉组和未吻合静脉组在指甲长度、运动和感觉方面差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：吻合指侧方静脉能有效解决指尖再植静脉回流问题,可避免回流障碍,成活率高,促进指甲生长,可恢复 DIPJ 活动度及感觉。     

膝关节后交叉韧带断裂治疗临床分析

目的 对35例膝关节后交叉韧带断裂治疗进行临床分析,重点探讨了有关交叉韧带断裂的治疗问题。方法 经明确诊断后,分析采用胫骨附着处撕脱骨折复位固定手术治疗26例、早期髌韧带中1／3移植重建3例、单纯长腿石膏固定6例。结果 本组病例全部进行随访,随访时间13个月－5年,胫骨附着处撕脱骨折复位固定及髋韧带中1／3移植重建29例为优良、单纯长腿石膏固定6例为差。结论 后交叉韧带断裂后应该及时给予手术修复;膝后外侧手术入路,操作简单,暴露充分;少于3个月的陈旧性病例仍适应手术治疗。